Armónica Nanopartículas para Regenerativa de Investigación

Resumen

Detalles del Protocolo se proporcionan para etiquetado células embrionarias humanas in vitro madre con segunda nanopartículas que generan armónicos. También se presentan metodologías para la investigación de células madre mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacas.

Resumen

En este experimento se visualizó, detalles del protocolo se proporcionan para marcaje in vitro de las células madre embrionarias humanas (CMEH) con nanopartículas de generación de armónicos segundo (HNPs). Estos últimos son una nueva familia de sondas introducidas recientemente para el etiquetado de las muestras biológicas para imágenes multi-fotón. HNPs son capaces de duplicar la frecuencia de la luz de excitación por el proceso óptico no lineal de generación de segundo armónico sin restricciones en la longitud de onda de excitación.

Multi-fotón metodologías para la diferenciación de células madre en grupos cardíacos (mantenidas como cultivos al aire líquido a largo plazo) en base se presentan en detalle. En particular, se muestra evidencia sobre cómo aprovechar al máximo el segundo armónico (SH) de emisión intensa de HNPs aisladas durante el control 3D de golpear el tejido cardíaco en 3D. El análisis de las imágenes resultantes para recuperar los patrones de desplazamiento en 3D también se detalla.

Introducción

Sistemas de microscopía no lineal, gracias a sus tres capacidades de seccionamiento dimensionales inherentes, han provocado cada vez más la demanda de fluoróforos foto-estable con bandas de absorción de dos fotones del infrarrojo cercano. Sólo en el último par de años, para complementar el desarrollo de etiquetas basadas en la fluorescencia (colorantes, puntos cuánticos, up-conversión de nanopartículas), una metodología diferente de imágenes ha estado explotando el uso de una nueva familia de nanopartículas inherentemente no lineales como etiquetas, es decir, nanopartículas de armónicos (HNPs) que se han desarrollado específicamente para la microscopía de múltiples fotones. Estas etiquetas, basadas en cristales noncentrosymmetric inorgánicos, ejercen contraste óptico que genera el SH de la frecuencia de excitación, por ejemplo mediante la conversión de una fracción de la luz cercana al infrarrojo excitación pulsada (λ = 800 nm) en luz azul visible (λ / 2 = 400 nm) . Varios autores en los últimos años han probado diferentes materiales, incluyendo yodato de hierro Fe (IO _{3) 3 ^1, niobato de potasio (KNbO 3) ^2, niobato de litio (LiNbO 3) ^3, titanato de bario (BaTiO3) ^4,5, fosfato de potasio titanilo (KTiOPO4, KTP) ^6-8, y óxido de zinc (ZnO ) ^5,9,10. En comparación con las sondas fluorescentes, HNPs poseen una serie de propiedades atractivas, tales como la ausencia completa de blanqueo y parpadear, bandas de emisión estrechas, capacidad de ajuste de excitación de longitud de onda (desde el ultravioleta al infrarrojo), la capacidad de recuperación de la orientación, y la respuesta óptica coherente. Estas propiedades únicas se han explicado recientemente en dos artículos de revisión exhaustivos ^11,12. La posibilidad de trabajar en la región espectral infrarroja, que aumenta la profundidad de formación de imágenes, reduciendo al mínimo la dispersión y absorción, también limita drásticamente la degradación foto de la muestra ^13,14. Por otra parte, la señal de la foto estables infinitamente garantizada por HNPs los convierte en ideales para las sondas de rastreo celular a largo plazo, que is especialmente atractivo para aplicaciones de medicina regenerativa ^15.}

En este experimento se visualizó, detalles del protocolo se proporcionan para marcaje in vitro de las células madre embrionarias humanas (CMEH) con HNPs no funcionalizados. La síntesis y preparación de suspensiones coloidales se detalla en una publicación anterior, y en las referencias allí ¹⁶ y está más allá del alcance de este trabajo. Se presentan metodologías para la investigación de células madre mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacos (mantenidas como cultivos al aire líquido a largo plazo). ESC humana se puede dejar para diferenciar dentro de los llamados cuerpos embrioides (EBS) en dos formas diferentes, ya sea por la formación de EB de fragmentos de colonias en suspensión o, alternativamente, la agregación de células individuales en EBS utilizando la placa de Aggrewell forzados, como se ilustra en la Figura 1A . El cultivo de vencer a grupos de células cardiacas en politetrafluoroetileno (PTFE) filtros porosos FACilitates su mantenimiento a largo plazo para estudios posteriores (por ejemplo, las mediciones electrofisiológicas de los potenciales de acción).

La fuente de excitación de la microscopio de barrido debe ser capaz de entregar pulsos ultracortos (con una duración de pulso menor que 300 fs a la muestra) a fin de alcanzar la potencia de pico necesaria para realizar la imagen con segundo armónico de HNPs. Por ejemplo, el fs-fuente más común utilizado para la formación de imágenes son sintonizables Ti: láseres de zafiro. Alternativamente, otros láseres ultrarrápidos pueden emplearse, por ejemplo iones de erbio ^17, forsterita cromo ¹⁸ o Ti: zafiro bombeado infrarrojos osciladores paramétricos ópticos. El microscopio puede estar equipado con un objetivo con una apertura numérica preferentemente bastante alto. Muy importante, antes de las medidas, y cada vez que el objetivo se sustituye, es obligatorio para reducir al mínimo la dispersión presente en el set-up (lentes) mediante la optimización de la configuración de la pulso de láser pre-compresor en el trabajolongitud de onda de la elección. Este procedimiento, se detalla en el protocolo, se asegura de que el pulso de láser es tan cerca como sea posible a la transformación duración limitada (es decir, más corta como sea posible) en el plano focal y maximiza la respuesta de muestra no lineal.

El objetivo del análisis de la imagen se describe al final del protocolo es identificar y realizar un seguimiento de los movimientos en 3D HNPs asociados con las contracciones rítmicas de vencer grupos cardíacas. Nanopartículas de seguimiento en el plano de la imagen es simplemente dieron cuenta mediante la identificación de sus posiciones en los sucesivos fotogramas de película. Para extraer información sobre el movimiento axial, una calibración previa de la respuesta no lineal de intensidad como una función del desplazamiento axial es obligatorio. Tenga en cuenta que para las mediciones a largo plazo, un control interferométrico activa de la posición axial de la muestra se requiere para mantener la validez de la curva de calibración, en presencia de derivas térmicas y / o mecánicos.

Los HNPs utilizados aquí para traccélulas e latiendo dentro de los agregados están basados ​​en óxido de niobato de potasio (KNbO _3), pero otros nanomateriales no lineales disponibles son revisados ​​en detalle en la obra de Staedler et al ^16.

Las eficiencias ópticas no lineales de la mayoría de los nanomateriales investigadas hasta ahora son muy comparables. La elección de KNbO ₃ fue motivado esencialmente por la buena estabilidad de la solución coloidal y su buena biocompatibilidad, probado en varias líneas celulares humanas incluso en concentración bastante alta y tiempos de exposición largos ^16.

Dada la novedad del nanomaterial empleado para este trabajo, las principales características de HNPs en comparación con / luminiscentes bio-marcadores fluorescentes se muestran en un vídeo de animación de ordenador original corto realizado por los autores.

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Protocolo

1. Cultura y Ampliación de ESC Humano

1. Preparar el medio de propagación de células (llamado PM) que contiene Knockout DMEM suplementado con 20% suero Knockout, 1% MEM ácidos no esencial amino, 1% de L-glutamina 200 mM, 1% de penicilina-estreptomicina, y 3,5 l β-mercaptoetanol.
2. Descongelar ESC humana (células madre) en 8 ml de medio PM y los centrifugar 5 min a 115 xg para descartar medio de congelación DMSO-complementado.
3. Añadir 1 ml de PM medio que contiene 10 mM de inhibidor de la roca para evitar la apoptosis y mejorar la supervivencia celular tras la descongelación (sólo 24 h de incubación).
4. Añadir el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) a la PM en la concentración deseada (4-10 ng / ml) para el mantenimiento de la pluripotencia.
5. Placa del hESC en humano irradiado prepucio células alimentadoras (γHFF) (Figura 1A), previamente se sembraron a una concentración de 2 x 10 ⁴ células / cm ^2.
6. Cambie medio diario y, cuando sea necesario, eliminar partes de colonies empezando a diferenciarse por aspiración mediante un reducido drásticamente pipeta Pasteur alargada.
7. Una vez a la semana, las colonias de paso por vía enzimática:
   1. Retire medio y lavar las colonias con 2 ml de PBS.
   2. Retirar PBS y se incuban con 0,5 ml por pocillo de la colagenasa IV caliente a 1 mg / ml durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   3. Recoge fragmentos de colonias en 2 ml nuevo PM y centrifugar a 115 xg durante 3 min.
8. Alternativamente, las colonias pueden ser pasados ​​mecánicamente por raspado:
   1. Retire medio y lavar las colonias con 2 ml de PBS.
   2. Raspar manualmente colonias utilizando la herramienta rascador rodillo StemPro EZPassage (Figura 1B).
   3. Recoger fragmentos de colonias y centrifugar a continuación durante 3 minutos a 115 xg para eliminar el sobrenadante.
   4. Fragmentos de placas de γHFF o a procesar para la diferenciación en cuerpos embrionarios (EBS).

2. Diferenciación ESC HumanoProtocolo

1. Preparar el medio de diferenciación (DM) utilizando Knockout DMEM suplementado con 2% de suero Hyclone, 1,0% MEM ácidos no esencial amino, 1,0% de L-glutamina 200 mM, 1% de penicilina-estreptomicina, 3,5 l β-mercaptoetanol.
2. Retire medio y lavar las colonias con 2 ml de PBS.
3. EB formación de fragmentos de colonias en suspensión:
   1. Retirar PBS y se incuban con 0,5 ml por pocillo de la colagenasa IV caliente a 1 mg / ml durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   2. Recoge fragmentos de colonias en 2 ml nueva DM y centrifugar a 115 xg durante 3 min.
   3. Cultura en suspensión en ultra bajo apego placas de 6 pocillos (2 ml por pocillo) durante 4 días (Figura 1C).
   4. Recoger y placa EBS recién formadas en 0,1% gelatina revestido placas de 24 pocillos (aproximadamente 3 EB / pocillo) (Figura 1D).
4. Alternativamente, la agregación de células individuales forzado a EBS utilizando la placa de Aggrewell:
   1. Retirar PBS ydisociar colonias en células individuales utilizando Accutase (0,5 ml / pocillo).
   2. Centrífuga y volver a suspender las células en DM a 1,2 x 10 ⁶ / ml.
   3. Añadir 2 ml por cámara Aggrewell por 1 días (Figura 1B ').
   4. Recoger EBS recién formados (Figura 1C ') y la placa de ellas en 0,1% gelatina revestido placas de 24 pocillos (aproximadamente 3 EB / pocillo).
   5. Cambie DM cada 2-3 días hasta la aparición de vencer a los grupos de los cardiomiocitos (15-30 días).

3. Aire-líquido Culturas 3D de Vencer Clusters y etiquetado con HNPs

1. Identificar y analizar manualmente los racimos de batiendo cardiomiocitos (Figura 1D), normalmente aparece después de 2-4 semanas de cultivo, utilizando un reducido drásticamente pipeta Pasteur alargada.
2. Depósito 4 filtros de PTFE por plaquita que se pondrán en una placa de 6 pocillos (Figura 1F).
3. Añadir 1 ml de medio de DM en la parte superior de each también.
4. Añadir un racimo diseccionado batiendo en cada filtro PTFE (Figura 1 E), máximo 4/well, es decir, 24 agregados por placa (Figura 1 F ').
5. Cambie medio DM cada 2-3 días.
6. Para etiquetar los clusters, retire el filtro de PTFE que contiene el cluster paliza y lo puso en 3,5 cm plato de vidrio inferior (170 m de espesor).
7. Añadir 1 ml de PNH a una concentración de 50 mg / ml para 30 min.

4. Optico y no lineal

1. Preparación de la muestra. Después del marcaje HNP (ver Paso 3.6), traslado, ya sea enteros diferenciadores HEBS primeros o clusters paliza cardiaca (disecados en apariencia contracción) en los filtros de PTFE sobre una gruesa placa de 170 m con fondo de cristal compatible con la distancia de trabajo de altos objetivos numéricos de apertura. Por otra parte, aplicar un recubrimiento directo de vencer grupos para el plato de fondo de vidrio recubierto previamente con 0,1% de gelatina.
2. Transferir las muestras a untodo-en-uno microscopio equipado con incubando cámara de garantizar una temperatura estable, humedad y CO de control ₂ durante períodos de tiempo prolongados.
3. Después de la inspección inicial, la imagen de la muestra a través de imágenes de campo amplio con iluminación de luz blanca para identificar estructuras de interés dentro de EBS diferenciados o clusters paliza activos que serán seleccionados para futuras investigaciones.
4. Si la autofluorescencia celular desde el NADH y SH de HNPs tienen que ser adquirida de forma simultánea, establecer una longitud de onda de excitación de láser más corto (es decir, 720 nm) para que coincida con la absorción molecular. Utilice un filtro de paso de banda espectral estrecha centrada en la mitad de la longitud de onda de excitación (es decir, λ = 360 ± 10 nm) para detectar SH, y otro para la detección de la autofluorescencia.
5. En primer lugar realizar una baja resolución rápida, escaneo tridimensional para reconstruir la morfología general de la agrupación cardiaca y seleccione un plano de imagen dentro del volumen de cluster con varios HNP visibles.
6. Si es necesario, cambie la longitud de onda de excitación libremente para adaptarse mejor a las propiedades ópticas de la muestra o para evitar photobleaching, el daño por luz y la imagen más profunda en los tejidos con una longitud de onda de infrarrojos (es decir, 790 nm) y vuelva a colocar el segundo filtro de armónicos en consecuencia (es decir, 395 nm ). Optimizar los ajustes del pulso de láser de pre-compresor a la longitud de onda de trabajo de elección mediante la maximización de la segunda señal armónica de HNPs depositados en la muestra.
7. Para controlar en tiempo real las contracciones cardíacas de racimo, establecer el escáner óptico microscopio en el modo más rápido, tales como modo de resonancia, lo que permite la adquisición de alta velocidad de imágenes de dos dimensiones.
8. Elija los ajustes que mejor compromiso entre el contraste de la imagen y la velocidad de adquisición, tales como:
   • Promediado Scan: 4
   • Píxel tiempo de espera: 0,1 microsegundos
   • Tasa de imagen: 3,75 fotogramas por segundo (fps)
9. Potencia del láser se ajusta de acuerdo a la mancha focal sIze y velocidad de exploración. 50 mW (medido en la entrada del objetivo) es un valor típico para 0,1 microsegundos píxel tiempo de permanencia y el Plan de APO 20X NA 0,75 objetivo preservar la viabilidad celular.

5. Análisis de Imágenes

1. Procedimiento de calibración Axial. Seleccione un solo HNP depositado sobre un sustrato desnudo. Ajuste el enfoque (es decir, la posición axial de la nanopartícula) para maximizar la intensidad SH. Varían de forma controlada la posición axial de la platina del microscopio para obtener la curva de calibración correspondiente a la intensidad de SH como una función de la PNH desplazamiento desde el plano focal. La salida de este procedimiento de calibración para el Plan de APO 20X NA 0,75 objetivo se informó en la Figura 4C.
2. Seleccione HNPs presentes en todos los fotogramas de vídeo y determinar sus movimientos periódicos. Este procedimiento puede automatizarse fácilmente, por ejemplo mediante un código personalizado en busca de manchas máxima de la señal de intensidad en una región de interés definida yconectándolos entre diferentes marcos (un código de ejemplo escrito en Matlab R2009 b utilizando la función 'props' región de la caja de herramientas de procesamiento de imágenes se presenta).
3. Evaluar la cuantificación de los desplazamientos fuera del plano, asociados con HNPs no trazables continuamente en movimiento a lo largo del eje óptico, mediante la conversión de sus modulaciones de intensidad a lo largo de diferentes marcos en desplazamiento axial usando la curva de calibración establecida en el paso 5.1. Tenga en cuenta que este procedimiento da acceso a movimientos axiales, pero no se puede utilizar para determinar la dirección absoluta (hacia arriba o hacia abajo).

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Resultados

Antes de la evaluación de la actividad latidos por imagen confocal, se realizó una caracterización cuidadosa de la respuesta óptica no lineal de los filtros de PTFE, ya sea solo o en presencia de HNPs a alta concentración (1 mg / ml). Se aseguró de que: i) el sustrato desnudo de dos fotones de fluorescencia excitada es muy débil y no puede evitar que la medición de las muestras biológicas pertinentes, y ii) la emisión SH a partir de HNPs aislados puede ser fácilmente adquirido por formación de imágenes a tr...

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Discusión

La aplicación de la nanotecnología a la investigación con células madre es una disciplina relativamente nueva, pero en rápida expansión campo. Como se ha señalado por varios artículos de revisión sobre el tema, el uso de nanopartículas se puede aplicar para llevar a cabo diferentes tareas de investigación, que van desde celular de seguimiento (tanto in vitro como in vivo), para el suministro intracelular de proteínas y genes, no menos importante la creación de entornos celulares biomiméti...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope Incubator	OKO LAB	UNO package (top stage)	37 °C, 5% CO2, moisturized
Multiphoton microscope	Nikon	AR1-MP
Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors
Filters SHG and autofluorescence	Semrock	FF01-360/12-25
FF01-395/11-25
FF02-485/20-25
Microscope objectives	Nikon
CFI Plan Fluor 10X			NA 0.30, WD 16 mm
CFI Plan Apo 20X			NA 0.75, WD 1.0 mm, VC
CFI Apo 40X			NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat
Rhock inhibitor	Sigma	Y-27632
Knockout DMEM	Invitrogen	10829
Knockout Serum	Invitrogen	10828
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	1140
L-glutamine 200 mM	Invitrogen	25030
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Roller scraper tool	StemPro EZPassage, Invitrogen	23181-010
StemPro Accutase	Gibco	S11105-01
Aggrewell system	StemCell Technologies	27845
Hyclone serum	Thermo Scientific	SH30070.03
Gelatin	Sigma	G9391
6-well plates	Falcon	353046
24-well plates	Nunclon	142475
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters	Millipore	NA76/25
Inserts	Millipore	PICM03050