Harmonique nanoparticules régénératrice recherche

Résumé

Détails du Protocole sont prévus pour l'étiquetage des cellules souches in vitro d'embryons humains à des nanoparticules deuxième engendrent des harmoniques. Méthodologies d'enquête sur les CSEh par microscopie multi-photons et leur différenciation en grappes cardiaques sont également présentés.

Résumé

Dans cette expérience visualisée, les informations de protocole sont fournies pour le marquage in vitro de cellules souches embryonnaires humaines (hESC) avec des nanoparticules de seconde génération harmonique (HNPs). Ces derniers sont une nouvelle famille de sondes introduites récemment pour l'étiquetage des échantillons biologiques pour l'imagerie multi-photonique. HNPs sont capable de doubler la fréquence de la lumière d'excitation par le processus optique non linéaire de génération de seconde harmonique sans restriction sur la longueur d'onde d'excitation.

Multi-photon méthodes de différenciation des CSEh en grappes cardiaques (maintenues comme cultures de l'air liquide longue durée) en fonction sont présentés en détail. En particulier, les données sur la façon de maximiser la seconde harmonique (SH) émission intense de HNPs isolés pendant le suivi 3D de battre le tissu cardiaque en 3D s'affiche. L'analyse des images obtenues à récupérer des modèles de déplacement 3D est également détaillée.

Introduction

Systèmes de microscopie non linéaire, grâce à leurs trois capacités inhérentes de coupes dimensions, sont de plus déclenché la demande de fluorophores avec des bandes d'absorption à deux photons photo-stable dans le proche infrarouge. Seulement dans les deux dernières années, afin de compléter le développement de labels basés sur la fluorescence (colorants, les points quantiques, jusqu'à conversion nanoparticules), une méthode d'imagerie différente a été exploite l'utilisation d'une nouvelle famille de nanoparticules intrinsèquement non linéaires comme des étiquettes, à savoir nanoparticules harmoniques (de HNPs) qui ont été spécifiquement développés pour la microscopie multi-photons. Ces étiquettes, à base de cristaux non-centrosymétriques inorganiques, exercent contraste optique générant le SH de la fréquence d'excitation: par exemple en convertissant une fraction de la lumière d'excitation pulsée dans le proche infrarouge (λ = 800 nm) en lumière bleue visible (λ / 2 = 400 nm) . Plusieurs auteurs dans le passé récent ont testé différents matériaux, y compris iodate de fer Fe (IO _{3) 3 ^1, le niobate de potassium (KNbO 3) ^2, le niobate de lithium (LiNbO 3) ^3, du titanate de baryum (BaTiO 3) ^4,5, phosphate de potassium titanyle (KTiOPO4, KTP) ^6-8, et de l'oxyde de zinc (ZnO ) ^5,9,10. Par rapport à des sondes fluorescentes, HNPs possèdent une série de propriétés intéressantes, telles que l'absence complète de blanchiment et clignotant, des bandes d'émission étroites, l'excitation d'onde accordabilité (de l'ultraviolet à l'infrarouge), la capacité de récupération de l'orientation, et la réponse optique cohérente. Ces propriétés uniques ont été récemment expliqué dans deux articles de synthèse complet ^11,12. La possibilité de travailler dans le domaine spectral infrarouge, ce qui augmente la profondeur d'imagerie en réduisant au minimum la diffusion et l'absorption, limite également considérablement la dégradation de l'échantillon photo ^13,14. En outre, le signal infiniment de photo-stable garanti par HNPs fait des sondes idéales pour le suivi des cellules à long terme, qui is particulièrement attrayant pour des applications en médecine régénérative ^15.}

Dans cette expérience visualisée, les informations de protocole sont fournies pour le marquage in vitro de cellules souches embryonnaires humaines (hESC) avec HNPs non fonctionnalisés. La synthèse et la préparation des suspensions colloïdales est détaillée dans une publication précédente et dans les références qui y sont ¹⁶ et est au-delà de la portée de ce travail. Méthodologies d'enquête sur les CSEh par microscopie multi-photons et leur différenciation en grappes cardiaques (maintenues comme cultures de l'air liquide à long terme) sont présentés. ESC humain peut être laissé à la différence dans les corps embryoïdes dits (EBS) de deux façons différentes, soit par la formation EB de fragments de colonies en suspension ou, à défaut, forcés agrégation de cellules individuelles dans EB utilisant la plaque Aggrewell, comme illustré sur la figure 1A . mise en culture de battre des amas de cellules cardiaques de polytétrafluoroéthylène (PTFE) filtres poreux facilitates leur maintien à long terme pour d'autres études (par exemple des mesures électrophysiologiques de potentiels d'action).

La source du microscope à balayage d'excitation doit être capable de délivrer des impulsions ultracourtes (avec une durée d'impulsion inférieure à 300 fs à l'échantillon) pour atteindre la puissance crête nécessaire pour effectuer l'imagerie de seconde harmonique de HNPs. Par exemple, le fs-source la plus courante utilisée pour l'imagerie sont accordable Ti: saphir lasers. Alternativement, d'autres lasers ultrarapides peuvent être utilisés, par exemple l'erbium ion ^17, chrome forstérite ¹⁸ ou Ti: saphir pompé infrarouges oscillateurs paramétriques optiques. Le microscope peut être équipée d'un objectif avec de préférence une ouverture numérique relativement élevée. Très important, avant les mesures, et à chaque fois que l'objectif est remplacé, il est impératif de réduire au minimum la dispersion présente dans la configuration (lentilles) en optimisant les paramètres de l'impulsion laser de pré-compresseur au travaillongueur d'onde de choix. Ce procédé, décrit dans le protocole, en sorte que l'impulsion laser soit aussi proche que possible de la transformer durée limitée (c'est à dire la plus courte que possible) dans le plan focal et à optimiser la réponse de l'échantillon non linéaire.

L'objectif de l'analyse d'image décrite à la fin du protocole est d'identifier et de suivre les mouvements en 3D HNPs associés aux contractions rythmiques de battre grappes cardiaques. Nanoparticules de suivi dans le plan de l'image est tout simplement réalisé en identifiant leurs positions dans des images vidéo successives. Pour extraire des informations sur le déplacement axial, un étalonnage préalable de la réponse non linéaire de l'intensité en fonction du déplacement axial est obligatoire. Notez que pour les mesures à long terme, un contrôle interférométrique actif de la position axiale de l'échantillon est nécessaire pour maintenir la validité de la courbe d'étalonnage en présence de dérives thermiques et / ou mécaniques.

Les HNPs utilisés ici pour traccellules e battant dans les agrégats sont basés sur l'oxyde de potassium de niobate (KNbO _3), mais d'autres nanomatériaux non linéaires disponibles sont examinés en détail dans l'ouvrage de Staedler et al ^16.

Les rendements optiques non linéaires de la plupart des nanomatériaux étudiés à ce jour sont très comparables. Le choix de KNbO ₃ est essentiellement motivé par la bonne stabilité de la solution colloïdale et sa bonne biocompatibilité, testé sur plusieurs lignées de cellules humaines, même à concentration relativement élevée et des temps d'exposition longs ^16.

Compte tenu de la nouveauté du nanomatériau utilisé pour ce travail, les principales caractéristiques de HNPs que par rapport à / luminescents bio-marqueurs fluorescents sont présentés dans une animation vidéo de l'ordinateur d'origine à court réalisé par les auteurs.

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Protocole

1. Culture et de l'expansion de l'ESC humain

1. Préparer le milieu de propagation cellulaire (appelée PM) contenant Knockout DMEM supplémenté avec 20% Knockout sérum, 1% de MEM non-acides aminés essentiels, 1% de L-glutamine 200 mM, 1% de pénicilline-streptomycine, et 3,5 ul de β-mercaptoéthanol.
2. Décongeler les CSE humaines (CSEh) dans 8 ml de milieu de PM et de les centrifuger 5 min à 115 xg pour éliminer milieu de congélation DMSO-complété.
3. Ajouter 1 ml de milieu PM contenant 10 mM inhibiteur de roche pour empêcher l'apoptose et d'améliorer la survie des cellules après décongélation (24 heures d'incubation seulement).
4. Ajouter facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) pour la PM à la concentration désirée (4-10 ng / ml) pour le maintien de la pluripotence.
5. Plaque la CSEh sur humain irradié prépuce de cellules nourricières (γHFF) (figure 1A), auparavant plaqué à une concentration de 2 x 10 ⁴ cellules / cm ^2.
6. Changer le milieu tous les jours et, le cas échéant, retirer des parties de colonies de commencer à différencier par aspiration à l'aide d'une pipette Pasteur fortement réduit allongée.
7. Une fois par semaine, les colonies de passage par voie enzymatique:
   1. Éliminer le milieu et laver colonies avec 2 ml de PBS.
   2. Retirer du PBS et les incuber avec 0,5 ml par puits de la collagénase IV chaud à 1 mg / ml pendant 10 min à 37 ° C, 5% CO _2.
   3. Recueillir des fragments de colonies dans 2 ml nouveau PM et centrifuger à 115 g pendant 3 min.
8. Alternativement, les colonies peuvent être repiquées mécaniquement par grattage:
   1. Éliminer le milieu et laver colonies avec 2 ml de PBS.
   2. Gratter manuellement colonies à l'aide de l'outil rouleau racleur STEMPRO EZPassage (figure 1B).
   3. Recueillir des fragments de colonies et centrifuger ensuite pendant 3 min à 115 xg pour éliminer le surnageant.
   4. fragments de plaque sur γHFF ou les traitent de différenciation en corps embryoïdes (EBS).

2. Différenciation des CSE humainesProtocole

1. Préparer le milieu de différenciation (DM) à l'aide Knockout milieu DMEM additionné de 2% de sérum de Hyclone, 1,0% MEM non-acides aminés essentiels, 1,0% de L-glutamine 200 mM, 1% de pénicilline-streptomycine, 3,5 ul β-mercaptoéthanol.
2. Éliminer le milieu et laver colonies avec 2 ml de PBS.
3. Formation EB de fragments de colonies en suspension:
   1. Retirer du PBS et les incuber avec 0,5 ml par puits de la collagénase IV chaud à 1 mg / ml pendant 10 min à 37 ° C, 5% CO _2.
   2. Recueillir des fragments de colonies dans 2 ml nouveau DM et centrifuger à 115 g pendant 3 min.
   3. Culture en suspension dans les ultra-faible attachement des plaques de 6 puits (2 ml par puits) pendant 4 jours (figure 1C).
   4. Recueillir et plaquer les EB nouvellement formés sur 0,1% revêtues de gélatine 24 puits plaques (environ 3 EB / puits) (figure 1D).
4. Sinon, forcé agrégation de cellules uniques en EB en utilisant la plaque Aggrewell:
   1. Retirer du PBS etdissocier colonies en cellules individuelles en utilisant Accutase (0,5 ml / puits).
   2. Centrifuger les cellules et remettre en suspension dans DM à 1,2 x 10 ⁶ / ml.
   3. Ajouter 2 ml par chambre Aggrewell pour 1 jour (figure 1B).
   4. Recueillir EB nouvellement formées (figure 1C ») et de la plaque sur les 0,1% des plaques à 24 puits revêtues de gélatine (environ 3 EB / puits).
   5. Changer DM tous les 2-3 jours jusqu'à l'apparition de battre des grappes de cardiomyocytes (15-30 jours).

3. Air-liquide cultures 3D de battant Clusters et marquage avec HNPs

1. Identifier et manuellement disséquer grappes de cardiomyocytes battant (figure 1D), apparaissant normalement après 2-4 semaines de culture, à l'aide d'une pipette Pasteur fortement réduit allongée.
2. Dépôt 4 filtres de PTFE par insert qui seront placés sur une plaque à 6 puits (figure 1F).
3. Ajouter 1 ml de milieu de DM sur le dessus de l'EACh bien.
4. Ajouter une grappe disséqué battre sur chaque filtre PTFE (figure 1E), 4/well maximale, soit 24 agrégats par plaque (figure 1F).
5. Changer le milieu de DM tous les 2-3 jours.
6. Pour marquer les grappes, retirez le filtre PTFE contenant la grappe battant et le mettre sur 3,5 cm verre plat inférieur (170 um d'épaisseur).
7. Ajouter 1 ml de SNP à une concentration de 50 ug / ml pendant 30 min.

4. Imagerie optique non linéaire

1. La préparation des échantillons. Après marquage de la PNH (voir l'étape 3.6), transférer soit entiers de différenciation début HeBS ou des groupes de battement cardiaque (disséqués en cas d'apparition de contraction) sur des filtres en PTFE sur un plat à fond de verre de 170 um d'épaisseur compatible avec la distance de travail des objectifs de grande ouverture numérique. Alternativement, appliquer une couche directe de battre grappes au plat à fond de verre pré-revêtu avec 0,1% de gélatine.
2. échantillons de transfert à untout-en-un microscope équipé d'incubation chambre assurant une température stable, de l'humidité et de CO ₂ contrôle sur de longues périodes de temps.
3. Après l'inspection initiale, l'image de l'échantillon par l'imagerie à grand champ sous éclairage en lumière blanche d'identifier les structures d'intérêt dans EB différenciés ou des groupes de battement actifs qui seront sélectionnés pour des examens complémentaires.
4. Si autofluorescence cellulaire de NADH et SH de HNPs doivent être acquises simultanément, définissez une longueur d'onde plus courte d'excitation laser (c. 720 nm) pour correspondre à l'absorption moléculaire. Utiliser une étroite passe-bande filtre spectral centré sur la moitié de la longueur d'onde d'excitation (c.-à λ = 360 ± 10 nm) afin de détecter SH, et l'autre pour détecter des auto-fluorescence.
5. Effectuer d'abord une faible résolution rapide, balayage tridimensionnel pour reconstruire la morphologie globale de la grappe cardiaque et sélectionner un plan d'image dans le volume de la grappe avec plusieurs PNH visibles.
6. Si nécessaire, changer la longueur d'onde d'excitation librement pour correspondre au mieux les propriétés optiques de l'échantillon ou pour éviter photoblanchiment, des dommages de photo et à l'image plus profondément dans les tissus avec une longueur d'onde infrarouge (c'est à dire, 790 nm) et remplacer le second filtre harmonique en conséquence (c.-à 395 nm ). Optimiser les paramètres de l'impulsion laser de pré-compression à la longueur d'onde de fonctionnement de choix en maximisant le signal de second harmonique de HNPs déposées sur l'échantillon.
7. Pour suivre en temps réel les contractions cardiaques munitions, mettre le lecteur optique du microscope dans le mode le plus rapide tel que le mode de résonance, permettant l'acquisition à grande vitesse d'images en deux dimensions.
8. Choisissez les paramètres que le meilleur compromis entre le contraste d'image et la vitesse d'acquisition, tels que:
   • Moyenne de numérisation: 4
   • Pixel temps de séjour: 0,1 microsecondes
   • Taux d'image: 3,75 images par seconde (ips)
9. Puissance du laser est ajustée en fonction de tache focale siser et la vitesse de balayage. 50 mW (mesurée à l'entrée de l'objectif) est une valeur typique de 0,1 microsecondes pixel temps de séjour et le Plan APO 20X NA 0,75 objectif la préservation de la viabilité des cellules.

5. Analyse de l'image

1. Procédure de calibrage axial. Sélectionnez une seule PNH déposé sur un substrat nu. Ajuster la mise au point (c'est à dire la position axiale de la nanoparticule) pour maximiser l'intensité du SH. Faire varier de manière contrôlée la position axiale de la platine du microscope afin d'obtenir la courbe d'étalonnage reliant l'intensité de SH en tant que fonction de la PNH décalé par rapport au plan focal. Le résultat de cette procédure d'étalonnage pour le plan d'APO 0,75 objectif 20X NA est rapporté sur la figure 4C.
2. Sélectionnez HNPs présents dans toutes les images de la vidéo et de déterminer leurs mouvements périodiques. Cette procédure peut être facilement automatisée, par exemple par un code personnalisé à la recherche de points d'intensité maximum de signal dans une région d'intérêt définie etles reliant entre les différents cadres (un exemple de code écrit en Matlab R2009 b en utilisant la fonction 'région' accessoires de la boîte à outils de traitement d'image est présentée).
3. Évaluer la quantification des déplacements hors-plan, associés à HNPs non-permanence traçables déplaçant le long de l'axe optique, en convertissant leurs modulations d'intensité tout au long de différents cadres en déplacement axial en utilisant la courbe d'étalonnage établie à l'étape 5.1. A noter que ce procédé donne accès à des mouvements axiaux, mais ne peut pas être utilisé pour déterminer la direction absolue (vers le haut ou vers le bas).

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Résultats

Avant l'évaluation de l'activité de battements par imagerie confocale, une caractérisation soigneuse de la réponse optique non linéaire des filtres en PTFE a été effectuée, soit seul, soit en présence d'HNPs à forte concentration (1 mg / ml). On a veillé à ce que: i) le substrat nu fluorescence à deux photons excités est très faible et ne peut pas empêcher la mesure des échantillons biologiques pertinents, et ii) l'émission de SH de HNPs isolé peut être facilement acquis par imagerie ...

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Discussion

L'application de la nanotechnologie à la recherche de cellule souche est relativement nouveau mais en pleine expansion domaine. Comme le souligne divers articles de revue sur le sujet, l'utilisation de nanoparticules peut être appliqué pour accomplir des tâches de recherche différents, allant de la cellule de suivi (à la fois in vitro et in vivo), pour la délivrance intracellulaire de protéines et de gènes, notamment la création d' environnements cellulaires biomimétiques pour la stimulat...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope Incubator	OKO LAB	UNO package (top stage)	37 °C, 5% CO2, moisturized
Multiphoton microscope	Nikon	AR1-MP
Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors
Filters SHG and autofluorescence	Semrock	FF01-360/12-25
FF01-395/11-25
FF02-485/20-25
Microscope objectives	Nikon
CFI Plan Fluor 10X			NA 0.30, WD 16 mm
CFI Plan Apo 20X			NA 0.75, WD 1.0 mm, VC
CFI Apo 40X			NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat
Rhock inhibitor	Sigma	Y-27632
Knockout DMEM	Invitrogen	10829
Knockout Serum	Invitrogen	10828
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	1140
L-glutamine 200 mM	Invitrogen	25030
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Roller scraper tool	StemPro EZPassage, Invitrogen	23181-010
StemPro Accutase	Gibco	S11105-01
Aggrewell system	StemCell Technologies	27845
Hyclone serum	Thermo Scientific	SH30070.03
Gelatin	Sigma	G9391
6-well plates	Falcon	353046
24-well plates	Nunclon	142475
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters	Millipore	NA76/25
Inserts	Millipore	PICM03050