재생 연구를위한 고조파 나노 입자

요약

프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자와 생체 표지 인간 배아 줄기 세포 제공됩니다. 다 광자 현미경과 심장 클러스터로 분화하여 hESC의 조사에 대한 방법론도 제시된다.

초록

이 시각 실험에서, 프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자 (HNPs)와 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨 (hESC의) 제공됩니다. 후자는 최근 다중 광자 이미징을위한 생체 시료 라벨 도입 프로브의 새로운 가족입니다. HNPs는 여기 파장에 아무런 제한이 제 고조파 발생의 비선형 광학적 프로세스에 의해 여기 광의 주파수를 두배로 할 수있다.

다 광자 (장기 공기 - 액체 문화로 유지) 심장 클러스터로 hESC의 차별화를위한 방법론을 기반으로 상세하게 제공됩니다. 특히, 3D로 심장 조직을 구타의 3D 모니터링 동안 고립 HNPs의 강렬한 두 번째 고조파 (SH) 배출을 극대화하는 방법에 대한 증거가 표시됩니다. 3D 변위 패턴을 검색 결과 이​​미지의 분석은 또한 상술된다.

서문

비선형 현미경 시스템은 고유의 입체 단면 처리 능력 덕분에, 점점 근적외선의 이광자 흡수 밴드를 가진 광 안정 형광체에 대한 수요를 유발 하였다. 단지 지난 몇 년에, 형광 기반의 라벨 (염료, 양자 점, 최대 변환 나노 입자), 다른 이미징 방법은 레이블과 같은 본질적으로 비선형 나노 입자의 새로운 가족의 사용을 악용 한, 즉 개발을 보완하는 특히 다 광자 현미경을 위해 개발 된 고조파 나노 입자 (HNPs). 무기 noncentrosymmetric 결정에 따라 이러한 레이블은 여기 주파수의 SH를 생성 광학 대비를 발휘 : 근적외선 펄스 여기 빛의 일부를 변환하여 예를 볼 푸른 빛으로 (λ = 800 nm의) (λ / 2 = 400 nm의) . 최근 과거에 여러 저자는 철 요오드 철 (IO를 포함하여, 다른 재료를 테스트 한 _{3) 3 ^일, 칼륨 니오 베이트 (KNbO ^3)이, 니오브 산 리튬 (의 LiNbO3) ^3, 티탄산 바륨 (BaTiO3를) ^4,5, 칼륨 티 타닐 포스페이트 (KTiOPO4, KTP) ^6-8, 및 산화 아연 (ZnO의 ) ^5,9,10. 형광 프로브에 비해 HNPs는 완전한 표백의 부재 점멸, 좁은 발광 밴드 (적외선하는 자외선에서) 여기 파장 조정 기능, 방향 검색 기능 및 일관성있는 광학 응답으로 매력적인 특성의 시리즈를 가지고있다. 이러한 독특한 특성은 최근 두 가지 종합적인 검토 논문 ^{11, 12에} 설명되어있다. 또한, 산란 및 흡수를 최소화하여 영상의 깊이를 증가 적외선 스펙트럼 영역에서 작업의 가능성이 크게 샘플 사진 저하 ^{(13, 14)을} 제한한다. 또한, HNPs 보장 무한 사진 안정 신호는 장기 세포 추적하기에 적합한 프로브를 만드는 전특히 재생 의학 응용 프로그램을 ¹⁵ 호소이야.}

이 시각 실험에서, 프로토콜 세부 사항은 작용 화 HNPs으로 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨 (hESC의) 제공됩니다. 콜로이드 현탁액의 합성 및 제조는 이전 책에서 및 참조 거기에 ^16에서 설명하고이 범위에있다. (장기 공기 - 액체 문화로 유지) 심장 클러스터에 다 광자 현미경과 분화에 의해 hESC의 조사에 대한 방법론이 제시된다. 인간의 ESC 서스펜션의 식민지 조각의 EB 형성하거나 그림 1A에 도시 된 바와 같이, 대안, Aggrewell 판을 사용하여 사채에 단일 세포의 응집을 강제하거나 두 가지 방법으로 소위 배아 체 (교환 사채) 내에서 차별화 할 수 있도록 할 수 있습니다 . 폴리 테트라 플루오로 에틸렌에 심장 세포의 클러스터를 치고 배양 (PTFE) 다공성 필터 FAC추가 연구 (활동 전위의 예를 들어 전기 생리학 측정)에 대한 자신의 장기적인 유지 관리를 ilitates.

주사 현미경의 여진 원은 HNPs의 차 고조파 이미징을 수행하기 위해 필요한 최대 전력에 도달하기 위해 (샘플에서 300 FSEC보다 작은 펄스 시간) 초단 펄스를 제공 할 수 있어야한다. 예를 들어, 이미징에 사용되는 가장 일반적인 FSEC 소스는 가변 티 아르 : 사파이어 레이저. 사파이어 펌핑 적외선 광 파라 메트릭 발진기 : 또는 다른 초고속 레이저는 인스턴스 에르븀 이온 ^17, 크롬 포스 테 라이트 ⁽¹⁸⁾ 또는 티를 위해, 이용 될 수있다. 현미경은 바람직 다소 높은 개구 수 대물 탑재 될 수있다. 아주 중요한 것은, 앞서 측정 한 목적이 대체 될 때마다, 그것은이 운동에 레이저 펄스 사전 압축기의 설정을 최적화하여 셋업 (렌즈)의 분산액의 존재를 최소화하기 위해 필수선택의 파장. 프로토콜에 설명이 절차는, 레이저 펄스가 초점면에서 한정된 지속 기간을 변형 (즉, 최단 등)에 최대한 가깝게하고 샘플 비선형 응답을 최대화하는 것을 보장한다.

프로토콜의 끝 부분에 설명 된 이미지 분석의 목적은 파악하고 심장 클러스터를 상회의 리듬 수축과 관련된 3D HNPs의 움직임에 추적 할 수 있습니다. 이미지면에서 추적 나노 입자는 단순히 연속 동영상 프레임에서 자신의 위치를​​ 파악하여 실현된다. 축 방향 이동에 대한 정보를 추출하기 위해, 축 방향 변위의 함수로서 비선형 강도 응답의 사전 보정이 필수적이다. 장기 측정 샘플 축 위치의 활성 간섭계 컨트롤을주지는 열 및 / 또는 기계적 감도의 존재 검량선의 유효성을 유지하는 것이 요구된다.

TRAC에 여기에 사용 HNPs집합 내의 전자 박동 세포는 니오븀 산 칼륨 산화물 (KNbO _3)을 기반으로하지만, 다른 가능한 비선형 나노 물질은 Staedler 등 ^(16)의 작품에서 자세히 검토하고 있습니다.

지금까지 조사 된 나노 물질의 대부분의 비선형 광학 효율이 매우 비교할 수 있습니다. KNbO _3의 선택은 본질적으로 콜로이드 용액의 좋은 안정성과도 상당히 높은 농도와 긴 박람회 ¹⁶ 배에서 몇 사람의 세포주의 좋은 생체 적합성에 의해 좌우되었다.

이 작업에 사용되는 나노 물질의 새로운 감안할 때, 형광 / 발광 바이오 마커에 비해 HNPs의 주요 특성은 저자에 의해 실현 짧은 원래 컴퓨터 비디오 애니메이션에 표시됩니다.

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프로토콜

1. 문화와 인간 ESC의 확장

1. 준비 녹아웃 DMEM을 함유하는 (PM이라고 함) 세포 증식 배지는 20 % 녹아웃 혈청, 1 % MEM 비 필수 아미노산, 1 % L-글루타민 200 mM의 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 및 3.5 μL의 β-머 캅토 에탄올이 보충.
2. 8 ML의 PM 매체에서 인간의 ESC (hESC의)를 해동 및 DMSO 첨가 된 동결 매체를 폐기 115 XG에서 그들에게 5 분 원심 분리기.
3. (만 24 시간 배양)를 해동시 세포 사멸을 방지하고 세포 생존을 개선하기 위해 10 mM의 바위 억제제를 포함하는 PM 매체의 1 ML을 추가합니다.
4. 능성의 유지에 필요한 농도 (4-10 NG / ㎖)에서 PM에 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)를 추가한다.
5. 이전 / ^㎠ 2 × 10 ⁴ 세포의 농도로 도금 피더 세포 포피 조사 인간의 hESC의 (γHFF) (그림 1A)를, 플레이트.
6. 필요한 경우 C의 일부를 제거, 중간 매일 변경olonies는 긴 크게 잘라 파스퇴르 피펫을 사용하여 흡인 차별화하기 시작했다.
7. 효소 주 통로 식민지 번 :
   1. 매체를 제거하고 2 ML PBS와 식민지를 씻어.
   2. PBS를 제거하고 37 ° C, 5 % CO _2에서 10 분 동안 1 ㎎ / ㎖에서 따뜻한 콜라게나 제 IV 잘 당 0.5 ㎖로 그들을 품어.
   3. 2 ㎖ 3 분 115 XG에 새로운 PM 원심 분리기에 식민지 조각을 수집합니다.
8. 또한, 식민지 긁어 기계적으로 계대 할 수 있습니다
   1. 매체를 제거하고 2 ML PBS와 식민지를 씻어.
   2. 수동 StemPro EZPassage 롤러 긁는 도구 (그림 1B)를 사용하여 식민지를 다 쳤어요.
   3. 식민지 조각을 수집하고 뜨는을 제거하기 위해 115 XG에서 3 분 동안 원심 분리 한 후.
   4. γHFF 또는 플레이트 조각은 배아 체 (교환 사채)로 차별화를 처리합니다.

2. 인간의 ESC 차별화프로토콜

1. 준비 녹아웃 DMEM을 사용하여 차별화 매체 (DM)는 2 % HyClone 사 혈청, 1.0 % MEM 비 필수 아미노산, 1.0 %의 L-글루타민 200 밀리미터, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 3.5 μL의 β-머 캅토 에탄올과 보충.
2. 매체를 제거하고 2 ML PBS와 식민지를 씻어.
3. 서스펜션의 식민지 조각의 EB 형성 :
   1. PBS를 제거하고 37 ° C, 5 % CO _2에서 10 분 동안 1 ㎎ / ㎖에서 따뜻한 콜라게나 제 IV 잘 당 0.5 ㎖로 그들을 품어.
   2. 2 ㎖ 3 분 115 XG에 새로운 DM 원심 분리기에 식민지 조각을 수집합니다.
   3. 사일 (그림 1C) 용 초저 첨부 6 - 웰 플레이트 (물론 당 2 ㎖) 현탁액 문화를.
   4. 수집하고 0.1 % 젤라틴 코팅 24 - 웰 플레이트 (약 3 사채 /도) (그림 1D)에 새로 설립하는 교환 사채를 접시.
4. 또한, Aggrewell 판을 사용하여 사채로 단일 세포의 집계를 강제 :
   1. 제거 PBS와accutase (0.5 ㎖ /도)를 사용하여 단일 세포로 식민지를 떼어 놓다.
   2. 1.2 × 10 ⁶ / ㎖에서 DM의 원심 분리기와에 resuspend 세포.
   3. 일일 (그림 1B ')에 대한 Aggrewell 챔버 당 2 ML을 추가합니다.
   4. 새로 형성된 사채 (그림 1C ')를 수집하고 0.1 % 젤라틴 코팅 24 - 웰 플레이트 (약 3 사채 / 웰)에 그들을 접시.
   5. 심근 (15-30 일)가 클러스터를 상회의 모양까지 2-3 일마다 DM을 변경합니다.

HNPs와 클러스터 및 라벨링 잔 3. 공기 - 액체 3D 문화

1. 확인하고 수동으로 일반적으로 긴 크게 잘라 파스퇴르 피펫을 사용하여, 문화 2 ~ 4 주 후에 나타나는 치는 심근 (그림 1D)의 클러스터를 해부하다.
2. 6 잘 플레이트 (그림 1 층)에 배치됩니다 삽입 당 보증금 4 PTFE 필터.
3. EAC의 상단에 DM 매체의 1 ML을 추가합니다시간 잘.
4. 각 PTFE 필터 (그림 1E)에 하나의 해부 치고 클러스터, 최대 4/well, 플레이트 (그림 1 층 ') 당 즉, 24 집계를 추가합니다.
5. 2-3 일마다 DM 매체를 변경합니다.
6. 클러스터 레이블을 지정하려면 (170 μm의 두께) 박동 클러스터를 포함하는 PTFE 필터를 제거하고 3.5 cm의 유리 바닥 접시에 넣어.
7. 30 분 동안 50 ㎍ / ml의 농도로 HNP 1 ㎖를 추가.

4. 비선형 광학 이미징

1. 샘플 준비. HNP 라벨 (단계 3.6 참조)를 사용하여 높은 개구 목표의 작동 거리와 호환되는 170 μm의 두께 유리 바닥 접시 위에 PTFE 필터에 전체 분화 초기 HEBS 또는 (수축 모양에 따라 절개) 심장 박동 클러스터 중 하나를 전송 한 후. 또한, 유리 바닥 접시 0.1 % 젤라틴으로 미리 코팅에 클러스터를 상회의 직접 코팅을 적용합니다.
2. 로 전송 샘플올인원 안정 온도, 습도 및 시간의 연장 기간 동안 CO ₂ 제어를 보장하는 실을 배양 장착 현미경.
3. 초기 검사, 이미지 후 백색광 조명 아래 넓은 필드 영상을 통해 샘플은 추가 조사를 위해 선택됩니다 차별화 된 사채 또는 활성 박동 클러스터 내에서 그 구조를 식별합니다.
4. 세포 NADH의 형광도 및 HNPs에서 SH 동시에 취득 할 수있는 경우, 분자 흡수에 맞게 짧은 레이저 여기 파장 (즉, 720 nm의)을 설정합니다. 반 여기 파장에 중심 한 협 대역 통과 스펙트럼 필터 사용 (즉, λ = 360 ± 10 ㎚) SH를 검출하고, 또 다른 하나는 형광도를 검출하도록.
5. 첫째 심장 클러스터의 전체 형태를 재건하고 여러 가지 볼 수 HNP와 클러스터 볼륨 내에서 이미지 평면을 선택하는 빠르고, 낮은 해상도, 입체 검사를 수행의.
6. 필요한 경우 유용한 샘플의 광학 특성을 일치하도록 자유롭게 여기 파장을 변경하거나 IR 파장 (즉, 790 nm 정도)을 가진 조직을 깊은 광표백, 사진 손상 및 화상에 않도록하고 (즉, 395 nm의 따라서 제 고조파 필터 교체 ). 샘플에 증착 HNPs의 제 고조파 신호를 최대화함으로써 선택의 작동 파장에서 레이저 펄스 사전 압축기의 설정을 최적화.
7. 실시간으로 심장 클러스터의 수축을 모니터링 두 가지 차원 영상의 고속 획득을 허용, 같은 공진 모드와 빠른 모드에서 현미경 광학 스캐너를 설정합니다.
8. 같은 이미지의 대비와 수집 속도 사이의 최고의 타협으로 설정을 선택합니다 :
   • 스캔 평균 : 4
   • 픽셀 체류 시간 : 0.1 마이크로 초
   • 이미지 속도 : 초당 4,125 프레임 (fps)
9. 레이저 파워는 초점 스팟의에 따라 조정이지는 스캔 속도. (목적의 입구에서 측정) 50 mW의 0.1 마이크로 초 화소의 정지 시간 및 세포 생존 능력을 보존 계획 APO 20X NA 825 목적의 전형적인 값입니다.

5. 이미지 분석

1. 축 보정 절차. 베어 기판에 증착 된 단일 HNP를 선택합니다. SH 강도를 극대화 (나노 입자의 축 방향 위치, 즉) 초점을 조정합니다. HNP의 함수로서 SH 강도 관한 검량선을 얻었다 현미경 스테이지의 축 방향 위치는 초점 평면으로부터 오프셋 제어 된 방식으로 변화한다. 계획 APO 20X NA 825 목적이 보정 절차의 출력은 그림 (c)에보고됩니다.
2. 모든 비디오 프레임에 존재 HNPs를 선택하고 자신의주기적인 움직임을 결정한다. 이 절차는 쉽게 그 정의 된 영역에서 최대 신호 강도 반점을 추구하는 사용자 지정 코드로 예를 들어, 자동화 할 수 있습니다다른 프레임 사이를 연결 (이미지 처리 도구 상자의 '지역의 소품'기능을 사용하여 B를 Matlab을 R2009로 작성된 예제 코드은 제공됩니다).
3. 비 연속적 추적 HNPs 단계 5.1에서 확립 검량선을 이용하여 축 방향 변위로 다른 프레임에 걸쳐 자신의 강도 변조를 변환함으로써, 광축을 따라 이동과 연관된 면외 변위의 정량 평가. 이 절차는 축 방향의 움직임에 대한 액세스를 제공하지만, 절대적인 방향 (위 또는 아래)를 결정하는데 이용 될 수 없습니다.

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결과

이전 촛점 촬상함에 고해 활성을 평가하기에, PTFE 필터의 비선형 광학 응답의 신중한 특성화 고농도 (1 ㎎ / ㎖)에서 단독으로 또는 HNPs의 존재 하에서도 수행 하였다. ⅰ) 상기 베어 기판 이광자 여기 형광이 미약하며 관련 생물학적 시료 측정을 방지 할 수 있고, ⅱ) 절연 HNPs로부터 SH 방출 쉽게 에피 검출 모드에서 상기 기판을 촬상하여 취득 할 수있다 : 그것은 것이 보장되었다 (그림 2).

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토론

줄기 세포 연구에 나노 기술의 응용 프로그램은 비교적 새로운하지만 빠르게 확장 필드입니다. 주제에 대한 다양한 리뷰 기사에서 지적한 바와 같이, 나노 입자의 사용은 적어도 창조의 단백질 및 유전자의 세포 내 전달에, (시험 관내 및 생체 내에서 모두) 추적 세포에 이르기까지 다양한 연구 작업을 수행하기 위해 적용 할 수있는 특정 분화 우선 자극 / 억제를위한 생체 모방 세포 환경은...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope Incubator	OKO LAB	UNO package (top stage)	37 °C, 5% CO2, moisturized
Multiphoton microscope	Nikon	AR1-MP
Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors
Filters SHG and autofluorescence	Semrock	FF01-360/12-25
FF01-395/11-25
FF02-485/20-25
Microscope objectives	Nikon
CFI Plan Fluor 10X			NA 0.30, WD 16 mm
CFI Plan Apo 20X			NA 0.75, WD 1.0 mm, VC
CFI Apo 40X			NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat
Rhock inhibitor	Sigma	Y-27632
Knockout DMEM	Invitrogen	10829
Knockout Serum	Invitrogen	10828
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	1140
L-glutamine 200 mM	Invitrogen	25030
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Roller scraper tool	StemPro EZPassage, Invitrogen	23181-010
StemPro Accutase	Gibco	S11105-01
Aggrewell system	StemCell Technologies	27845
Hyclone serum	Thermo Scientific	SH30070.03
Gelatin	Sigma	G9391
6-well plates	Falcon	353046
24-well plates	Nunclon	142475
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters	Millipore	NA76/25
Inserts	Millipore	PICM03050