Harmonic Nanoparticelle for Regenerative ricerca

Riepilogo

Dettagli del protocollo sono previste per l'etichettatura di cellule staminali embrionali umane in vitro con la seconda nanoparticelle generano armoniche. Metodologie di indagine hESC mediante microscopia multi-fotone e la loro differenziazione in gruppi cardiache sono anche presentati.

Abstract

In questo esperimento visualizzato, dettagli del protocollo sono previste per l'etichettatura in vitro di cellule staminali embrionali umane (hESC) con nanoparticelle di generazione di armoniche secondo (HNPS). Questi ultimi sono una nuova famiglia di sonde recentemente introdotte per l'etichettatura di campioni biologici per l'imaging multi-fotone. HNPS sono in grado di raddoppiare la frequenza della luce di eccitazione dal processo ottica non lineare di generazione di seconda armonica senza alcuna restrizione sulla lunghezza d'onda di eccitazione.

Multi-fotone metodologie per la differenziazione hESC nei cluster cardiaci (mantenuti culture aria-liquido lungo termine) basato sono presentati in dettaglio. In particolare, viene mostrata la prova su come massimizzare l'intenso seconda armonica (SH) emissione di HNPS isolati durante il monitoraggio 3D di battere tessuto cardiaco in 3D. L'analisi delle immagini risultanti per recuperare modelli 3D displacement è anche dettagliata.

Introduzione

Sistemi di microscopia non lineari, grazie alle loro intrinseche capacità di sezionamento tre dimensioni, hanno sempre innescato la richiesta di fluorofori foto-stabile con bande di assorbimento a due fotoni nel vicino infrarosso. Solo negli ultimi due anni, per completare lo sviluppo di etichette a base di fluorescenza (coloranti, quantum dots, la conversione di nanoparticelle), una metodologia di imaging diverso ha sfruttato l'uso di una nuova famiglia di nanoparticelle intrinsecamente non lineari come etichette, cioè nanoparticelle armonica (HNPS) che sono stati specificamente sviluppati per microscopia multi-fotone. Queste etichette, basati su cristalli noncentrosymmetric inorganici, esercitano contrasto ottico generando la SH della frequenza di eccitazione: per esempio convertendo una frazione di luce di eccitazione pulsata vicino infrarosso (λ = 800 nm) in luce blu visibile (λ / 2 = 400 nm) . Diversi autori nel recente passato hanno testato diversi materiali, tra cui iodato di ferro Fe (IO _{3) 3 ^1, niobato di potassio (KNbO 3) ^2, il niobato di litio (LiNbO 3) ^3, titanato di bario (batio 3) ^4,5, potassio titanile fosfato (KTiOPO4, KTP) ^6-8, e ossido di zinco (ZnO ) ^5,9,10. Rispetto alle sonde fluorescenti, HNPS possiedono una serie di caratteristiche interessanti, come la completa assenza di candeggio e lampeggiante, bande di emissione strette, di eccitazione lunghezza d'onda sintonizzabilità (da raggi ultravioletti a infrarossi), la capacità di reperimento di orientamento, e la risposta ottica coerente. Queste proprietà uniche sono state recentemente spiegato in due Opinione documenti completi ^11,12. La possibilità di lavorare nella regione spettrale dell'infrarosso, che aumenta la profondità di imaging minimizzando dispersione e l'assorbimento, anche limita drasticamente foto campione degradazione ^13,14. Inoltre, il segnale photo-stabile infinitamente garantito da HNPS li rende ideali per sonde di monitoraggio cella a lungo termine, che is particolarmente attraente per le applicazioni di medicina rigenerativa ^15.}

In questo esperimento visualizzato, dettagli del protocollo sono previste per l'etichettatura in vitro di cellule staminali embrionali umane (hESC) con HNPS unfunctionalized. La sintesi e la preparazione di sospensioni colloidali è dettagliato in una precedente pubblicazione e riferimenti ivi ¹⁶ ed è oltre la portata di questo lavoro. Metodologie di indagine hESC mediante microscopia multi-fotone e la loro differenziazione in gruppi cardiaci (mantenuti culture aria-liquido lungo termine) sono presentati. ESC umana può essere lasciato per differenziare entro cosiddetti corpi embrionali (EBS) in due modi diversi, sia per la formazione di frammenti EB colonie in sospensione o, in alternativa, l'aggregazione di singole cellule nel EBs utilizzando la piastra Aggrewell forzati, come illustrato nella Figura 1A . Coltura battendo ammassi di cellule cardiache in politetrafluoroetilene (PTFE) filtri porosi facilitates loro mantenimento a lungo termine per ulteriori studi (per esempio misurazioni elettrofisiologiche dei potenziali d'azione).

La sorgente di eccitazione del microscopio a scansione dovrebbe essere in grado di fornire impulsi ultracorti (con durata dell'impulso minore di 300 fsec al campione) per raggiungere la potenza di picco necessaria per effettuare l'imaging seconda armonica di HNPS. Per esempio, il fsec-source più utilizzato per l'imaging sono accordabili Ti: zaffiro laser. In alternativa, altri laser ultraveloci possono essere impiegati, ad esempio, erbio ione ^17, cromo forsterite ¹⁸ Ti: zaffiro pompato infrarossi oscillatori parametrici ottici. Il microscopio può essere dotata di un obiettivo con preferibilmente una piuttosto alta apertura numerica. Molto importante, prima della misura, e ogni volta che l'obiettivo viene sostituito, è obbligatorio per minimizzare la dispersione presenti nel set-up (lenti) ottimizzando le impostazioni dell'impulso laser pre-compressore al lavorolunghezza d'onda di scelta. Questo procedimento, descritto nel protocollo, assicura che l'impulso laser è il più vicino possibile alla trasformazione durata limitata (cioè più breve possibile) in corrispondenza del piano focale e massimizza la risposta di esempio non lineare.

L'obiettivo dell'analisi dell'immagine descritto alla fine del protocollo è di identificare e tracciare in movimenti 3D HNPS associati alle contrazioni ritmiche di battere cluster cardiaci. Inseguimento nanoparticelle nel piano dell'immagine è semplicemente realizzato identificando le loro posizioni in fotogrammi di film successivi. Per estrarre le informazioni sul movimento assiale, una prima taratura della risposta intensità lineare in funzione dello spostamento assiale è obbligatoria. Si noti che per misurazioni a lungo termine, un controllo interferometrico attivo della posizione assiale campione è necessario per mantenere la validità della curva di calibrazione in presenza di derive termiche e / o meccaniche.

I HNPS utilizzati qui per traccellule e battendo all'interno degli aggregati sono basati su ossido di niobato di potassio (KNbO _3), ma altri nanomateriali lineari disponibili sono esaminati in dettaglio nel lavoro di Staedler et al ^16.

Le efficienze ottici non lineari della maggior parte dei nanomateriali esaminati finora sono molto simili. La scelta per KNbO ₃ era essenzialmente motivata dalla buona stabilità della soluzione colloidale e la sua buona biocompatibilità, testato su diverse linee cellulari umane anche a concentrazione piuttosto elevata e lunghi tempi di esposizione ^16.

Data la novità del nanomateriale impiegato per questo lavoro, le principali caratteristiche del HNPS rispetto a / luminescenti bio-marcatori fluorescenti sono mostrati in una breve animazione computer originale realizzato dagli autori.

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Protocollo

1. Cultura e Espansione del CES umano

1. Preparare il mezzo di propagazione delle cellule (chiamata PM) contenente Knockout DMEM integrato con il 20% Knockout siero, 1% MEM non-aminoacidi essenziali, 1% di L-glutammina 200 mm, 1% penicillina-streptomicina e 3,5 microlitri β-mercaptoetanolo.
2. Scongelare ESC umane (hESC) in 8 ml di PM medio e centrifugare le 5 min a 115 xg per scartare DMSO-integrato medio di congelamento.
3. Aggiungere 1 ml di PM mezzo contenente 10 mM roccia inibitore per impedire l'apoptosi e migliorare la sopravvivenza cellulare dopo lo scongelamento (solo 24 ore di incubazione).
4. Aggiungere fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) al PM alla concentrazione desiderata (4-10 ng / ml) per il mantenimento della pluripotenza.
5. Piatto il hESC sul umana irradiati prepuzio cellule di alimentazione (γHFF) (Figura 1A), precedentemente placcato ad una concentrazione di 2 x 10 ⁴ cellule / cm ^2.
6. Cambiare medio giornaliero e, se necessario, rimuovere parti di colonies iniziando a differenziarsi per aspirazione usando una forma allungata taglio deciso pipetta Pasteur.
7. Una volta a settimana, colonie passaggio enzimaticamente:
   1. Rimuovere medie e lavare le colonie con 2 ml di PBS.
   2. Rimuovere PBS e incubare con 0.5 ml per pozzetto di caldo collagenasi IV a 1 mg / ml per 10 min a 37 ° C, 5% CO _2.
   3. Raccogliere i frammenti colonia in 2 ml nuovo PM e centrifugare a 115 xg per 3 min.
8. In alternativa, le colonie possono essere diversi passaggi meccanicamente mediante raschiatura:
   1. Rimuovere medie e lavare le colonie con 2 ml di PBS.
   2. Raschiare manualmente colonie utilizzando lo strumento raschietto rullo StemPro EZPassage (Figura 1B).
   3. Raccogliere frammenti colonia e poi centrifugare per 3 min a 115 xg per rimuovere il surnatante.
   4. Frammenti piastra su γHFF o li elaborano per la differenziazione in corpi embrionali (EBS).

2. ESC Differenziazione umanoProtocollo

1. Preparare il terreno di differenziamento (DM) utilizzando Knockout DMEM supplementato con siero Hyclone 2%, 1,0% MEM non-aminoacidi essenziali, 1,0% di L-glutammina 200 mm, 1% penicillina-streptomicina, 3,5 microlitri β-mercaptoetanolo.
2. Rimuovere medie e lavare le colonie con 2 ml di PBS.
3. La formazione EB di frammenti colonia in sospensione:
   1. Rimuovere PBS e incubare con 0.5 ml per pozzetto di caldo collagenasi IV a 1 mg / ml per 10 min a 37 ° C, 5% CO _2.
   2. Raccogliere i frammenti colonia in 2 ml nuovo DM e centrifugare a 115 xg per 3 min.
   3. Li coltura in sospensione in ultra-bassa allegato 6 pozzetti (2 ml per pozzetto) per 4 giorni (Figura 1C).
   4. Raccogliere e piastra EBS neoformati su 0,1% piastre da 24 pozzetti rivestiti di gelatina (circa 3 EBs / pozzetto) (Figura 1D).
4. In alternativa, forzata aggregazione di singole cellule nel EBs usando la piastra Aggrewell:
   1. Rimuovere PBS edissociare le colonie nelle singole cellule utilizzando accutase (0,5 ml / pozzetto).
   2. Centrifugare le cellule e risospendere in DM a 1.2 x 10 ⁶ / ml.
   3. Aggiungere 2 ml per camera Aggrewell per 1 giorno (Figura 1B ').
   4. Raccogliere EBs neoformati (Figura 1C ') e piatto su 0,1% piastre da 24 pozzetti rivestiti di gelatina (circa 3 EBs / pozzetto).
   5. Cambiare DM ogni 2-3 giorni fino alla comparsa di battere gruppi di cardiomiociti (15-30 giorni).

3. Culture 3D aria-liquido di battere cluster e di etichettatura con HNPS

1. Identificare e analizzare manualmente grappoli di battere cardiomiociti (Fig. 1D), di solito compaiono dopo 2-4 settimane di cultura, con una forma allungata drasticamente tagliato pipetta Pasteur.
2. Deposito 4 filtri in PTFE per inserto che verranno messi su una piastra da 6 pozzetti (Figura 1F).
3. Aggiungere 1 ml di terreno DM in cima each bene.
4. Aggiungi un cluster sezionato batte su ogni filtro PTFE (Figura 1E), massimo 4/well, cioè 24 aggregati per piastra (Figura 1F ').
5. Cambiare medio DM ogni 2-3 giorni.
6. Per etichettare i cluster, rimuovere il filtro PTFE contenente il cluster pestaggio e metterlo su 3,5 centimetri di vetro piatto fondo (170 micron di spessore).
7. Aggiungere 1 ml di HNP ad una concentrazione di 50 ug / ml per 30 min.

4. Imaging ottico non lineare

1. Preparazione del campione. Dopo l'etichettatura HNP (vedi punto 3.6), trasferire sia intere che differenziano primi HeBS o cluster battito cardiaco (sezionati su comparsa di contrazione), su filtri in PTFE su un piatto fondo di vetro di spessore 170 micron compatibile con la distanza di lavoro di obiettivi di apertura numerici elevati. In alternativa, applicare un rivestimento in diretta di battere cluster per il piatto fondo di vetro pre-rivestite con 0,1% di gelatina.
2. Campioni di trasferimento ad unall-in-one microscopio dotato di camera di incubazione assicurare temperatura stabile, umidità e CO ₂ controllo su periodi di tempo prolungati.
3. Ispezione iniziale, immagine dopo che il campione attraverso l'imaging a grande campo sotto illuminazione a luce bianca per identificare strutture di interesse all'interno EBs dissociati o cluster battitori attivi che saranno selezionati per ulteriori accertamenti.
4. Se autofluorescenza cellulare da NADH e SH da HNPS devono essere acquisite simultaneamente, impostare una lunghezza d'onda di eccitazione laser più corta (cioè 720 nm) per abbinare l'assorbimento molecolare. Utilizzare una stretta filtro passa-banda spettrale centrato a metà della lunghezza d'onda di eccitazione (cioè, λ = 360 ± 10 nm) per rilevare SH, e un altro per rilevare autofluorescenza.
5. Innanzitutto eseguire, bassa risoluzione veloce, scansione tridimensionale per ricostruire la morfologia complessiva del cluster cardiaca e selezionare un piano dell'immagine all'interno del volume cluster con vari visibile HNPs.
6. Se necessario, modificare la lunghezza d'onda di eccitazione liberamente abbinare meglio le proprietà ottiche del campione o per evitare photobleaching, danni fotografia e all'immagine più in profondità i tessuti con una lunghezza d'onda IR (ad esempio, 790 nm) e sostituire il secondo filtro armonico di conseguenza (ad esempio, 395 nm ). Ottimizzare le impostazioni del pre-compressore impulso laser alla lunghezza d'onda di lavoro di scelta massimizzando il secondo segnale armonico di HNPS depositati sul campione.
7. Per monitorare in tempo reale le contrazioni cardiache del cluster, impostare lo scanner ottico microscopio in modo più veloce come modo risonante, consentendo l'acquisizione ad alta velocità di immagini bidimensionali.
8. Scegliere le impostazioni come miglior compromesso tra contrasto dell'immagine e velocità di acquisizione, come ad esempio:
   • Media Scan: 4
   • Pixel tempo di sosta: 0.1 msec
   • Tasso Image: 3.75 fotogrammi al secondo (fps)
9. Potenza laser viene regolata in base alla focale punto sizzare e velocità di scansione. 50 mW (misurata all'ingresso dell'obiettivo) è un valore tipico per 0,1 msec pixel tempo di sosta e il piano APO 20X NA 0.75 obiettivo preservare la vitalità cellulare.

5. Image Analysis

1. Procedura di calibrazione assiale. Selezionare un singolo HNP depositato su un substrato nudo. Regolare il fuoco (cioè la posizione assiale della nanoparticella) per massimizzare l'intensità SH. Variare in modo controllato la posizione assiale della fase microscopio avere la curva di taratura relativa intensità SH in funzione del HNP disassato rispetto al piano focale. L'output di questa procedura di calibrazione per il 0,75 dell'obiettivo Piano APO 20X NA è riportato in Figura 4C.
2. Selezionare HNPS presenti in tutti i fotogrammi video e determinare i loro movimenti periodici. Questa procedura può essere facilmente automatizzato, ad esempio mediante un codice personalizzato in cerca di massimo segnale macchie di intensità in una regione definita di interesse ecollegandoli tra i diversi fotogrammi (un esempio di codice scritto in Matlab R2009 b utilizzando la funzione 'puntelli regione "del Toolbox Image Processing è presentato).
3. Valutare la quantificazione dei out-of-plane spostamenti, associati HNPS non continuo rintracciabili muove lungo l'asse ottico, convertendo le loro modulazioni di intensità per tutto differenti cornici in spostamento assiale utilizzando la curva di taratura nella Fase 5.1. Si noti che questa procedura permette di accedere ai movimenti assiali, ma non può essere utilizzata per determinare la direzione assoluta (verso l'alto o verso il basso).

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Risultati

Prima di valutare l'attività di battitura da confocale, è stata eseguita una accurata caratterizzazione della risposta ottica non lineare dei filtri in PTFE, da soli o in presenza di HNPS ad alta concentrazione (1 mg / ml). Si è assicurato che: i) il substrato nudo due fotoni di fluorescenza eccitata è molto debole e non può impedire misurazione relativi campioni biologici, e ii) l'emissione SH da HNPS isolato può essere facilmente acquisita da immagini attraverso il substrato in modo epi-rilevamento

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Discussione

L'applicazione delle nanotecnologie alla ricerca sulle cellule staminali è un settore relativamente nuovo, ma in rapida espansione. Come sottolineato da vari articoli di rassegna sull'argomento, l'uso di nanoparticelle può essere applicato per realizzare diversi compiti di ricerca, che vanno dalla cella di inseguimento (sia in vitro che in vivo), alla consegna intracellulare di proteine ​​e geni, non ultimo la creazione di ambienti cellulari biomimetici per preferenziale stimolazione / inibizi...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope Incubator	OKO LAB	UNO package (top stage)	37 °C, 5% CO2, moisturized
Multiphoton microscope	Nikon	AR1-MP
Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors
Filters SHG and autofluorescence	Semrock	FF01-360/12-25
FF01-395/11-25
FF02-485/20-25
Microscope objectives	Nikon
CFI Plan Fluor 10X			NA 0.30, WD 16 mm
CFI Plan Apo 20X			NA 0.75, WD 1.0 mm, VC
CFI Apo 40X			NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat
Rhock inhibitor	Sigma	Y-27632
Knockout DMEM	Invitrogen	10829
Knockout Serum	Invitrogen	10828
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	1140
L-glutamine 200 mM	Invitrogen	25030
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Roller scraper tool	StemPro EZPassage, Invitrogen	23181-010
StemPro Accutase	Gibco	S11105-01
Aggrewell system	StemCell Technologies	27845
Hyclone serum	Thermo Scientific	SH30070.03
Gelatin	Sigma	G9391
6-well plates	Falcon	353046
24-well plates	Nunclon	142475
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters	Millipore	NA76/25
Inserts	Millipore	PICM03050