JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Детали протокола предоставляются для лабораторного маркировки человеческих эмбриональных стволовых клеток с второй гармоники наночастиц генерирующих. Методологии чЭСК расследования многофотонной микроскопии и их дифференциации в сердечных кластеров также представлены.

Аннотация

В этом визуализируется эксперимента, подробно протокола предназначены для маркировки в пробирке человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) со вторыми наночастиц гармоники поколения (HNPs). Последние являются новое семейство датчиков недавно введенных для маркировки биологических образцов для визуализации многофотонной. HNPs способны удвоения частоты возбуждающего света в нелинейной оптической процессе генерации второй гармоники без ограничений по длине волны возбуждения.

Многофотонная основе методологии чЭСК дифференцировки в сердечных кластеров (поддерживается как долгосрочных воздух-жидкость культур) представлены в деталях. В частности, данные о том, как максимально интенсивный второй гармоники (SH) эмиссию изолированных HNPs в режиме 3D мониторинга избиении сердечную ткань в 3D показана. Анализ полученных изображений для получения 3D моделей смещения также подробно.

Введение

Нелинейные системы микроскопии, благодаря присущей им трехмерных возможностей секционирующих, все чаще срабатывает спрос на фото-стабильным флуорофорами с полос поглощения двух фотонов в ближней инфракрасной. Только в последние пару лет, в дополнение к развитию флуоресценции основе меток (красителей, квантовых точек, до-превращающего наночастицы), другая методология изображений эксплуатирует использование нового семейства по своей сути нелинейных наночастиц в качестве меток, т.е. гармонические наночастицы (HNPs), которые были специально разработаны для многофотонной микроскопии. Эти метки, основанные на неорганических нецентросимметричных кристаллов, оказывать оптический контраст, генерирующий SH частоты возбуждения: например, преобразования долю ближайшем инфракрасном свете импульсного возбуждения (λ = 800 нм) в видимый синий свет (λ / 2 = 400 нм) . Некоторые авторы в недавнем прошлом испытывали различные материалы, в том числе железа иодата Fe (IO 3) 3 1, ниобата калия (KNbO 3) 2, ниобата лития (LiNbO 3) 3, титанат бария (BaTiO 3) 4,5, титанил фосфат калия (KTiOPO4, КТП) 6-8, и оксид цинка (ZnO ) 5,9,10. По сравнению с флуоресцентных зондов, HNPs обладают рядом привлекательных свойств, таких как полное отсутствие обесцвечивания и мигает, узких полос излучения, возбуждения длин волн управляемость (от ультрафиолетового до инфракрасного), возможностью поиска ориентация, и когерентного оптического отклика. Эти уникальные свойства были недавно объяснил в двух общеобразовательных обзорных статьях 11,12. Возможность работы в инфракрасной области спектра, что увеличивает глубину обработки изображений, минимизируя рассеяния и поглощения, также резко ограничивает образец деградации просмотром 13,14. Кроме того, бесконечно фото-стабильный сигнал гарантируется HNPs делает их идеальными зонды для отслеживания долгосрочных клеток, которые яы особенно привлекательным для регенеративной медицины приложений 15.

В этом визуализируется эксперимента, подробно протокола предназначены для маркировки в пробирке человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) с нефункционализованного HNPs. Синтез и подготовка коллоидных суспензий, подробно изложены в предыдущей публикации и в ссылках в нем 16 и выходит за рамки данной работы. Методологии чЭСК расследования многофотонной микроскопии и их дифференциации в сердечных кластеров (поддерживается как долгосрочных воздух-жидкость культур) представлены. Человеком ESC можно позволить дифференцировать в пределах так называемых эмбриональных телец (EBS) двумя различными способами либо путем формирования EB колониеобразующих фрагментов в суспензии или, альтернативно, вынужденных агрегацию отдельных клеток в ЭТ с помощью Aggrewell пластины, как показано на фиг.1А . Культивирование избиении кластеры клеток сердца политетрафторэтилена (ПТФЭ) пористые фильтры факторilitates их долгосрочной эксплуатации для дальнейших исследований (например электрофизиологические измерения потенциалов действия).

Источником возбуждения сканирующего микроскопа должны быть способны доставить ультракоротких импульсов (с длительностью импульса, меньшей 300 фс на образце), чтобы достичь пиковую мощность, необходимую для выполнения второй гармоники визуализации HNPs. Например, наиболее распространенным фс-источник используется для работы с изображениями можно настраивать Ti: Sapphire лазеры. С другой стороны, другие сверхбыстрые лазеры могут быть использованы, например иона эрбия 17, хром форстеритом 18 или титан-сапфирового закачивается инфракрасных оптических параметрических генераторов. Микроскоп может быть оснащен объективом с предпочтительно достаточно высокой числовой апертурой. Очень важно, до измерений, и каждый раз цель заменяется, он является обязательным, чтобы минимизировать дисперсии, присутствующий в настройки (линзы) за счет оптимизации настроек лазерного импульса предварительной компрессора на работыдлина волны выбора. Эта процедура, подробно описаны в протоколе, гарантирует, что лазерный импульс является как можно ближе к преобразованию ограниченный срок (то есть самый короткий, насколько это возможно) в фокальной плоскости и максимизирует образец нелинейный отклик.

Цель анализа изображения, описанного в конце протокола является для выявления и отслеживания в движениях 3D HNPs связанных с ритмическими сокращениями избиении сердечные кластеров. Отслеживание наночастицы в плоскости изображения просто реализуется путем выявления их позиции в последовательных кадров фильма. Чтобы извлечь информацию о осевого перемещения, до калибровка ответ нелинейной интенсивности в зависимости от осевого смещения является обязательным. Заметим, что для долгосрочных измерений, для активного интерферометрического контроля образца осевом положении обязан поддерживать справедливость калибровочной кривой в присутствии тепловых и / или механических заносов.

В HNPs используемые здесь, чтобы ПРОФэ избиение клетки внутри агрегатов на основе оксида ниобата калия (KNbO 3), но и другие доступные нелинейные наноматериалы подробно рассмотрены в работе Staedler др. 16.

Нелинейные оптические эффективность большинства из наноматериалов исследованных до сих пор очень сопоставимы. Выбор для KNbO 3 по существу мотивировано хорошей стабильности коллоидного раствора и хорошей биосовместимости, протестированных на нескольких клеточных линий человека даже при довольно высокой концентрации и длительным временем экспозиции 16.

Учитывая новизну наноматериала, применяемого для этой работы, основные характеристики HNPs по сравнению с люминесцентными / люминесцентных биомаркеров показаны на короткий оригинальной компьютерной анимации видео реализованного авторами.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Культура и расширения человеческих ЭСК

  1. Подготовка среда распространения клеток (так называемый PM), содержащий Нокаут DMEM с добавлением 20% нокаут сыворотки, 1% MEM незаменимых аминокислот, 1% L-глутамина 200 мм, 1% пенициллина-стрептомицина и 3,5 мкл β-меркаптоэтанола.
  2. Оттепель человека ESC (чЭСК) в 8 мл PM среды и отцентрифугированы 5 мин при 115 х г отбросить ДМСО-дополняется замораживания среды.
  3. Добавьте 1 мл PM среде, содержащей 10 мМ Рок ингибитор для предотвращения апоптоза и улучшить выживаемость клеток при оттаивании (только с 24 часами инкубации).
  4. Добавить основной фактор роста фибробластов (оФРФ) в ПМ в нужной концентрации (4-10 нг / мл) для поддержания плюрипотентности.
  5. Тарелка с чЭСК на облученного крайней плоти человека фидерных клеток (γHFF) (рис. 1А), ранее покрытая в концентрации 2 х 10 4 клеток / см 2.
  6. Изменение средней ежедневно и, при необходимости, удалять части сolonies начинают дифференцироваться стремлением использовании удлиненную резко сократить пипетки Пастера.
  7. Раз в неделю, прохождение колонии ферментативно:
    1. Удалите среду и мыть колонии с 2 мл PBS.
    2. Удаление PBS и инкубировали их с 0,5 мл на лунку теплой коллагеназы IV в 1 мг / мл в течение 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
    3. Сбор колонии фрагменты в 2 мл новая PM и центрифуги при 115 мкг в течение 3 мин.
  8. С другой стороны, колонии можно пассировать механически путем соскабливания:
    1. Удалите среду и мыть колонии с 2 мл PBS.
    2. Вручную очистить колонии, используя StemPro EZPassage ролик скребка инструмент (рис. 1В).
    3. Сбор колонии фрагменты и затем центрифугируют в течение 3 мин при 115 х г для удаления супернатанта.
    4. Пластинчатые фрагменты на γHFF или обрабатывать их для дифференцировки в эмбриональных телец (ЭТ).

2. Человека ESC ДифференциацияПротокол

  1. Подготовка дифференциация среднего (ДМ) с помощью Нокаут DMEM с добавлением 2% Hyclone сыворотки, 1,0% MEM незаменимых аминокислот, 1,0% L-глутамина 200 мм, 1% пенициллина-стрептомицина, 3,5 мкл β-меркаптоэтанола.
  2. Удалите среду и мыть колонии с 2 мл PBS.
  3. Формирование EB колониеобразующих фрагментов в виде суспензии:
    1. Удаление PBS и инкубировали их с 0,5 мл на лунку теплой коллагеназы IV в 1 мг / мл в течение 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
    2. Сбор колонии фрагменты в 2 мл новая DM и центрифуги при 115 мкг в течение 3 мин.
    3. Культура их в виде суспензии в сверхнизким прикрепления 6-луночные планшеты (2 мл на лунку) в течение 4 дней (фиг. 1С).
    4. Сбор и пластины вновь образованных ЭТ на 0,1% покрытые желатином 24-луночных планшетах (около 3 ЭТ / лунку) (рис. 1D).
  4. С другой стороны, вынужден агрегацию отдельных клеток в ЭТ помощью Aggrewell тарелку:
    1. Удалить PBS идиссоциировать колонии на отдельные клетки с помощью Accutase (0,5 мл / лунку).
    2. Центрифуга и ресуспендирования клеток в DM на 1,2 х 10 6 / мл.
    3. Добавить 2 мл на Aggrewell камере в течение 1 дня (рис. 1В ').
    4. Сбор вновь образованных ЭТ (Рис. 1C ') и пластины их на 0,1% покрытые желатином 24-луночных планшетах (около 3 ЭТ / лунку).
    5. Измените DM каждые 2-3 дня до появления бить кластеры кардиомиоцитов (15-30 дней).

3. Воздушно-жидкостной 3D Культуры Избиение Кластеры и маркировка с HNPs

  1. Выявление и вручную анализировать кластеры избиения кардиомиоцитов (рис. 1D), как правило, появляются через 2-4 недели культуры, используя удлиненный резко сократить пипетки Пастера.
  2. Депозитные 4 PTFE фильтров на вставки, которые будут размещены на 6-луночный планшет (рис. 1F) в.
  3. Добавьте 1 мл DM среды на вершине EACч хорошо.
  4. Добавьте одну расчлененный избиение кластер на каждой ПТФЭ фильтра (Рисунок 1E), максимальное 4/well, т.е. 24 агрегатов на чашку (рис. 1F ").
  5. Изменение DM среды каждые 2-3 дня.
  6. Чтобы пометить кластеры, удалить ПТФЭ фильтр, содержащий бьющееся кластер и положил его на 3,5 см со стеклянным дном блюдо (толщиной 170 мкм).
  7. Добавить 1 мл НПГ в концентрации 50 мкг / мл в течение 30 мин.

4. Нелинейные оптические изображений

  1. Подготовка образца. После ГНП маркировка (см. шаг 3.6), передать либо целые дифференцирующие ранние HeBS или сердечная избиение кластеров (расчлененные на сокращения появления) на фильтрах PTFE над толстым стеклянным дном блюдо 170 мкм, совместимым с рабочим расстоянием высоких целей числовой апертурой. В качестве альтернативы, применять прямое покрытие бить кластеров к стеклянным дном тарелки, предварительно покрытых 0,1% желатином.
  2. Образцы Переезд ввсе-в-одном микроскопа, снабженного инкубации камеру обеспечения стабильной температуры, влажности и CO 2 контроль над длительных периодов времени.
  3. После первоначального осмотра, изображение образца с помощью визуализации широкого поля под освещении белым светом для выявления структуры интересов в рамках дифференцированных ЭТ или активных кластеров избиение, которые будут отобраны для дальнейших исследований.
  4. Если клетка аутофлюоресценция от NADH и SH от HNPs должны быть одновременно приобрел, установить более короткую длину волны лазерного возбуждения (т.е. 720 нм) в соответствии с молекулярной абсорбции. Использование одного узкий полосовой фильтр спектрального центром в половину длины волны возбуждения (т.е. λ = 360 ± 10 нм) для обнаружения SH, а другой для обнаружения аутофлюоресценция.
  5. Во-первых выполнить быстро, низкое разрешение, трехмерное сканирование, чтобы восстановить общую морфологию сердца кластера и выберите плоскость изображения в объеме кластера с несколькими видимого ГНПс.
  6. При необходимости изменить длины волны возбуждения свободно для наилучшего соответствия оптические свойства образца, или чтобы избежать фотообесцвечивания, фото ущерб и имиджу глубже в тканях с ИК длины волны (то есть, 790 нм) и заменить второй фильтр гармоник соответственно (то есть, 395 нм ). Оптимизация настройки лазерного импульса предварительной компрессора при рабочей длине волны выбора, максимизируя второй гармоники сигнала HNPs нанесенных на образце.
  7. Для мониторинга в реальном времени сердечные кластера сокращений, установите микроскоп оптический сканер в быстрый режим, такой как резонансном режиме, что позволяет высокая скорость приобретение двумерных изображений.
  8. Выберите режим как наилучший компромисс между контраста изображения и скорости приобретения, такие как:
    • Сканирование усреднения: 4
    • Pixel время выдержки: 0.1 мкс
    • Скорость изображения: 3.75 кадров в секунду (FPS)
  9. Мощность лазера корректируется в зависимости от фокусного пятна сИзе и скорость сканирования. 50 мВт (измеряется на входе в цель) является типичным значением для 0,1 мкс пикселей времени пребывания и Плана APO 20X NA 0.75 цели, сохраняя жизнеспособность клеток.

5. Анализ изображений

  1. Осевая процедура калибровки. Выберите одну ГНП, нанесенный на голой подложки. Настройте фокус (т.е. осевого положения наночастицы) для максимизации интенсивности SH. Vary контролируемым образом осевое положение столик микроскопа для получения калибровочной кривой, относящуюся интенсивность SH в зависимости от ГНП, смещенной от фокальной плоскости. Выход этого процедуры калибровки для План APO 20X NA 0.75 целью Сообщается на фиг.4С.
  2. Выберите HNPs присутствует во всех видеокадров и определить их периодических движений. Эта процедура может быть легко автоматизирована, например, с помощью пользовательского кода ищет для пятен интенсивности максимального сигнала в определенной области, представляющей интерес, исоединяя их между различными кадрами (пример кода, написанного на Matlab R2009 б с помощью функции "область реквизит" обработки изображения Toolbox представлена).
  3. Оценка количественного определения из собственного плоскости перемещений, связанных с не-постоянно отслеживаемые HNPs перемещения вдоль оптической оси, путем преобразования их модуляции интенсивности на протяжении разных в осевом смещении с помощью калибровочной кривой, установленный на шаге 5.1. Следует отметить, что эта процедура дает доступ к осевых перемещений, но не могут быть использованы для определения абсолютного направление (вверх или вниз).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

До оценки биений активности по конфокальной микроскопии, тщательный характеристика нелинейного оптического отклика ПТФЭ фильтра была выполнена, либо отдельно, либо в присутствии HNPs при высокой концентрации (1 мг / мл). Было обеспечено: я) обнаженного субстрата двухфотонного рады флуор?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Применение нанотехнологий для исследования стволовых клеток является относительно новым, но быстро расширяется поле. Как отметил различных обзорных статей по этой теме, использование наночастиц может применяться для выполнения различных исследовательских задач, начиная от клетки о...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность за частичное финансирование от Европейского FP7-исследовательского проекта NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) и проекта INTERREG IV Франция-Швейцария NAOMI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Microscope IncubatorOKO LABUNO package (top stage)37 °C, 5% CO2, moisturized
Multiphoton microscopeNikonAR1-MP
Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors
Filters SHG and autofluorescenceSemrockFF01-360/12-25
FF01-395/11-25 
FF02-485/20-25
Microscope objectivesNikon
CFI Plan Fluor 10XNA 0.30, WD 16 mm
CFI Plan Apo 20XNA 0.75, WD 1.0 mm, VC
CFI Apo 40XNA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat
Rhock inhibitor SigmaY-27632
Knockout DMEMInvitrogen10829
Knockout Serum Invitrogen10828
MEM Non-Essential Amino Acids Invitrogen1140
L-glutamine 200 mM Invitrogen25030
Penicillin-streptomycinInvitrogen15140
β-mercaptoethanol SigmaM7522
Collagenase IV Gibco17104-019
Roller scraper tool StemPro EZPassage, Invitrogen23181-010
StemPro Accutase GibcoS11105-01
Aggrewell system StemCell Technologies27845
Hyclone serum Thermo ScientificSH30070.03
GelatinSigmaG9391
6-well plates Falcon353046
24-well plates Nunclon142475
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filtersMilliporeNA76/25
InsertsMilliporePICM03050

Ссылки

  1. Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
  2. Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
  3. Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
  4. Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
  5. Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
  6. Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
  7. Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
  8. Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
  9. Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
  10. Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
  11. Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
  12. Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
  13. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
  14. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  15. Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
  16. Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
  17. Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
  18. Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
  19. Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
  20. Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
  21. Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
  22. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
  23. Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
  24. Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
  25. Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
  26. Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
  27. Haase, M., Schafer, H. Upconverting nanoparticles. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).
  28. Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
  29. Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

87EBS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены