Harmonic Nanopartículas Regenerativa Research

Resumo

Detalhes do protocolo estão previstas in vitro de células-tronco embrionárias humanas em matéria de rotulagem com a segunda geração de nanopartículas harmônicas. Também são apresentadas as metodologias de investigação hESC por microscopia multi-fotão e sua diferenciação em aglomerados cardíacas.

Resumo

Neste experimento visualizados, detalhes do protocolo são fornecidos para marcação in vitro de células-tronco embrionárias humanas (hESC) com nanopartículas de geração harmônica segundo (HNPs). Estes últimos são uma nova família de sondas introduzidas recentemente para a rotulagem de amostras biológicas para imagens multi-fotão. HNPs são capazes de dobrar a freqüência de luz de excitação pelo processo de óptica não-linear de geração de segundo harmônico, sem restrição do comprimento de onda de excitação.

Multi-fóton metodologias para hESC diferenciação em clusters cardíacos (mantidos como culturas de ar líquido longo prazo) com base são apresentados em detalhe. Em particular, as evidências sobre como maximizar a intensa segundo harmônico (SH) emissão de HNPs isoladas durante o monitoramento 3D de bater o tecido cardíaco em 3D é exibido. A análise das imagens resultantes para obter padrões de deslocamento 3D também é detalhado.

Introdução

Sistemas de microscopia não-lineares, graças às suas inerentes três capacidades de seccionamento dimensionais, têm cada vez desencadeada a demanda por fluoróforos foto-estável, com bandas de absorção de dois fótons do infravermelho próximo. Só no último par de anos, para complementar o desenvolvimento de rótulos baseados em fluorescência (corantes, pontos quânticos, a converter nanopartículas), uma metodologia diferente de imagem vem explorando o uso de uma nova família de nanopartículas inerentemente não-lineares como rótulos, ou seja, nanopartículas de harmônicas (HNPs) que foram desenvolvidos especificamente para microscopia multi-fotão. Esses rótulos, baseadas em cristais inorgânicos, noncentrosymmetric exercer contraste óptico gerando o SH da freqüência de excitação: por exemplo, através da conversão de uma fração de perto a luz de excitação pulsada infravermelho (λ = 800 nm) para a luz azul visível (λ / 2 = 400 nm) . Vários autores no passado recente têm testado diferentes materiais, incluindo iodato de ferro Fe (IO _{3) 3 ^1, niobato de potássio (KNbO 3) ^2, de niobato de lítio (LiNbO 3) ^3, o titanato de bário (BaTiO3) ^4,5, fosfato de potássio de titanilo (KTiOPO4, KTP) ^6-8, e o óxido de zinco (ZnO ) ^5,9,10. Em comparação com sondas fluorescentes, HNPs possuem uma série de propriedades interessantes, como ausência completa de branqueamento e piscando, bandas de emissão estreitas, tunability excitação-comprimento de onda (do ultravioleta ao infravermelho), a capacidade de recuperação de orientação e resposta óptica coerente. Estas propriedades únicas foram recentemente explicou em dois artigos de revisão abrangente ^11,12. A possibilidade de trabalhar na região espectral do infravermelho, o que aumenta a profundidade da imagem, minimizando a dispersão e absorção, também limita drasticamente a degradação foto da amostra ^13,14. Além disso, o sinal de foto-estável infinitamente garantida pelo HNPs torna sondas ideais para rastreamento de células de longo prazo, que ié particularmente atraente para aplicações de medicina regenerativa ^15.}

Neste experimento visualizados, detalhes do protocolo são fornecidos para marcação in vitro de células-tronco embrionárias humanas (hESC) com HNPs não funcionalizados. A síntese e preparação de suspensões coloidais é detalhado em publicação anterior e em referências citadas ¹⁶ e está fora do escopo deste trabalho. Metodologias de investigação hESC por microscopia multi-fotão e sua diferenciação em clusters cardíacos (mantidos como culturas de ar líquido longo prazo) são apresentados. CES humana pode ser deixado para diferenciar dentro chamados corpos embrióides (EBS) de duas maneiras diferentes, ou por formação de EB fragmentos de colónias em suspensão ou, em alternativa, a agregação de células individuais em EB utilizando a placa Aggrewell forçados, como ilustrado na Figura 1A . Cultivar batendo aglomerados de células cardíacas com politetrafluoretileno (PTFE) filtros porosos facilitates sua manutenção a longo prazo para estudos posteriores (por exemplo medidas eletrofisiológicas de potenciais de ação).

A fonte de excitação do microscópio de varrimento deve ser capaz de fornecer impulsos de ultrashort (com uma duração de impulso mais pequena do que 300 FSEC na amostra), a fim de atingir a potência de pico necessária para realizar segunda imagem harmónica de HNPs. Por exemplo, o FSEC-fonte mais comum usado para geração de imagens são ajustáveis ​​Ti: Safira lasers. Alternativamente, outros lasers ultra-rápidos podem ser empregados, por exemplo, de íons de érbio ^17, cromo forsterite ¹⁸ ou Ti: Safira bombeado infravermelhos osciladores paramétricos ópticos. O microscópio pode ser equipado com uma objectiva com uma preferência relativamente elevada abertura numérica. Muito importante, antes de medições, e cada vez que o objetivo é substituído, é obrigatório para minimizar a dispersão presente no set-up (lentes), otimizando as configurações do pulso de laser pré-compressor no trabalhocomprimento de onda de escolha. Este procedimento, detalhado no protocolo, garante que o impulso de laser, é o mais próximo possível para o transformar duração limitada (ou seja, mais curto quanto possível) no plano focal e maximiza a resposta da amostra não-linear.

O objectivo da análise de imagem descrito no final do protocolo é a identificar e controlar os movimentos em 3D HNPs associados com as contracções rítmicas do bater aglomerados cardíacas. Nanopartículas de rastreamento no plano de imagem é simplesmente realizado através da identificação de suas posições em quadros do filme sucessivos. Para extrair a informação sobre o movimento axial, uma calibração prévia da resposta não linear da intensidade como uma função do deslocamento axial é obrigatório. Note-se que para a medição a longo prazo, um controlo activo interferométrico da posição axial da amostra é requerida para manter a validade da curva de calibração, na presença de desvios térmicos e / ou mecânicos.

Os HNPs utilizados aqui para traccélulas e batendo nos agregados são baseados em óxido de potássio niobato (KNbO _3), mas outros nanomateriais não lineares disponíveis são analisados ​​em detalhe no trabalho de Staedler et al ^16.

As eficiências ópticos não-lineares da maioria dos nanomateriais investigados até agora são muito comparáveis. A escolha para KNbO ₃ foi motivado essencialmente pela boa estabilidade da solução coloidal e sua boa biocompatibilidade, testado em várias linhas de células humanas, mesmo em concentração razoavelmente elevada e longos tempos de exposição ^16.

Dada a novidade do nanomaterial empregada para este trabalho, as principais características do HNPs em comparação com / luminescentes bio-marcadores fluorescentes são mostrados em uma animação de vídeo original do computador curta realizado pelos autores.

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Protocolo

1. Cultura e Expansão da ESC Humano

1. Preparar o meio de propagação da célula (chamado PM) contendo Knockout DMEM suplementado com 20% de Soro KO, 1% MEM não-aminoácidos essenciais, 1% de L-glutamina 200 mM, 1% de penicilina-estreptomicina, e 3,5 ul β-mercaptoetanol.
2. Descongele ESC humana (hESC) em 8 ml de meio PM e centrifugar para 5 min a 115 xg para descartar suplementados com DMSO meio de congelamento.
3. Adicione 1 ml de meio PM contendo 10 inibidor Rocha mM para evitar a apoptose e melhorar a sobrevivência das células após a descongelação (apenas 24 incubação h).
4. Adicionar o factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), para a AM para a concentração desejada (4-10 ng / ml) para a manutenção da pluripotência.
5. Semear a células estaminais embrionárias humanas no prepúcio humano irradiado células alimentadoras (γHFF) (Figura 1A), anteriormente colocadas em placas a uma concentração de 2 x 10 ⁴ células / cm ^2.
6. Mude média diária e, quando necessário, remover partes colonies começando a diferenciar por aspiração com uma pipeta de Pasteur acentuadamente alongada cortada.
7. Uma vez por semana, colônias passagem enzimaticamente:
   1. Remover o meio e lava-se as colónias, com 2 ml de PBS.
   2. Remover PBS e incubar com 0,5 ml por poço de quente colagenase IV a 1 mg / ml durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   3. Coletar fragmentos de colônias em 2 ml novo PM e centrifugar a 115 xg por 3 min.
8. Alternativamente, as colónias podem ser passadas através de raspagem mecânica:
   1. Remover o meio e lava-se as colónias, com 2 ml de PBS.
   2. Raspar manualmente colónias usando a ferramenta rolo raspador StemPro EZPassage (Figura 1B).
   3. Recolher fragmentos de colónias e depois centrifugar durante 3 minutos a 115 xg para remover o sobrenadante.
   4. Fragmentos de placa em γHFF ou processá-los para a diferenciação em corpos embrióides (EBS).

2. Diferenciação ESC HumanoProtocolo

1. Preparar o meio de diferenciação (MS) usando Knockout DMEM suplementado com 2% de soro de Hyclone, 1,0% MEM não-aminoácidos essenciais, 1,0% de L-glutamina 200 mM, 1% de penicilina-estreptomicina, 3,5 ul β-mercaptoetanol.
2. Remover o meio e lava-se as colónias, com 2 ml de PBS.
3. EB formação de fragmentos de colônias em suspensão:
   1. Remover PBS e incubar com 0,5 ml por poço de quente colagenase IV a 1 mg / ml durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
   2. Coletar fragmentos de colônias em 2 ml novo DM e centrifugar a 115 xg por 3 min.
   3. Cultura los em suspensão em ultra-baixo de fixação placas de 6 poços (2 ml por poço) durante 4 dias (Figura 1C).
   4. Recolha e placa os CEs recém formados em 0,1% revestidas com gelatina de 24 poços, placas (cerca de 3 EB / poço) (Figura 1D).
4. Alternativamente, a agregação de células individuais forçado a EBS usando a placa Aggrewell:
   1. Remover PBS edissociar colónias em células individuais utilizando Accutase (0,5 ml / poço).
   2. Centrifugar células e ressuspender em DM em 1.2 x 10 ⁶ / ml.
   3. Adicionar 2 ml por Aggrewell câmara durante 1 dia (Figura 1B).
   4. Recolhe CEs recém-formados (Fig. 1C ') e placa-los em 0,1% revestidos com gelatina placas de 24 poços (cerca de 3 EB / poço).
   5. Mude DM a cada 2-3 dias até o aparecimento de bater aglomerados de cardiomiócitos (15-30 dias).

3. Ar líquidos culturas 3D de batendo Clusters e Rotulagem com HNPs

1. Identificar e manualmente dissecar aglomerados de batendo cardiomiócitos (Figura 1D), normalmente aparecem após 2-4 semanas de cultura, utilizando uma pipeta Pasteur alongada cortou drasticamente.
2. Depósito 4 filtros de PTFE por pastilha, que serão colocados em uma placa de 6 poços (Figura 1F).
3. Adicione 1 ml de meio de DM em cima de each bem.
4. Adicionar um grupo dissecado batendo em cada filtro de PTFE (Figura 1E), máxima 4/well, ou seja, 24 agregados por placa (Figura 1F).
5. Mude médio DM cada 2-3 dias.
6. Para identificar os clusters, retire o filtro PTFE contendo o cluster surra e colocá-lo em 3,5 centímetros prato de vidro de fundo (170 mm de espessura).
7. Adicionar 1 ml de PNH a uma concentração de 50 ug / ml durante 30 min.

4. Imagem óptico não-linear

1. A preparação das amostras. Após a marcação PNH (ver passo 3.6), transferir ou inteiro diferenciadores HeBS início ou clusters batimento cardíaco (dissecados na aparência contração) em filtros de PTFE sobre um prato de 170 mm de espessura com fundo de vidro compatível com a distância de trabalho de altos objetivos abertura numérica. Como alternativa, aplique uma camada de bater direto clusters para o prato fundo de vidro pré-revestido com 0,1% de gelatina.
2. Amostras de transferência para umatudo-em-um microscópio equipado com câmara de incubação garantindo temperatura estável, umidade e CO ₂ controle ao longo de períodos de tempo prolongados.
3. Após a inspeção inicial, a imagem da amostra através de imagens de campo amplo com iluminação de luz branca para identificar as estruturas de interesse dentro EBs diferenciados ou clusters batendo ativos que serão selecionados para posteriores investigações.
4. Se a autofluorescência das células a partir de NADH e SH de HNPs tem que ser adquirido simultaneamente, defina um menor comprimento de onda de excitação de laser (isto é, 720 nm) para coincidir com a absorção molecular. Use um filtro passa-banda espectral estreita centrada na metade do comprimento de onda de excitação (ou seja, λ = 360 ± 10 nm) para detectar SH, e outro para detectar autofluorescência.
5. Em primeiro lugar fazer uma, de baixa resolução rápida, digitalização tridimensional para reconstruir a morfologia geral do cluster cardíaca e selecionar um plano de imagem dentro do volume de cluster com vários PNH visívels.
6. Se necessário, altere o comprimento de onda de excitação livremente para melhor corresponder propriedades ópticas da amostra ou para evitar a fotodegradação, danos foto e imagem mais profunda nos tecidos, com um comprimento de onda IR (ou seja, 790 nm) e substituir o segundo filtro de harmônicas em conformidade (ou seja, 395 nm ). Otimizar as configurações do pulso de laser pré-compressor no comprimento de onda de trabalho de escolha, maximizando o segundo sinal harmônico de HNPs depositados na amostra.
7. Para acompanhar em tempo real as contrações cardíacas de cluster, configure o scanner óptico do microscópio no modo mais rápido, como o modo de ressonância, permitindo a aquisição de alta velocidade de imagens bidimensionais.
8. Escolha as configurações como melhor compromisso entre o contraste de imagem e velocidade de aquisição, tais como:
   • Média de digitalização: 4
   • Pixel tempo de permanência: 0,1 ms
   • Taxa Image: 3,75 frames por segundo (fps)
9. Poder do laser é ajustada de acordo com focal local size e velocidade de varredura. 50 mW (medido na entrada da objectiva) é um valor típico de 0,1 ms de pixel do tempo de permanência e Plano APO 20X NA 0,75 objectivo preservando a viabilidade celular.

5. Image Analysis

1. Procedimento de calibração Axial. Selecione uma única PNH depositados sobre um substrato nu. Ajustar a focagem (isto é, a posição axial da nanopartícula) para maximizar a intensidade SH. Variar de uma forma controlada a posição axial do estágio de microscópio para obter a curva de calibração relativa intensidade SH como uma função da PNH deslocada do plano focal. O resultado deste procedimento de calibração para o objectivo 0,75 Plano APO 20X NA está relatado na Figura 4C.
2. Selecione HNPs presentes em todos os quadros de vídeo e determinar seus movimentos periódicos. Este procedimento pode ser facilmente automatizado, por exemplo, um código personalizado em busca de pontos de sinal máxima intensidade em uma região definida de interesse econectá-los entre quadros diferentes (um código de exemplo escrito em Matlab R2009 b usando a função 'adereços região da caixa de ferramentas de processamento de imagem é apresentada).
3. Avaliar a quantificação dos deslocamentos fora do plano, associadas HNPs não rastreáveis ​​continuamente em movimento ao longo do eixo óptico, através da conversão de suas modulações de intensidade ao longo de quadros diferentes para o deslocamento axial utilizando a curva de calibração estabelecida no Passo 5.1. Note-se que este procedimento dá acesso aos movimentos axiais, mas não pode ser utilizada para determinar a orientação absoluta (para cima ou para baixo).

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Resultados

Antes de avaliar a actividade de batimento de imagiologia confocal, uma caracterização cuidadosa da resposta óptica não-linear dos filtros de PTFE foi realizada, quer isoladamente ou na presença de HNPs em concentração elevada (1 mg / ml). Assegurou-se que: i) o substrato utilizando dois fotões fluorescência animado é muito fraca e não pode impedir a medição das amostras biológicas relevantes, e ii) a emissão SH de HNPs isolados podem ser facilmente adquiridos por imagiologia através do substrato no modo...

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Discussão

A aplicação da nanotecnologia à investigação em células estaminais é um relativamente novo, mas em rápida expansão campo. Como foi assinalado por vários artigos de revisão sobre o assunto, o uso de nanopartículas pode ser aplicada para realizar tarefas diferentes de pesquisa, variando a partir de células de monitoramento (tanto in vitro como in vivo), para a distribuição intracelular de proteínas e genes, não menos importante, a criação de ambientes celulares biomiméticos para prefe...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope Incubator	OKO LAB	UNO package (top stage)	37 °C, 5% CO2, moisturized
Multiphoton microscope	Nikon	AR1-MP
Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors
Filters SHG and autofluorescence	Semrock	FF01-360/12-25
FF01-395/11-25
FF02-485/20-25
Microscope objectives	Nikon
CFI Plan Fluor 10X			NA 0.30, WD 16 mm
CFI Plan Apo 20X			NA 0.75, WD 1.0 mm, VC
CFI Apo 40X			NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat
Rhock inhibitor	Sigma	Y-27632
Knockout DMEM	Invitrogen	10829
Knockout Serum	Invitrogen	10828
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	1140
L-glutamine 200 mM	Invitrogen	25030
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Roller scraper tool	StemPro EZPassage, Invitrogen	23181-010
StemPro Accutase	Gibco	S11105-01
Aggrewell system	StemCell Technologies	27845
Hyclone serum	Thermo Scientific	SH30070.03
Gelatin	Sigma	G9391
6-well plates	Falcon	353046
24-well plates	Nunclon	142475
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters	Millipore	NA76/25
Inserts	Millipore	PICM03050