Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina

Resumen

Protocolos de inmunohistoquímica se utilizan para estudiar la localización de una proteína específica en la retina. Se emplean técnicas de imagen de calcio para estudiar la dinámica del calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

Resumen

En este trabajo se describen las herramientas, los reactivos y las medidas prácticas que se necesitan para: 1) preparación exitosa de retinas wholemount para inmunohistoquímica y, 2) imágenes de calcio para el estudio de los canales de calcio dependientes de voltaje (VGCC) mediada por la señalización de calcio en la retina células ganglionares. El método de imagen de calcio describimos elude cuestiones relativas a la carga no específico de células amacrinas desplazadas en la capa de células ganglionares.

Introducción

Las células ganglionares de la retina (CGR) expresan L, N, P / Q y de tipo T VGCC como se determina a través del bloqueo farmacológico de estos componentes de la célula entera Ca canal actual ^1,2. VGCC son proteínas multiméricas transmembrana que están implicados en la liberación del transmisor, la transcripción de genes, la regulación celular y ^3,4,5 plasticidad sináptica. VGCCs funcionales se componen de al menos tres clases distintas de subunidades: grandes, transmembrana α ₁ formador de poros subunidades que establecen propiedades biofísicas y farmacológicas del canal, principalmente extracelular auxiliar α ₂ δ subunidades y las subunidades β intracelulares. Los dos últimos complejos heteroméricos forma con diferentes subunidades α ₁ y alterar la cinética de activación periódica y el tráfico de los canales a la membrana plasmática ^6.

En las últimas décadas, muchas técnicas se han empleado para estudiar la proteína expresión, como la inmunohistoquímica, ensayo inmunoenzimático, el análisis occidental y citometría de flujo. Estas técnicas requieren el uso de anticuerpos específicos para la detección de una proteína dada de interés y proporcionan potentes herramientas para la localización y distribución de proteínas específicas en diferentes tejidos. Las técnicas utilizadas para detectar y cuantificar los niveles de expresión de ARNm de una proteína en particular, como el norte de blot, RT-PCR en tiempo real cuantitativa RT-PCR, hibridación in situ, microarrays de ADNc y ensayo de protección de ribonucleasa proporcionan un enfoque alternativo cuando los anticuerpos no son fácilmente los niveles de expresión disponible o si de una proteína particular son bajos ^7. Sin embargo, una limitación al uso de tales técnicas moleculares es la identificación requerido de la secuencia del gen.

Para localizar proteínas en la retina, inmunohistoquímica se puede realizar en retinas wholemount. Debido a la accesibilidad de la CGR, la wholemountpreparación proporciona una excelente plataforma para el estudio de la localización de las proteínas específicas del somata RGC y sus axones.

Además de su localización, algunas propiedades funcionales de los VGCCs en CGR se pueden demostrar mediante el uso de técnicas de imagen de calcio. Se describe un protocolo de imágenes de calcio para etiquetar selectivamente CGR con un colorante indicador de calcio para medir la dinámica del calcio intracelular. La contribución de las diferentes VGCCs a la señal de calcio en diferentes compartimentos celulares se puede aislar con el uso de bloqueadores de los canales de Ca subtipo específico.

Quizás uno de los aspectos más beneficiosos de la técnica de imagen de calcio descrito aquí es la capacidad de grabar simultáneamente y de forma independiente a partir de múltiples CGR y sus axones. Aunque muchas técnicas fisiológicas, como la grabación de patch clamp de célula entera, proporcionan altos grabaciones resolución temporal de las corrientes de membrana, la somática o fuente axonal de thescorrientes e grabados no pueden ser discriminados y grabaciones sólo se pueden hacer de una sola neurona a la vez. Arrays multielectrodo (AAM) son capaces de registrar simultáneamente picos de muchas células, pero tampoco pueden detectar ni discriminar la activación de, por ejemplo, los diferentes subtipos de canales de calcio. Meas preferentemente grabar a partir de células que se encuentran en las proximidades de un electrodo ⁸ y registro de las células que generan grandes picos ^9. Métodos de imagen ópticos proporcionan una estrategia alternativa para que las grabaciones simultáneas e independientes de toda la población de células que se pueden integrar con la información obtenida a partir de una sola célula de microelectrodos y grabación de patch clamp y grabación MEA. Aunque se emplearon las técnicas de imagen de calcio descritos aquí para estudiar la dinámica de calcio de CGR, patch clamp y AAM también se pueden utilizar en paralelo a aclarar aún más las corrientes iónicas y propiedades enriquecidas de CGR.

Dado que las células amacrinas desplazadas constituyen aproximadamente el 60% de la población neuronal en la capa de células ganglionares de la retina en el ratón ^10, nuestro objetivo era utilizar una técnica de carga que etiqueta selectivamente CGR con un colorante indicador de calcio sintético en una preparación wholemount. Aunque colorantes indicadores de calcio sintéticos proporcionan una excelente plataforma para el estudio de la dinámica de calcio intracelular, su uso generalizado se ha visto obstaculizado por la incapacidad para cargar eficazmente poblaciones específicas de neuronas dentro de una red dada. Se han realizado muchas técnicas, tales como carga a granel ¹¹ y ^8,12 electroporación para cargar poblaciones enteras de células, sin embargo, estas técnicas no discriminan entre tipos de células específicos. Genéticamente codificados indicadores de calcio proporcionan la capacidad de etiquetar selectivamente poblaciones específicas de células, sin embargo, tales métodos requieren la generación de animales transgénicos ^13. Nuestra técnica describe un method etiquetar selectivamente CGR en la preparación wholemount vía óptica inyección muñón del nervio de un colorante indicador de calcio.

En conjunto, las técnicas estructurales y fisiológicos descritos en este artículo proporcionan una plataforma para estudiar la localización y la contribución de los VGCCs a la señal de calcio en la CGR y sus axones.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices para el bienestar de los animales de laboratorio emitidos por la Política de Servicio de Salud Pública en Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio y la Universidad de California-Los Ángeles (UCLA) Comité de Investigación Animal. Se utilizaron masculino y femenino adulto ratas Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre la edad de 3-5 semanas.

1. Animal y Tejidos Preparación para Wholemount Retina y Protocolo de inmunohistoquímica

1. Prepare los siguientes materiales y herramientas: un microscopio de disección, 2 pinzas con puntas muy finas, tijeras, papel de filtro de celulosa, pipeta de plástico y un portaobjetos de microscopio.
2. La eutanasia a la rata en una cámara cerrada por profundamente anestesiar al animal con 1-3% de isoflurano seguido por decapitación con una guillotina. Quitar los ojos con un par de tijeras de iris y el lugar en una placa de Petri que contiene la solución extracelular. Hibernate A, Ames míSe recomiendan Dium o soluciones fisiológicas.
3. [Si se desea el relleno de la CGR con Fluo-4 Paso opcional]. Realizar el etiquetado Fluo-4 como se describe en el 2.3 a 2.4 pasos.
4. Usando el microscopio de disección (intensidad de la luz: 1,6 x 10 ⁸ fotones / mm ² ⋅sec), retire la córnea mediante la reducción de la parte frontal del globo ocular. Retire el objetivo y el vítreo de la superficie de la retina interna con fórceps. Para quitar el vítreo, estabilizar el globo ocular sosteniendo firmemente la esclerótica con una pinza. Tienes que despegar la base del vítreo hacia el centro de la retina con la otra pinza. La preparación en esta etapa se llama el ocular, que se utiliza para cryosections. Más detalles sobre cryosections se pueden encontrar en las referencias ^14,15.
5. Retire la retina de la ojera. Luego, hacen cuatro cortes para permitir la retina para establecer planos. Montar suavemente la retina en un portaobjetos de microscopio con la capa de fotorreceptores arriba. Añadir una gota de solución a la retina y poner cepapel de filtro llulose en la retina. Una vez que la retina se adhiere al papel de filtro, colocar la retina en solución. Si es necesario, aplanar la retina con un cepillo o fórceps.
6. Coloque las retinas wholemounted en PFA al 4% durante 10-15 minutos para la fijación.
7. Lavar las retinas wholemounted tres veces durante 30 min en tampón fosfato 0,1 M (PB), pH 7,4. Bloquear las retinas con 5% de suero de cabra normal o suero de burro en PB 0,1 que contiene 0,3% de Triton X-100 y 0,1% NaN ₃ a 4 ° C durante la noche. Se recomienda un volumen final de 500 l para todos los pasos para guardar las soluciones de bloqueo y anticuerpos.
8. Al día siguiente, se incuban los wholemounts retinae con los anticuerpos primarios 5-7 días a 4 ° C. Las diluciones óptimas deben ser determinadas por el usuario.
9. Lavar el retinas 3 x 30 min en PB 0,1 M y se incuba durante la noche a 4 ° C en el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo correspondiente que se dirige contra la especie de anticuerpo primario (concentración 1: 1000).
10. Después de tres lavados finales de 30 min cada uno con PB, montar las retinas en medio de montaje. Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas para el almacenamiento prolongado. Guardar las muestras a 4 ° C y proteger de la luz.

2. Etiquetado de las células ganglionares y axones en Rata Wholemount retinas con un calcio Indicador Tinte

1. Preparar 1000 ml de mamíferos de Ringer que contenía (en mM) 125 NaCl, KCl 3, 2 _CaCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 1 MgCl _2, 25 NaHCO ₃ y 10 de la glucosa burbujeado con 95% O _2/5% de CO ^­ _2.
2. Realizar la disección como se describe en el 1.2 hasta 1.4 pasos.
3. Para cargar las células ganglionares de la retina (CGR) y sus axones con un colorante indicador de calcio, inyectar 0,5 l de Fluo-4 sal pentapotásico (de stock 40 mM en H ₂ O) en el muñón del nervio óptico de aproximadamente 1 mm posterior al globo ocular usando una jeringa . Para medir los aumentos dinámicos en células ganglionares de la [Ca ^{2 +} ] _i un indicador con alta afinidad, tales como Fluo-4 con su _Kd de 345 nM, es óptima. Fluo-4 ofrece el beneficio adicional de tener una muy alta eficiencia cuántica que resulta en un incremento de las emisiones de> 100 veces cuando se une a calcio.
4. Coloque el ocular en mamíferos de Ringer burbujeaba con 95% O _2/5% de CO ^­ ₂ durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad.

3. Calcio Protocolo Imaging para células ganglionares de la retina y los axones.

1. Retire el ojo, cristalino y humor vítreo como se describe en los pasos 1.1 hasta 1.4. Aislar la retina de la ojera y se dividen en cuadrantes. Mount lado de células ganglionares de un cuadrante sobre un portaobjetos de vidrio y utilizar una rejilla rebanada arpa para estabilizarlo. Mantenga las otras piezas oscuro-adaptado de mamíferos de Ringer burbujeaba con 95% O _2/5% de CO ^­ ₂ en el hielo para un uso posterior.
2. Superfuse la cámara de grabación con solución de Ringer y mamíferosmantener la solución burbujeando continuamente con 95% _O2 / 5% de CO _2.
3. Image el tejido bajo el microscopio. Realizar experimentos a temperatura ambiente (~ 23 ° C) o alcanzar temperaturas fisiológicas por el calentamiento de la etapa, calentar el baño de agua debajo de la muestra o la aplicación de aire caliente a la superficie de la muestra.
   Nota: Es importante tener en cuenta que muchas funciones celulares están regulados por la temperatura, que desempeña un papel clave en el mantenimiento de la homeostasis intracelular ^16. Sin embargo, la introducción de medidas de calentamiento puede aumentar la tasa de photobleaching, la evaporación del medio y el enfoque deriva causada por la expansión térmica ^17. El uso de la temperatura ambiente disminuye intracelular compartimentación de Fluo-4 ^18.
4. Realizar un control de dos de K ⁺ impulsos de alta pareadas en ausencia de fármacos. Despolarizar CGR axones de CGR y elevando la [K ^+] _o de 3 mM a 60 mM durante 33 segundos durante cada pulso para activarVGCCs con un sistema de superfusión impulsado ocho gravedad canal. Reducir Na ⁺ por 57 mM de mantener isosmolarity en la solución elevada K ^+.
5. Evaluar la contribución de las diferentes VGCCs a la señal de calcio con el uso de bloqueadores de los canales generales o específicas Ca. Por ejemplo, la reducción de la señal de calcio tras la administración de un bloqueador no específica del canal de calcio, cobalto, proporcionó una medida semi-cuantitativa de la contribución de los VGCCs a la alta K ⁺ señal de calcio -evoked.
6. Adquirir valores de intensidad de fluorescencia mediante la colocación de una región de interés (ROI) en torno a la CGR de interés (Figura 2).
7. Normalizar el cambio en la intensidad de fluorescencia producida por el segundo K ⁺ pico alto con el cambio producido por la primera alta K ⁺ pico. Entonces, para las pruebas de los bloqueadores de canales de calcio específicos, aplicar medicamentos sólo durante el segundo pulso de alta K ⁺ de un par y normalizar este pico contrael primer valor pico. Para medir el efecto del fármaco sobre el alto K ⁺ pico, dividir la amplitud de la segunda K ⁺ pico por el de la primera. El análisis debe ser realizado en estos valores con respecto a sus controles coincidentes derivados de alta emparejado K ⁺ picos medida en ausencia de fármaco.
8. Adquirir imágenes a intervalos de 5 seg. Para evitar la foto-blanqueo, mantener la excitación láser tan bajo como sea posible. Proporcionar la excitación por la línea de 488 nm del láser de argón, mientras que el tubo fotomultiplicador recoge la emisión fluorescente a través de un filtro LP 505 nm.

Resultados

Inmunomarcaje con anticuerpos específicos proporciona una plataforma para estudiar la localización de proteínas particulares de interés en la retina y la técnica de imagen de calcio permite el estudio de la contribución de los VGCCs a la dinámica de calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

Mediante el uso de un anticuerpo contra las células ganglionares RBPMS proteína (proteína de unión de ARN con múltiples empalme) que etiqueta selectivamente CGR ^19,

Discusión

En este artículo, hemos descrito dos técnicas diferentes: 1) La inmunohistoquímica para mostrar Fluo-4 a la localización de las células ganglionares de la retina en wholemounts, y 2) El calcio de imágenes para analizar la dinámica de calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

La inmunohistoquímica utilizando wholemounts se ha usado para revelar la localización de las proteínas en el roedor retina ^20-23. Sin embargo, hay algunas limitaciones. La calida...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight scissors	WPI	14124-G	dissecting tools
Straight Forceps	WPI	501985	dissecting tools
curved iris scissors	WPI	504487	dissecting tools
Cellulose filter paper	Millipore	HABP04700
Hibernate A	Invitrogen	A12475-01	Media
Vectashield	Vector	H-1000	Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium	Invitrogen	F-14200
Isoflurane	Abbott Laboratories	05260-05	anesthesia
Microscope slide	Fisher Scientific	22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope	Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens	Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular Probes	A-11034	Secondary antibody
RBPMS	ProSci, Poway, CA		A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).