Immunohistochimie et calcium méthodes d'imagerie dans Wholemount Rat Retina

Résumé

protocoles d'immunohistochimie sont utilisées pour étudier la localisation d'une protéine spécifique de la rétine. Les techniques d'imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

Résumé

Dans cet article, nous décrivons les outils, les réactifs et les mesures concrètes qui sont nécessaires pour: 1) la préparation réussie de rétines wholemount pour l'immunohistochimie et, 2) l'imagerie calcique pour l'étude de la tension fermée canal de calcium (CCAGV) signalisation médiée de calcium dans la rétine cellules ganglionnaires. Procédé de formation d'image de calcium, nous décrivons des questions relatives au chargement contourne non spécifique de cellules amacrines déplacées dans la couche des cellules ganglionnaires.

Introduction

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) expriment L, N, P / Q et T de type CCAGV tel que déterminé par le blocage pharmacologique de ces composants de la cellule entière canal Ca courant ^1,2. CCAGV sont des protéines transmembranaires multimères qui sont impliqués dans la libération du transmetteur, la transcription des gènes, régulation cellulaire et la plasticité synaptique ^3,4,5. VGCCs fonctionnels sont constitués d'au moins trois catégories distinctes de sous-unités: grandes, _une α transmembranaires formant des pores sous-unités qui établissent des propriétés biophysiques et pharmacologiques du canal, principalement extracellulaire auxiliaire α ₂ δ de sous-unités et sous-unités β intracellulaires. Les deux derniers complexes sous forme de hétéromères avec différentes sous-unités α ₁ et modifier la cinétique de déclenchement et le trafic des canaux à la membrane plasmique ^6.

Au cours des dernières décennies, de nombreuses techniques ont été utilisées pour étudier la protéine expression, comme l'immunohistochimie, dosage immuno-enzymatique, une analyse Western et la cytométrie en flux. Ces techniques nécessitent l'utilisation d'anticorps spécifiques pour la détection d'une protéine d'intérêt donnée et fournissent des outils puissants pour la localisation et la distribution des protéines spécifiques dans différents tissus. Les techniques utilisées pour détecter et quantifier des taux d'une protéine particulière d'expression d'ARNm telles que l'analyse par transfert de Northern, RT-PCR en temps réel quantitative RT-PCR, l'hybridation in situ, des puces à ADNc et essai de protection de ribonucléase offrent une approche alternative lorsque les anticorps ne sont pas facilement disponibles ou si les niveaux d'une protéine particulière d'expression est faible ^7. Toutefois, une limitation de l'utilisation de ces techniques moléculaires est l'identification spécifique d'une séquence de gène.

Pour localiser les protéines de la rétine, l'immunohistochimie peut être effectuée sur les rétines wholemount. En raison de l'accessibilité des CGR, le wholemountpréparation fournit une excellente plateforme pour étudier la localisation des protéines spécifiques à la soma RGC et leurs axones.

En plus de leur localisation, des propriétés fonctionnelles des CGR dans VGCCs peuvent être démontrées par l'utilisation de techniques d'imagerie de calcium. Nous décrivons un protocole d'imagerie du calcium pour marquer sélectivement CGR avec un colorant indicateur du calcium à mesurer la dynamique du calcium intracellulaire. La contribution des différents VGCCs au signal de calcium dans différents compartiments cellulaires peut être isolé à l'aide de bloqueurs des canaux Ca-spécifique de sous-typage.

Peut-être l'un des aspects les plus bénéfiques de la technique d'imagerie de calcium décrite ici est la possibilité d'enregistrer en même temps et indépendamment l'un de plusieurs CGR et de leurs axones. Bien que de nombreuses techniques physiologiques, telles que l'enregistrement de l'ensemble de serrage de plaque de cellule, de fournir des enregistrements de haute résolution temporelle des courants membranaires, l'origine somatique ou axonale des thescourants électroniques enregistrées ne peuvent pas être victimes de discrimination et les enregistrements ne peuvent être faites à partir d'un seul neurone à la fois. matrices électrodes multiples (AME) sont capables d'enregistrer en même temps des pointes de nombreuses cellules, mais ne peuvent ni détecter ni discrimination de l'activation, par exemple, les différents sous-types de canaux calciques. Meas préférentiellement enregistrer à partir de cellules qui sont situées à proximité immédiate de l'électrode ⁸ et enregistrement donné à partir de cellules qui produisent des grandes pointes ^9. Méthodes d'imagerie optique fournissent une stratégie alternative pour permettre aux enregistrements simultanés et indépendants des populations entières de cellules qui peuvent être intégrés avec les informations obtenues à partir de micro-électrodes d'une cellule unique et le patch enregistrement de serrage et l'enregistrement de la MEA. Bien que les techniques d'imagerie de calcium décrits ici ont été utilisées pour étudier la dynamique de calcium de CGR, patch clamp et AME peuvent aussi être utilisés en parallèle pour élucider les courants ioniques et les propriétés de dopage de CGR.

Comme les cellules amacrines déplacées représentent environ 60% de la population neuronale dans la couche des cellules ganglionnaires dans la rétine de souris ^10, notre objectif était d'utiliser une technique de chargement qui marque sélectivement CGR avec un colorant indicateur de calcium synthétique dans un préparation wholemount. Bien synthétiques colorants indicateurs de calcium fournissent une excellente plate-forme pour l'étude de la dynamique de calcium intracellulaire, son utilisation généralisée a été entravée par l'impossibilité de charger efficacement les populations spécifiques de neurones dans un réseau donné. Beaucoup de techniques telles que le chargement en vrac ¹¹ et l'électroporation ^8,12 ont été réalisées pour charger des populations entières de cellules, cependant, ces techniques ne sont pas discriminatoires entre les différents types de cellules spécifiques. Génétiquement codés indicateurs de calcium offrent la possibilité de marquer sélectivement les populations spécifiques de cellules, cependant, de tels procédés exigent la production d'animaux transgéniques ^13. Notre technique décrit une méthod étiqueter sélectivement CGR dans la préparation wholemount par fibre injection nerf de la souche d'un colorant indicateur de calcium.

Pris ensemble, les techniques structurelles et physiologiques décrites dans cet article fournissent une plate-forme pour étudier la localisation et la contribution des VGCCs au signal de calcium dans les CGR et leurs axones.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les lignes directrices pour le bien-être des animaux de laboratoire émises par la politique US Public Health Service sur Human Care et l'utilisation des animaux de laboratoire et l'Université de Californie-Los Angeles (UCLA) Comité de recherche animale. Mâle et femelle adultes rats Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre l'âge de 3-5 semaines ont été utilisés.

1. animaux et Préparation des tissus pour Wholemount Retina et le Protocole immunohistochimie

1. Préparer les matériaux et outils suivants: Une loupe binoculaire, 2 pinces avec des pointes très fines, des ciseaux, du papier filtre de cellulose, pipette en plastique et une lame de microscope.
2. Euthanasier le rat dans une chambre fermée par anesthésie profondément les animaux avec 1-3% d'isoflurane suivie par décapitation avec une guillotine. Retirez les yeux avec une paire de ciseaux de l'iris et les placer dans une boîte de Petri contenant la solution extracellulaire. Hibernate A, Ames moidium ou solutions physiologiques sont recommandés.
3. [Étape facultative si le remblayage des CGR avec Fluo-4 est souhaitée]. Effectuer l'étiquetage Fluo-4 comme décrit dans les étapes 2.3-2.4.
4. Utilisation du microscope à dissection (d'intensité lumineuse: 1,6 x 10 ⁸ / mm ² photons ⋅sec), retirer la cornée en coupant la face du globe oculaire. Retirez l'objectif et vitré de la surface de la rétine interne avec une pince. Pour retirer le corps vitré, stabiliser le globe oculaire en maintenant la sclérotique fermement avec une pince. Retire la base du vitré vers le centre de la rétine de l'autre pince. La préparation à ce stade est appelé l'œilleton, qui est utilisé pour cryosections. Plus de détails sur cryosections peuvent être trouvés dans les références ^14,15.
5. Retirer la rétine de l'œilleton. Ensuite, faire quatre coupes pour permettre la rétine à plat. Monter doucement la rétine sur une lame de microscope avec le photorécepteur couche vers le haut. Ajouter une goutte de solution de la rétine et mettre CEpapier filtre llulose sur la rétine. Une fois la rétine attache au papier filtre, placer la rétine remise en solution. Si nécessaire, aplatir la rétine avec un pinceau ou une pince.
6. Placez les rétines wholemounted dans 4% PFA pendant 10-15 min pour la fixation.
7. Laver les rétines wholemounted trois fois pendant 30 minutes dans 0,1 M de tampon phosphate (PB), pH 7,4. Bloquer les rétines avec 5% de sérum normal de chèvre ou de sérum d'âne à 0,1 PB contenant 0,3% de Triton X-100 et 0,1% de NaN ₃ à 4 ° C pendant une nuit. Nous recommandons un volume final de 500 pl pour toutes les étapes d'économiser de blocage des solutions et des anticorps.
8. Le lendemain, incuber les échantillons entiers de la rétine avec les principaux anticorps 5-7 jours à 4 ° C. Des dilutions optimales doivent être déterminées par l'utilisateur.
9. Laver les rétines 3 x 30 min dans 0,1 M de PB et incuber pendant une nuit à 4 ° C dans l'anticorps secondaire conjugué à un fluorophore correspondant qui est dirigé contre l'espèce de l'anticorps primaire (concentration de 1: 1000).
10. Après trois derniers lavages de 30 minutes chacun avec PB, monter les rétines dans un milieu de montage. Sceller les lamelles avec du vernis à ongles pour un stockage prolongé. Conserver les échantillons à 4 ° C et protéger de la lumière.

2. marquage des cellules ganglionnaires et des axones à Rat Wholemount rétines avec un colorant indicateur de calcium

1. Préparer 1000 ml de Ringer de mammifère contenant (en mM) 125 NaCl, KCl 3, 2 de _CaCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 1 _MgCl2, NaHCO ₃ 25, glucose 10 et barboter avec 95% O _2/5% CO ^­ _2.
2. Effectuer la dissection comme décrit dans les étapes 1.2-1.4.
3. Pour charger les cellules rétiniennes ganglionnaires (CGR) et leurs axones avec un colorant indicateur de calcium, injecter 0,5 pi de Fluo-4 sel de pentapotassium (40 mM d'achat d'actions en H ₂ O) dans le nerf souche optique d'environ 1 mm en arrière du globe oculaire à l'aide d'une seringue . Pour mesurer dynamique augmente dans la cellule de ganglion [Ca ^{2 +} ] _i un indicateur avec une forte affinité, tels que Fluo-4 avec sa valeur _{de Kd} de 345 nM, est optimal. Fluo-4 offre l'avantage supplémentaire d'avoir une efficacité quantique très élevée résultant en une augmentation d'émission de> 100 fois lorsqu'il est lié au calcium.
4. Placez l'œilleton dans barboter avec 95% de O _2/5% de CO mammifères Ringer ^­ ₂ pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité.

Protocole d'imagerie 3 de calcium pour les cellules ganglionnaires de la rétine et des axones.

1. Retirer l'œil, le cristallin et vitreux comme décrit dans les étapes 1.1 à 1.4. Isoler la rétine de l'œilleton et la diviser en quadrants. Mont côté des cellules ganglionnaires d'un quadrant sur une lame de verre et d'utiliser une grille harpe de tranche pour le stabiliser. Gardez les autres morceaux adaptés à l'obscurité dans barboter avec 95% de O _2/5% de CO mammifères Ringer ^­ ₂ sur de la glace pour une utilisation ultérieure.
2. Superfuse la chambre d'enregistrement avec la solution de Ringer et mammifèresmaintenir la solution en continu avec barbotage de 95% O _2/5% CO _2.
3. L'image du tissu sous le microscope. Faire des expériences à température ambiante (~ 23 ° C) ou à atteindre des températures physiologiques en chauffant la phase, le chauffage du bain d'eau sous le spécimen ou l'application d'air chaud à la surface de l'échantillon.
   Remarque: Il est important de noter que de nombreuses fonctions cellulaires sont réglementés par la température, qui joue un rôle clé dans le maintien de l'homéostasie intracellulaire ^16. Cependant, l'introduction de mesures de réchauffement peut augmenter le taux de photoblanchiment, l'évaporation de la dérive de la moyenne et de concentration causée par la dilatation thermique ^17. L'utilisation de la température ambiante diminue intracellulaire cloisonnement de Fluo-4, ^18.
4. Effectuer un contrôle de deux impulsions à haute K ⁺ appariés en l'absence de médicaments. Dépolariser CGR et RGC axones en augmentant la [K ^+] _o de 3 à 60 mm pour 33 sec pendant chaque impulsion pour activerVGCCs avec un système de surfusion entraînée par gravité huit canaux. Réduire Na ⁺ par 57 mM de maintenir isosmolarity dans la solution élevée ^de K ^+.
5. Évaluer la contribution des différents VGCCs au signal de calcium avec l'utilisation des inhibiteurs généraux ou spécifiques canaux Ca. Par exemple, la réduction du signal de calcium après l'administration d'un bloqueur du canal calcique non-spécifique, de cobalt, à condition d'une mesure semi-quantitative de la contribution des VGCCs au K ⁺ élevé du signal de calcium -evoked.
6. Acquérir des valeurs d'intensité de fluorescence en plaçant une région d'intérêt (ROI) dans les CGR d'intérêt (Figure 2).
7. Normaliser la variation de l'intensité de fluorescence produite par le second pic élevé de K ⁺ à la variation produite par le premier pic élevé de K ^+. Puis, pour tester des inhibiteurs spécifiques des canaux calciques, les médicaments uniquement appliquer pendant la seconde impulsion haute K ⁺ et une paire de normaliser cette pointe contrela première valeur de crête. Pour mesurer l'effet du médicament sur ​​le pic élevé de K ^+, de diviser l'amplitude du second pic K ⁺ par celle de la première. L'analyse doit être effectuée sur ces valeurs par rapport à leurs témoins correspondants dérivés de K ⁺ haute pics appariés mesurée en l'absence de médicament.
8. Acquérir des images à intervalles de 5 secondes. Pour éviter photo-blanchiment, garder l'excitation laser aussi bas que possible. Fournir une excitation par la ligne 488 nm du laser à argon, tandis que le tube photomultiplicateur collecte l'émission de fluorescence au moyen d'un filtre LP 505 nm.

Résultats

Immunomarquage avec des anticorps spécifiques fournit une plate-forme pour étudier la localisation des protéines d'intérêt particulier dans la rétine et la technique d'imagerie de calcium permet l'étude de la contribution des VGCCs à la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

En utilisant un anticorps dirigé contre les RBPMS de protéines des cellules ganglionnaires (protéine de liaison de l'ARN avec le raccordement mu...

Discussion

Dans cet article, nous avons décrit deux techniques différentes: 1) L'immunohistochimie pour afficher Fluo-4 localisation des cellules ganglionnaires de la rétine dans des échantillons entiers, et 2) l'imagerie de calcium pour analyser la dynamique de calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

L'immunohistochimie en utilisant des échantillons entiers a été utilisé pour révéler la localisation des protéines dans la rétine ^20-23

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight scissors	WPI	14124-G	dissecting tools
Straight Forceps	WPI	501985	dissecting tools
curved iris scissors	WPI	504487	dissecting tools
Cellulose filter paper	Millipore	HABP04700
Hibernate A	Invitrogen	A12475-01	Media
Vectashield	Vector	H-1000	Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium	Invitrogen	F-14200
Isoflurane	Abbott Laboratories	05260-05	anesthesia
Microscope slide	Fisher Scientific	22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope	Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens	Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular Probes	A-11034	Secondary antibody
RBPMS	ProSci, Poway, CA		A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).