Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

Resumo

Imunohistoquímica protocolos são usados ​​para estudar a localização de uma proteína específica na retina. Técnicas de imagem de cálcio são utilizados para estudar a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axônios.

Resumo

Neste artigo descrevemos as ferramentas, os reagentes e os passos práticos que são necessários para: 1) preparação bem-sucedida de retinas wholemount para imunohistoquímica e, 2) imagens de cálcio para o estudo da tensão fechado de canais de cálcio (VGCC) mediada sinalização de cálcio na retina células ganglionares. O método de imagem de cálcio que descrevem problemas contorna relativas à carga não-específica de células amácrinas deslocadas na camada de células ganglionares.

Introdução

As células ganglionares da retina (RGCs) expressar L, N, P / Q e T-tipo VGCC como determinado por meio do bloqueio farmacológico desses componentes de toda a célula actual canal Ca ^1,2. VGCC são proteínas transmembrana multim�icos que estão envolvidos na liberação do transmissor, a transcrição do gene, regulação celular e sináptica ^3,4,5 plasticidade. VGCCs funcionais são compostos de pelo menos três classes distintas de subunidades: grandes, transmembrana α ₁ poro formando subunidades que estabelecem propriedades biofísicas e farmacológicas do canal, principalmente extracelular α auxiliar ₂ δ subunidades e subunidades β intracelulares. Os dois últimos formam complexos heterom�icas com diferentes α _um subunidades e alterar a cinética de propagação e tráfico de canais para a membrana plasmática ^6.

Nas últimas décadas, várias técnicas têm sido empregadas para estudar expre proteínassion, tais como imuno-histoquímica, ligada ensaio imunoenzimático, análise de Western e citometria de fluxo. Estas técnicas requerem a utilização de anticorpos específicos para a detecção de uma determinada proteína de interesse e fornecem ferramentas poderosas para a localização e distribuição de proteínas específicas em diferentes tecidos. As técnicas usadas para detectar e quantificar níveis de uma proteína particular de expressão de ARNm, tais como a análise de manchas de Northern, RT-PCR, em tempo real quantitativa de RT-PCR, hibridação in situ, de microarrays e ensaio de protecção de ribonuclease proporcionam uma abordagem alternativa, quando os anticorpos não são prontamente os níveis de expressão ou se disponíveis de uma proteína particular são baixos ^7. No entanto, uma limitação para a utilização de tais técnicas moleculares é necessária a identificação da sequência do gene.

Para localizar as proteínas na retina, imuno-histoquímica pode ser realizada em retinas wholemount. Devido à acessibilidade das CGR, a wholemountpreparação fornece uma plataforma excelente para o estudo da localização de proteínas específicas para o RGC somata e seus axónios.

Em adição à sua localização, algumas propriedades funcionais dos VGCCs em CGRs pode ser demonstrada através da utilização de técnicas de imagiologia de cálcio. Descreve-se um protocolo de imagens de cálcio para etiquetar selectivamente CGR com um corante indicador de cálcio para medir a dinâmica de cálcio intracelulares. A contribuição de diferentes VGCCs ao sinal de cálcio em diferentes compartimentos celulares podem ser isoladas com o uso de bloqueadores dos canais de Ca específicos do subtipo.

Talvez um dos aspectos mais benéficos da técnica de imagiologia de cálcio descritos aqui é a capacidade de gravar, simultaneamente e de forma independente a partir de múltiplas CGR e seus axónios. Embora muitas técnicas fisiológicas, como a correção de células gravação braçadeira todo, proporcionar gravações de alta resolução temporal das correntes de membrana, o somático ou fonte axonal de these correntes gravados não podem ser discriminados e gravações só pode ser feita a partir de um único neurónio de cada vez. Matrizes multieletrodo (AMA) são capazes de gravar simultaneamente picos de muitas células, mas podem detectar e nem discriminar a ativação de, por exemplo, diferentes subtipos de canais de cálcio. Meas preferencialmente gravar a partir de células que estão localizadas na proximidade de um determinado eletrodo ⁸ e gravar a partir de células que geram grandes picos de ^9. Métodos de imagem Optical fornecer uma estratégia alternativa para permitir que as gravações simultâneas e independentes de populações inteiras de células que podem ser integrados com as informações obtidas a partir de uma única célula de microeletrodos e remendo gravação de fixação e gravação de MEA. Embora tenham sido empregues as técnicas de imagiologia de cálcio descritos aqui para estudar a dinâmica de cálcio de CGRs, sujeição do emplastro e AAM também podem ser utilizados em paralelo para elucidar as correntes iónicas e propriedades spiking de CGRs.

Como as células amácrinas deslocadas compõem cerca de 60% ​​da população dos neurônios da camada de células ganglionares da retina do rato ^10, o nosso objetivo era usar uma técnica de carga que rotula seletivamente CGR com um corante indicador de cálcio sintético em um preparação wholemount. Embora corantes indicadoras de cálcio sintéticos fornecem uma excelente plataforma para o estudo da dinâmica de cálcio intracelular, a sua utilização generalizada tem sido dificultado pela incapacidade para carregar de forma eficaz as populações específicas de neurónios no interior de uma determinada rede. Muitas técnicas, tais como volume de carga ¹¹ e eletroporação ^8,12 foram realizados para carregar populações inteiras de células, no entanto, essas técnicas não discriminar entre tipos específicos de células. Geneticamente codificado indicadores de cálcio fornecem a capacidade para identificar selectivamente populações específicas de células, no entanto, estes métodos requerem a geração de animais transgénicos ^13. Nossa técnica descreve uma metod etiquetar seletivamente CGR na preparação wholemount via óptica injeção coto do nervo de um corante indicador de cálcio.

Tomadas em conjunto, as técnicas estruturais e fisiológicas descritas neste artigo fornecer uma plataforma para o estudo da localização e da contribuição dos VGCCs para o sinal de cálcio no CGR e seus axônios.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações para o bem-estar dos animais experimentais de emissão da Política de Serviço de Saúde Pública dos EUA em Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório e da Universidade da Califórnia-Los Angeles (UCLA) Comitê de Pesquisa Animal. Foram utilizados Macho e fêmea adultos ratos Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre a idade de 3-5 semanas.

1. Animais e Preparação de tecidos para Wholemount Retina e imunohistoquímica Protocolo

1. Prepare os seguintes materiais e ferramentas: um microscópio de dissecação, 2 pinças com pontas muito finas, tesouras, papel de filtro de celulose, pipeta de plástico e uma lâmina de microscópio.
2. Eutanásia o rato numa câmara fechada por profundamente anestesiar os animais com 1-3% de isoflurano seguido por decapitação com uma guilhotina. Remover os olhos com um par de tesouras e de íris lugar em uma placa de Petri contendo a solução extracelular. Hibernate A, Ames-medium ou soluções fisiológicas são recomendados.
3. [Etapa opcional se aterro de CGR com Fluo-4 é desejado]. Realizar a rotulagem de Fluo-4, conforme descrito no 2,3-2,4 passos.
4. Utilizando o microscópio de dissecação (intensidade de luz: 1,6 x 10 ⁸ fotões / mm ² ⋅sec), remover a córnea cortando a parte dianteira do globo ocular. Retirar a lente e vítreo a partir da superfície interior da retina com uma pinça. Para remover o vítreo, estabilizar o globo ocular, mantendo a esclera firmemente com uma pinça. Descascar delicadamente a base vítrea para o centro da retina com a outra pinça. A preparação nesta fase é chamada a ocular, a qual é usada para criocortes. Mais detalhes sobre criocortes podem ser encontradas em referências ^14,15.
5. Retire a retina do ocular. Em seguida, faça quatro cortes para permitir a retina para colocar o plano. Gentilmente montar a retina numa lâmina de microscópio com o fotorreceptor camada de cima. Adicionar uma gota de solução para a retina e colocar cepapel de filtro llulose na retina. Uma vez que a retina atribui ao papel de filtro, colocar a retina para trás em solução. Se necessário, achatar a retina com uma escova ou uma pinça.
6. Coloque as retinas wholemounted em PFA 4% por 10-15 min para fixação.
7. Lavam-se as retinas wholemounted três vezes durante 30 min em tampão fosfato 0,1 M (PB), pH 7,4. Bloquear as retinas com 5% de soro normal de cabra ou soro de burro em PB 0,1 contendo 0,3% de Triton X-100 a 0,1% e NaN ₃ a 4 ° C durante a noite. Recomendamos um volume final de 500 mL para todas as etapas para salvar soluções de bloqueio e anticorpos.
8. No dia seguinte, incubar as wholemounts retinas com os anticorpos primários 5-7 dias a 4 ° C. As diluições ótimas deve ser determinado pelo usuário.
9. Lava-se a retina 3 x 30 min em 0,1 M PB e incubar durante a noite a 4 ° C, em que o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo correspondente que é dirigido contra a espécie de anticorpo primário (concentração de 1: 1000).
10. Após três lavagens final de 30 min cada um com PB, montar as retinas em meio de montagem. Vedar as lamelas com unha polonês para o armazenamento prolongado. Armazene as amostras a 4 ° C e proteger da luz.

2 Rotulagem de células ganglionares e axônios Rat Wholemount Retinas com Cálcio Indicador Dye

1. Preparar 1000 ml de Ringer de mamífero contendo (em mM) 125 de NaCl, 3 de KCl, 2 _CaCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 1 de _MgCl2, 25 de _NaHCO3, 10 de glucose e borbulhado com 95% _{de O2} / 5% de CO ^­ _2.
2. Efectuar a dissecção como descrito no 1,2-1,4 passos.
3. Para carregar as células ganglionares da retina (RGCs) e seus axónios com um corante indicador de cálcio, injectar 0,5 ul de Fluo-4 sal pentapotássio (40 mM em H ₂ O) para o coto do nervo óptico de cerca de 1 mm posterior ao globo ocular, utilizando uma seringa . Para medir um aumento dinâmico em células ganglionares da [Ca2 ⁺ ] _i um indicador com elevada afinidade, tais como Fluo-4 com o seu K _d de 345 nM, é óptima. Fluo-4 oferece a vantagem adicional de possuir uma elevada eficiência quântica, resultando num aumento das emissões de> 100 vezes quando ligado ao cálcio.
4. Coloque a ocular no borbulhar com 95% _{de O2} / 5% de CO de Ringer de mamífero ^­ _2, durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro.

3. Cálcio imagem Protocolo de células ganglionares da retina e axônios.

1. Remover o olho, da lente e vítreo, tal como descrito nos passos 1,1-1,4. Isolar a retina do ocular e divida em quadrantes. Montagem lado de células ganglionares um quadrante se numa lâmina de vidro e usar uma grade fatia harpa para estabilizá-la. Mantenha as outras peças escuro adaptado em aeradas com 95% _{de O2} / 5% CO mamíferos de Ringer ^­ ₂ em gelo para posterior utilização.
2. Superfuse a câmara grava com solução de Ringer e mamíferosmanter a solução borbulhar continuamente com 95% _O2 / 5% de CO _2.
3. Imagem do tecido sob o microscópio. Realizar experiências à temperatura ambiente (~ 23 ° C), ou atingir temperaturas fisiológicas por aquecimento da fase, o aquecimento do banho de água por baixo da amostra, ou a aplicação de ar quente para a superfície do espécime.
   Nota: É importante notar que muitas funções celulares são regulados pela temperatura, que desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase intracelular ^16. No entanto, a introdução de medidas de aquecimento pode aumentar a taxa de fotodegradação, a evaporação do desvio médio e foco causada pela expansão térmica ^17. Utilização de temperatura ambiente diminui compartimentalização intracelular de Fluo-4 ^18.
4. Executar um controlo de dois de K ⁺ pulsos emparelhados elevados na ausência de drogas. Despolarizar RGCs e RGC axónios através do aumento da [K ^+] _o de 3 mM a 60 mM durante 33 segundos, durante cada pulso para activarVGCCs com um sistema de superfusão impulsionado oito gravidade canal. Reduzir o Na ⁺ por 57 mM para manter isosmolarity na solução de elevado K ^+.
5. Avaliar a contribuição de diferentes VGCCs ao sinal de cálcio com o uso de bloqueadores dos canais de Ca gerais ou específicas. Por exemplo, a redução no sinal de cálcio após a administração de um bloqueador do canal de cálcio não-específica, o cobalto, fornecida uma medida semi-quantitativa da contribuição dos VGCCs ao sinal -evoked cálcio de K ⁺ elevado.
6. Adquirir os valores de intensidade de fluorescência através da colocação de uma região de interesse (ROI) em torno das CGR de interesse (Figura 2).
7. Normalizar a mudança na intensidade de fluorescência produzida pelo segundo pico de K ⁺ elevado para a alteração produzida por o primeiro pico de K ⁺ elevado. Em seguida, para o teste de bloqueadores dos canais de cálcio específicos, aplicar drogas apenas durante o segundo pulso de K ⁺ elevado de um par e normalizar este pico contrao primeiro valor de pico. Para medir o efeito do fármaco sobre a K ⁺ elevado pico, dividir a amplitude do segundo pico de K ⁺ pelo que a do primeiro. A análise deve ser executada em estes valores em relação aos seus controlos correspondentes derivados de K ⁺ elevado emparelhado picos medidos na ausência de fármaco.
8. Adquira imagens em intervalos de 5 seg. Para evitar a foto-branqueamento, manter o laser de excitação o mais baixo possível. Fornecer excitação pela linha 488 nm do laser de árgon, enquanto o tubo fotomultiplicador recolhe a emissão de fluorescência através de um filtro PB de 505 nm.

Resultados

Imunomarcação com anticorpos específicos proporciona uma plataforma para o estudo da localização de proteínas de interesse particular na retina e na técnica de imagiologia de cálcio permite o estudo da contribuição dos VGCCs para a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axónios.

Ao utilizar um anticorpo contra as células ganglionares RBPMS proteína (proteína de ligação de ARN com splicing múltipla) que rotula selectivamente CGRs ^19, fomos ...

Discussão

Neste artigo, descrevemos duas técnicas diferentes: 1) Imunohistoquímica para mostrar Fluo-4 de localização para as células ganglionares da retina em wholemounts, e 2) Imagem de cálcio para analisar a dinâmica de cálcio em células ganglionares da retina e seus axônios.

A imuno-histoquímica utilizando wholemounts foi usado para revelar a localização de proteínas no roedor retina ^20-23. No entanto, existem algumas limitações. A qualidade da coloração depende muito ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight scissors	WPI	14124-G	dissecting tools
Straight Forceps	WPI	501985	dissecting tools
curved iris scissors	WPI	504487	dissecting tools
Cellulose filter paper	Millipore	HABP04700
Hibernate A	Invitrogen	A12475-01	Media
Vectashield	Vector	H-1000	Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium	Invitrogen	F-14200
Isoflurane	Abbott Laboratories	05260-05	anesthesia
Microscope slide	Fisher Scientific	22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope	Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens	Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular Probes	A-11034	Secondary antibody
RBPMS	ProSci, Poway, CA		A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).