Иммуногистохимические и кальция способы визуализации в Wholemount сетчатке крыс

Резюме

Протоколы Иммуногистохимия используются для изучения локализации специфического белка в сетчатке. Методы визуализации кальция используются для изучения динамики кальция в ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов.

Аннотация

В этой статье мы опишем инструменты, реактивы и практические шаги, которые необходимы для: 1) успешной подготовки Wholemount сетчатки для иммуногистохимии и, 2) изображения кальция для изучения напряжения закрытого кальциевых каналов (VGCC) передачи сигналов кальция в сетчатке глаза ганглиозные клетки. Метод визуализации кальция мы описываем обходит вопросы, касающиеся неспецифическую нагрузку перемещенных амакринных клеток в слое ганглиозных клеток.

Введение

Ганглиозных клеток сетчатки (РГК) выразить L-, N-, P / Q-и Т-типа VGCC как определено с помощью лекарственных препаратов блокады этих компонентов всей клетки Калифорния Channel ток ^1,2. VGCC являются трансмембранными мультимерные белки, которые участвуют в выпуске передатчика, транскрипции генов, регуляции клеточного и синаптической пластичности ^3,4,5. Функциональные VGCCs состоят как минимум из трех различных классов субъединиц: крупные, трансмембранных α ₁ пор формирования подразделений, которые устанавливают биофизические и фармакологические свойства канала, в первую очередь внеклеточного вспомогательный α ₂ δ субъединицы и внутриклеточные β субъединиц. Последние два форма гетеромерные комплексы с различными α ₁ субъединицы и изменять литниковые кинетики и оборота каналов в мембране ^6.

За последние десятилетия, многие методы были использованы для изучения белка Expreделения, такие как иммуногистохимии, иммуноферментного анализа, вестерн-анализа и проточной цитометрии. Эти методы требуют использования специфических антител для обнаружения данного белка, представляющего интерес, и обеспечивают мощный инструмент для локализации и распределения специфических белков в различных тканях. Методы, используемые для обнаружения и количественной оценки уровней экспрессии мРНК того или иного белка, такие как Нозерн-блот анализ, ОТ-ПЦР в режиме реального времени количественный ПЦР, гибридизация, кДНК-микрочипов и защиты рибонуклеазы анализа обеспечивают альтернативный подход, когда антитела не являются легко отсутствует или если уровни экспрессии конкретного белка низки ^7. Тем не менее, одно ограничение на использование таких молекулярных методов является искомым идентификации последовательности гена.

Для локализации белков в сетчатке, иммуногистохимия может быть выполнена на Wholemount сетчатки. В связи с доступностью РГК, в Wholemountподготовка обеспечивает отличную платформу для изучения локализации специфических белков в somata РГК и их аксонов.

В дополнение к их локализации, некоторые функциональные свойства VGCCs в РСК может быть продемонстрирована путем использования методов визуализации кальция. Мы опишем протокол визуализации кальция выборочно маркировать РГК с индикатора кальция красителя для измерения динамики внутриклеточного кальция. Вклад различных VGCCs к сигналу кальция в различных клеточных компартментах, могут быть выделены с использованием специфических подтипов антагонистов кальция.

Возможно, одним из самых выгодных аспектов техники изображающего кальция, описанного здесь является способность одновременно и независимо записывать с нескольких РГК и их аксонов. Хотя многие физиологические методы, такие как всей записи зажима клеток патч, обеспечивают высокие временные записи разрешением мембранных токов, соматических или аксонов источник Фесе токи, записанные не может быть подвергнут дискриминации и записи могут быть сделаны только из одного нейрона в то время. Многоэлектродная массивы (МПС) способны одновременно записывать шипы из многих клетках, но не может ни обнаружить, ни дискриминации активацию, например, различных подтипов кальциевых каналов. МЭС преимущественно записывать из клеток, которые расположены в непосредственной близости от данного электрода ⁸ и записи из клеток, которые генерируют большие шипы ^9. Методы оптических изображений обеспечивают альтернативную стратегию, с тем чтобы одновременные и независимые записи целых популяций клеток, которые могут быть интегрированы с информацией, полученной от одного микроэлектродом клеток и записи зажима патч и записи MEA. Хотя методы визуализации кальция, описанные здесь, были использованы для изучения динамики кальциевые РСК, патч зажим и МПС также могут быть использованы параллельно, чтобы дальнейшее выявление ионные токи и пики свойства РСК.

С перемещенных амакринные клетки составляют около 60% нейронов населения в слое ганглиозных клеток у мышей сетчатки ^10, наша цель в том, чтобы использовать загрузочную технику, которая избирательно маркирует РГК с индикатора синтетического кальция красителя в Wholemount подготовка. Хотя синтетические красители индикатор кальция обеспечивают отличную платформу для изучения динамики внутриклеточного кальция, его широкое использование было затруднено невозможностью эффективно загружать определенные популяции нейронов в данной сети. Многие методы, такие как массовой загрузки ¹¹ и электропорации ^8,12 были выполнены, чтобы загрузить целые популяции клеток, однако, такие методы не различают специфические типы клеток. Генетически кодируемых показатели кальция обеспечивают возможность выборочно маркировать определенные популяции клеток, однако, такие методы требуют генерации трансгенных животных ^13. Наша методика описывает метод избирательно маркировать РГК в Wholemount подготовки через зрительного инъекции нервных культи индикатора кальция красителя.

Взятые вместе, структурные и физиологические методы, изложенные в этой статье обеспечить платформу для изучения локализации и вклад VGCCs до сигнала кальция в РГК и их аксонов.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами для благосостояния экспериментальных животных, выпущенных политики службы общественного здравоохранения США на уход человека и использованию лабораторных животных и Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA) исследовательского комитета животных. Были использованы взрослых мужчин и женщин Спрэг Доули (Charles River Lab, Уилмингтон, Массачусетс) в возрасте от 3-5 недель.

1 Животное и тканей Подготовка к Wholemount Retina и иммуногистохимии протокола

1. Подготовьте следующие материалы и инструменты: вскрытии микроскопом, 2 щипцы с очень мелких советов, ножницы, целлюлозы фильтровальной бумаги, пластика пипетки и предметное стекло микроскопа.
2. Эвтаназии крысу в закрытой камере с помощью глубоко анестезии животного с 1-3% изофлуран с последующей декапитацией с гильотины. Снимите глаза ножницами ириса и место в чашку Петри, содержащую внеклеточный раствор. Гибернации, Эймса МеняDIUM или физиологических растворов рекомендуется.
3. [Необязательный шаг, если засыпка РГК Fluo-4 требуется]. Выполните Fluo-4 маркировку, как описано в шагах 2,3-2,4.
4. Использование рассекает микроскопом (интенсивность света: 1,6 х 10 ⁸ фотон / мм ² ⋅sec), удалить роговицу, отрезав переднюю часть глазного яблока. Снимите объектив и стекловидного тела от внутренней поверхности сетчатки щипцами. Для удаления стекловидного тела, стабилизации глазное яблоко, удерживая склеры твердо одной силы р. Аккуратно очистить стекловидного базы к центру сетчатки с другой силы р. Подготовка на данном этапе называется наглазник, который используется для криосрезов. Подробнее о криосрезов можно найти в справочниках ^14,15.
5. Удалить сетчатку от наглазник. Тогда, сделать четыре порезы, чтобы сетчатка чтобы заложить квартиру. Аккуратно установите сетчатку на предметное стекло микроскопа с фоторецепторов слоя вверх. Добавьте одну каплю раствора к сетчатке и поставить сеllulose фильтровальная бумага на сетчатке. После того, как сетчатка прикрепляется к фильтровальной бумаге, разместить на сетчатку обратно в растворе. При необходимости, выровнять сетчатку с помощью щетки или пинцетом.
6. Поместите wholemounted сетчатки в 4% PFA в течение 10-15 мин для фиксации.
7. Промыть wholemounted сетчатки три раза в течение 30 мин в 0,1 М фосфатном буфере (PB), рН 7,4. Блок сетчатки с 5% нормальной козьей сывороткой или осла сыворотке в 0,1 ПБ, содержащем 0,3% Тритон Х-100 и 0,1% NaN ₃ при 4 ° С в течение ночи. Мы рекомендуем конечный объем 500 мкл для всех шагов, чтобы сохранить блокирующие решения и антитела.
8. На следующий день, инкубировать сетчатки wholemounts с первичным антителом 5-7 дней при температуре 4 ° С. Оптимальные разведения должны быть определены пользователем.
9. Промыть сетчатке 3 х 30 мин в 0,1 М PB и инкубируют в течение ночи при 4 ° С в соответствующем флуорофора, конъюгированным вторичным антителом, которое направлено против видов первичного антитела (концентрация 1: 1000).
10. После трех финальных моет 30 мин каждая с ПБ, крепление сетчатку в монтаже среду. Печать покровные с лаком для ногтей для длительного хранения. Магазин образцы при температуре 4 ° С и защиты от света.

2 Маркировка ганглиозных клеток и аксонов в Rat Wholemount сетчатки с кальцием индикаторный краситель

1. Подготовьте 1000 мл млекопитающих Рингера, содержащий (в мМ) NaCl, 125 3 KCl, 2 CaCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 1 MgCl _2, 25 NaHCO _3, и 10 глюкозу барботируют 95% O _2/5% CO ^­ _2.
2. Выполните рассечение, как описано в шагах 1,2-1,4.
3. Чтобы загрузить ганглиозных клеток сетчатки (РГК) и их аксоны с индикаторным красителем кальция, вводят 0,5 мкл Fluo-4 pentapotassium соли (40 мм складе в H ₂ O) в зрительного нерва пень примерно 1 мм кзади от глазного яблока с помощью шприца . Для измерения динамических увеличение ганглиозных клеток [Са ^{2 +} ] _я индикатор с высоким сродством, например, Fluo-4 с его _Уб 345 нМ, является оптимальным. Fluo-4 предлагает дополнительное преимущество, имеющих очень высокую квантовую эффективность, выражающееся в увеличении эмиссии> 100 раз при связывании с кальцием.
4. Поместите окуляр в Рингера млекопитающих в пропускают с 95% O _2/5% CO ^­ ₂ в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.

Изображений Протокол 3 Кальций для ганглиозных клеток сетчатки и аксонов.

1. Снимите глаз, хрусталик и стекловидное как описано в шагах 1.1-1.4. Изолировать сетчатку от наглазник и разделить на сектора. Гора сторона один квадрант ганглиозных клеток на предметное стекло и использовать арфа ломтик сетку стабилизировать его. Держите другие части адаптируются к темноте в Рингера млекопитающих в пропускают с 95% O _2/5% CO ^­ ₂ на льду для последующего использования.
2. Superfuse на записи камеры с раствором Рингера млекопитающих идержать решение барботируемого непрерывно с 95% O _2/5% CO _2.
3. Изображение ткани под микроскопом. Проведение экспериментов при комнатной температуре (~ 23 ° C) или достижения физиологических температурах при нагревании этап, нагрев на водяной бане при применении образца или теплого воздуха к поверхности образца.
   Примечание: Важно отметить, что многие клеточные функции регулируются температуры, которая играет ключевую роль в поддержании внутриклеточного гомеостаза ^16. Тем не менее, введение мер потепления может увеличить скорость фотообесцвечиванию, испарение среднесрочной и фокус дрейфа, вызванного тепловым расширением ^17. Использование комнатной температуре уменьшается внутриклеточный обособления Fluo-4 ^18.
4. Выполнение контроль двух парных высоких K ⁺ импульсов в отсутствии лекарств. Деполяризовать РГК и РГК аксоны, поднимая [K ^+] _о от 3 ​​мм до 60 мм для 33 сек во время каждого импульса, чтобы активироватьVGCCs с восьми каналов тяжести системы приводом суперфузии. Уменьшите Na ⁺ по 57 мм для поддержания isosmolarity в повышенной решения K ^+.
5. Оценку вклада различных VGCCs к сигналу кальция с использованием общих или конкретных антагонистов кальция. Например, снижение сигнала кальция после введения неспецифического блокатора кальциевых каналов, кобальта, при условии, полу-количественная мера вклада VGCCs к высокой K ⁺ -evoked сигнала кальция.
6. Приобретать значения интенсивности флуоресценции, помещая область интереса (ROI) вокруг РГК интереса (Рис 2).
7. Нормализация изменение интенсивности флуоресценции, полученного во втором высокой K ⁺ пика к изменению производимого первой высокой K ⁺ пика. Затем, для тестирования конкретных блокаторы кальциевых каналов, препараты применяются только во второй высоким К ⁺ импульса пары и нормализовать этот пик противпервый пиковое значение. Для измерения влияют препарата на высокой K ⁺ пика, разделить амплитуду второго K ⁺ пика на том, что из первых. Анализ должен быть выполнен на следующих значений в отношении их контроля соответствия, полученных из парных высокой K ⁺ пиков, измеренных при отсутствии препарата.
8. Получение изображений на 5-секундными интервалами. Чтобы избежать фото-отбеливание, держать лазерного возбуждения как можно ниже. Обеспечить возбуждение 488 нм линии аргонового лазера, в то время как ФЭУ собирает флуоресцентного свечения через ФНЧ 505 нм.

Результаты

Иммунноокрашивания со специфическими антителами предоставляет платформу для изучения локализации конкретных белков, представляющих интерес в сетчатке и метод визуализации кальция позволяет изучать вклада VGCCs в динамике кальция в ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов.

Обсуждение

В этой статье мы описали два различных методов: 1) Иммуногистохимия чтобы показать Fluo-4 локализацию к ганглиозных клеток в сетчатке глаза wholemounts, и 2) визуализации кальция для анализа динамики кальция в ганглиозных клеток сетчатки и их аксонов.

Иммуногистохимия помощью whol...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight scissors	WPI	14124-G	dissecting tools
Straight Forceps	WPI	501985	dissecting tools
curved iris scissors	WPI	504487	dissecting tools
Cellulose filter paper	Millipore	HABP04700
Hibernate A	Invitrogen	A12475-01	Media
Vectashield	Vector	H-1000	Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium	Invitrogen	F-14200
Isoflurane	Abbott Laboratories	05260-05	anesthesia
Microscope slide	Fisher Scientific	22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope	Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens	Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular Probes	A-11034	Secondary antibody
RBPMS	ProSci, Poway, CA		A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).