שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

Summary

פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

Abstract

במאמר זה אנו מתארים את הכלים, חומרים כימיים, וצעדים המעשיים הדרושים ל: 1) הכנה מוצלחת של רשתית wholemount אימונוהיסטוכימיה ו, 2) הדמיה סידן לחקר תעלות סידן מתח מגודרת (VGCC) בתיווך איתות סידן ברשתית תאי הגנגליון. שיטת ההדמיה סידן אנו מתארים בעיות עוקפים לגבי הטעינה הלא ספציפית של תאי amacrine עקורים בשכבת תא גנגליון.

Introduction

תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) להביע VGCC L-, N-, P / Q- וT-הסוג, כפי שנקבע באמצעות מצור תרופתי של רכיבים של כל התא אלה Ca לתעל ^1,2 הנוכחי. VGCC הם חלבוני Multimeric הטרנסממברני כי הם מעורבים בשחרור משדר, שעתוק הגנים, תקנת התא ^ו3,4,5 פלסטיות הסינפטית. VGCCs פונקציונלי מורכב של לפחות שלוש כיתות שונות של יחידות משנה: גדולות, הטרנסממברני α נקבובית ₁ להרכיב יחידות משנה, אשר קובעת את מאפייני biophysical והתרופתיים של הערוץ, α בעיקר תאי עזר ₂ δ יחידות משנה ותת יחידות β תאיות. שני מתחמי heteromeric הטופס האחרונים עם תת יחידות ₁ α שונים ולשנות את קינטיקה gating וסחר של הערוצים לקרום הפלזמה ^6.

בעשורים האחרונים, בטכניקות רבות כבר מועסקות ללמוד expre חלבוןssion, כגון אימונוהיסטוכימיה, assay immunosorbent צמוד אנזים, ניתוח מערבי וcytometry זרימה. טכניקות אלו דורשות השימוש בנוגדנים ספציפיים לזיהוי של חלבון מסוים של ריבית ומספקות כלים רבי עוצמה ללוקליזציה וההפצה של חלבונים ספציפיים ברקמות שונות. טכניקות המשמשות לאיתור וללכמת רמות ביטוי mRNA של חלבון מסוים, כגון ניתוח כתם צפוני, RT-PCR, בזמן אמת RT-PCR, הכלאה באתר, microarrays cDNA וassay הגנת ribonuclease לספק גישה חלופית כאשר נוגדנים אינם בקלות רמות ביטוי זמינות או אם של חלבון מסוים הן נמוכות ^7. עם זאת, מגבלה אחת לשימוש בטכניקות מולקולריות כזה הוא זיהוי הנדרש של רצף הגן.

בתרגום חלבונים ברשתית, אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע על רשתית wholemount. בשל הנגישות של RGCs, wholemountהכנה מספקת פלטפורמה מצוינת ללמוד הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים לsomata RGC והאקסונים שלהם.

בנוסף ללוקליזציה שלהם, ניתן להדגים כמה תכונות פונקציונליות של VGCCs בRGCs באמצעות השימוש בטכניקות הדמיה סידן. אנו מתארים פרוטוקול הדמיה סידן לתייג RGCs סלקטיבי עם צבע מחוון סידן למדידת דינמיקת סידן תוך תאי. התרומה של VGCCs שונה לאות סידן בתאים סלולריים שונים יכולה להיות מבודדת עם השימוש בחוסמי תעלות תת ספציפי Ca.

אולי אחד ההיבטים מועילים ביותר של טכניקת ההדמיה סידן שתוארה כאן היא היכולת להקליט בו זמנית ובאופן עצמאי מRGCs מרובה והאקסונים שלהם. למרות שרבי טכניקות פיסיולוגיות, כגון הקלטת מהדק תא כל תיקון, לספק הקלטות גבוהות זמניות רזולוציה של זרמי קרום, סומטי או מקור axonal של thesזרמי דואר נרשמו לא יכולים להיות מופלים ולהקלטות יכולות להתבצע רק מתא עצב בודד בכל פעם. מערכי Multielectrode (MEAs) מסוגלים בו זמנית הקלטת קוצים מהתאים רבים, אבל אינו יכולים לזהות ולא להפלות את ההפעלה של, למשל, תת שונה של תעלות סידן. MEAs מעדיף להקליט מהתאים הנמצאים בסמיכות לאלקטרודה נתנה ⁸ ושיא מהתאים שיוצרים קוצים גדולים ^9. שיטות הדמיה אופטיות לספק אסטרטגיה חלופית כדי לאפשר הקלטות בו זמנית ובלתי תלויות של אוכלוסיות שלמות של תאים שיכולים להיות משולבת עם המידע שהתקבל מmicroelectrode התא ותא והקלטת מהדק תיקון והקלטת MEA. למרות שטכניקות ההדמיה סידן המתוארות כאן הועסקו כדי ללמוד את דינמיקת סידן של RGCs, מהדק התיקון וMEAs יכולים גם לשמש במקביל על מנת להבהיר עוד יותר את הזרמים היוניים ומאפייני spiking של RGCs.

מאחר ותאי amacrine עקורים מרכיבים כ 60% מהאוכלוסייה העצבית בשכבת תא גנגליון בעכבר רשתית ^10, המטרה שלנו הייתה להשתמש בטכניקת העמסה שאופן סלקטיבי תוויות RGCs עם צבע מחוון סידן סינטטי ב הכנת wholemount. למרות צבעי מחוון סידן סינטטיים לספק פלטפורמה מצוינת ללימוד דינמיקת סידן תוך תאי, השימוש הנרחב שלה התעכב בשל חוסר היכולת לטעון ביעילות אוכלוסיות ספציפיות של תאי עצב בתוך רשת נתון. רבים טכניקות כגון טעינה בתפזורת ^{11 ו8,12} electroporation בוצעו לטעון אוכלוסיות שלמות של תאים, לעומת זאת, טכניקות אלה אינן מפלות בין סוגי תאים מסוימים. מבחינה גנטית מקודד מדדי סידן לספק את היכולת לתייג באופן סלקטיבי אוכלוסיות ספציפיות של תאים, לעומת זאת, שיטות אלו דורשות הדור של בעלי חיים מהונדסים ^13. הטכניקה שלנו מתארת ​​methoד לתייג RGCs סלקטיבי בהכנת wholemount באמצעות הזרקת גדם עצב ראייה של צבע מחוון סידן.

יחדיו, הטכניקות המבניות ופיזיולוגיות שתוארו במאמר זה מספקות פלטפורמה לחקור את הלוקליזציה ותרומה של VGCCs לאות סידן בRGCs והאקסונים שלהם.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות לרווחתם של חיות ניסוי שהונפקו על ידי מדיניות שירות בריאות הציבור בארה"ב על טיפול באדם ושימוש בחי מעבדה ואוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (UCLA) ועדת מחקר בבעלי חיים. חולדות ספראג-Dawley בוגרת זכר ונקבה (נהר המעבדה צ'ארלס, Wilmington, MA) בין גיל 3-5 שבועות היו בשימוש.

.1 בעלי חיים ורקמות הכנה לWholemount רשתית ואימונוהיסטוכימיה פרוטוקול

1. הכן את החומרים הבאים וכלים: מיקרוסקופ לנתח, 2 מלקחיים עם טיפים יפים מאוד, מספריים, נייר סינון תאית, פיפטה פלסטיק ושקופיות מיקרוסקופ.
2. להרדים את העכברוש בחדר סגור על ידי עמוק הרדמת בעלי החיים עם isoflurane 1-3% אחריו עריפת ראש עם גיליוטינה. הסר את העיניים עם זוג מספריים איריס ומניחים בצלחת פטרי המכילה פתרון תאי. מצב שינה, איימסdium או פתרונות פיסיולוגיים מומלצים.
3. [צעד אופציונאלי אם למלא את המשבצות של RGCs עם Fluo-4 היא רצויה]. לבצע את תיוג Fluo-4, כמתואר ב2.3-2.4 צעדים.
4. באמצעות מיקרוסקופ לנתח (עוצמת אור: 1.6 x 10 ⁸ פוטונים / ² מ"מ ⋅sec), להסיר את הקרנית על ידי חיתוך החלק הקדמי של העין הכדור. הסר את העדשה וזגוגית מפני שטח הרשתית הפנימי עם מלקחיים. כדי להסיר את הזגוגית, לייצב את גלגל העין על ידי לחיצה על לובן העין בחוזקה עם מלקחיים אחד. לקלף בעדינות את בסיס הזגוגית לכיוון מרכז הרשתית עם המלקחיים האחרים. ההכנה בשלב זה נקראת עיינית, המשמשת לcryosections. ניתן למצוא פרטים נוספים על cryosections באזכור ^14,15.
5. הסר את הרשתית מעיינית. ואז, להפוך את ארבעה חתכים, כדי לאפשר את הרשתית לשכבה. בעדינות לעלות הרשתית בשקופית מיקרוסקופ עם השכבה עד קולטי האור. הוסף טיפה אחת של פתרון לרשתית ולשים ceנייר סינון llulose על הרשתית. ברגע שהרשתית מתחברת לנייר הסינון, למקם את הרשתית חזרה בפתרון. במידת הצורך, לשטח את הרשתית עם מברשת או מלקחיים.
6. הנח את רשתיות wholemounted לPFA 4% עבור 10-15 דק 'לקיבעון.
7. שטוף את רשתיות wholemounted שלוש פעמים ל30 דקות ב0.1 M חיץ פוספט (PB), pH 7.4. לחסום את הרשתיות עם 5% עזים בסרום נורמלי או חמור בדם ב0.1 PB מכיל 0.3% Triton-X 100 ו0.1% NaN ₃ על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אנו ממליצים נפח סופי של μl 500 לכל הצעדים כדי להציל את הפתרונות ונוגדנים חסימה.
8. למחרת, דגירה wholemounts רשתיות עם 5-7 ימי הנוגדן הראשוניים ב 4 ° C.. דילולים אופטימליים צריכים להיקבע על ידי המשתמש.
9. שטוף את רשתיות 3 x 30 דקות בPB 0.1 M ודגירת הלילה בשעה 4 ° C בנוגדן fluorophore מצומדות- המקביל המשני שמופנה נגד המינים של הנוגדן הראשוני (ריכוז 1: 1,000).
10. לאחר שלוש שטיפות סופיות של 30 דקות כל אחד עם PB, הר הרשתיות בהרכבה בינונית. חותם את coverslips עם לק לאחסון ממושך. דגימות חנות ב 4 ° C ולהגן מפני אור.

.2 תיוג של תאים הגנגליון והאקסונים בעכברוש Wholemount רשתיות עם סידן המחוון דיי

1. הכן 1,000 מ"ל של Ringer של יונקים המכילים (במ"מ) 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl _2, 1.25 לאא ₂ PO _4, 1 MgCl _2, 25 NaHCO _3, ו10 גלוקוז מבעבע עם 95% O CO _2/5% ^­ _2.
2. לבצע את הנתיחה, כמתואר ב1.2-1.4 הצעדים.
3. כדי לטעון תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) והאקסונים שלהם עם צבע מחוון סידן, להזריק 0.5 μl של מלח Fluo-4 pentapotassium (40 מניית מ"מ בH ₂ O) לגדם עצב הראייה כ מ"מ אחורי 1 לגלגל העין באמצעות מזרק . כדי למדוד עליות דינמיות בתא גנגליון [Ca ^{2 +} ] _אני מחוון בזיקה גבוהה, כגון Fluo-4 עם _ד K של 345 ננומטר, הוא אופטימלי. Fluo-4 מציע יתרון נוסף שיש לו יעילות קוונטית גבוהה מאוד וכתוצאה מכך גידול פליטה של> 100 לקפל כאשר חייב סידן.
4. הנח את עיינית בCO _2/5% מבעבע עם 95% O רינגר יונקים ^­ ₂ לשעה 1 בטמפרטורת חדר בחושך.

פרוטוקול הדמיה 3 סידן לתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים.

1. הסר את העין, העדשה וזגוגית כמתואר בשלבי 1.1-1.4. לבודד את הרשתית מעיינית ומתחלקים לרביעים. צד הר תא גנגליון רבע אחד על שקופית זכוכית ולהשתמש ברשת פרוסת נבל כדי לייצב אותו. שמור את החלקים האחרים כהים מותאמים בCO _2/5% מבעבע עם 95% O רינגר יונקים ^­ ₂ על קרח לשימוש מאוחר יותר.
2. Superfuse חדר ההקלטה עם הפתרון של רינגר יונקים ולשמור על הפתרון המבעבע ברציפות עם 95% O _2/5% CO _2.
3. תמונת הרקמה תחת המיקרוסקופ. ניסויי התנהגות בטמפרטורת חדר (~ 23 מעלות צלזיוס) או להשיג טמפרטורות פיסיולוגיות על ידי התחממות השלב, חימום אמבט המים מתחת לדגימה או החלת אוויר חם אל פני השטח של הדגימה.
   הערה: חשוב לציין כי רבים תפקודים תאיים מוסדרים על ידי טמפרטורה, אשר ממלאת תפקיד מפתח בשמירה על הומאוסטזיס תאיים ^16. עם זאת, כניסתה של אמצעי ההתחממות עשויה להגדיל את שיעור photobleaching, אידוי של הסחיפה בינונית ומיקוד הנגרמת על ידי התפשטות תרמית ^17. שימוש בטמפרטורת חדר יורד מידור תאיים של Fluo-4 ^18.
4. לבצע שליטה של שתי K ⁺ פולסים גבוהים לזווג בהעדר תרופות. Depolarize האקסונים RGCs וRGC ידי העלאה [K ^+] _o מ3 מ"מ ל60 מ"מ ל33 שניות במהלך כל דופק כדי להפעילVGCCs עם מערכת superfusion מונעת שמונה הכבידה ערוץ. להפחית Na ⁺ על ידי 57 מ"מ לשמור isosmolarity בפתרון K ⁺ הגבוה.
5. להעריך את התרומה של VGCCs שונה לאות סידן עם השימוש בחוסמי תעלות Ca כלליות או ספציפיים. לדוגמא, הירידה באות סידן הבא הממשל של קובלט חוסם תעלות הסיד שאינו ספציפי, ובלבד מידה חצי כמותית של התרומה של VGCCs לגבוה K אות סידן -evoked ^+.
6. לרכוש ערכי עוצמת הקרינה על ידי הצבת אזור של עניין (ROI) ברחבי RGCs של עניין (איור 2).
7. לנרמל את השינוי בעוצמת הקרינה המיוצרת על ידי הגבוה K השני ⁺ שיא לשינוי המיוצר על ידי הגבוהה K ⁺ השיא הראשון. ואז, לבדיקה של חוסמי תעלות סידן ספציפיים, תחול תרופות רק בדופק K ⁺ הגבוה השני של זוג ולנרמל את השיא הזה נגדערך השיא הראשון. כדי למדוד את ההשפעה של התרופה על הגבוהה K ⁺ השיא, לחלק את המשרעת של K ⁺ השיא השני על ידי זה של הראשונה. ניתוח צריכה להתבצע על ערכים אלה בביחס לבקרות ההתאמה שלהם נגזרות מגבוה K לזווג ⁺ פסגות נמדדו בהעדר התרופה.
8. לרכוש תמונות ב5 מרווחי שניות. כדי להימנע מצילום הלבנה, לשמור על עירור הלייזר נמוך ככל האפשר. לספק עירור על ידי קו 488 ננומטר של לייזר הארגון, תוך הצינור מכפיל אוסף את פליטת הניאון דרך מסנן LP 505 ננומטר.

תוצאות

Immunolabeling עם נוגדנים ספציפיים מספק פלטפורמה ללמוד הלוקליזציה של חלבונים מסוימים של עניין ברשתית וטכניקת ההדמיה סידן מאפשר המחקר של התרומה של VGCCs לדינמיקה סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

על ידי שימוש בנוגדנים נגד RBPMS חלב?...

Discussion

במאמר זה, שתארנו שתי טכניקות שונות: 1) אימונוהיסטוכימיה להראות Fluo-4 לוקליזציה לתאי הגנגליון ברשתית wholemounts, ו2) סידן הדמיה כדי לנתח דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

אימונוהיסטוכימיה באמצעות wholemounts נעשתה שימוש כדי ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight scissors	WPI	14124-G	dissecting tools
Straight Forceps	WPI	501985	dissecting tools
curved iris scissors	WPI	504487	dissecting tools
Cellulose filter paper	Millipore	HABP04700
Hibernate A	Invitrogen	A12475-01	Media
Vectashield	Vector	H-1000	Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium	Invitrogen	F-14200
Isoflurane	Abbott Laboratories	05260-05	anesthesia
Microscope slide	Fisher Scientific	22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope	Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens	Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular Probes	A-11034	Secondary antibody
RBPMS	ProSci, Poway, CA		A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).