Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

Riepilogo

Immunoistochimica protocolli sono utilizzati per studiare la localizzazione di una specifica proteina nella retina. Tecniche di imaging di calcio sono impiegate per studiare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.

Abstract

In questo documento si descrivono gli strumenti, reagenti, e le misure pratiche che sono necessarie per: 1) preparazione di successo di retine wholemount per immunoistochimica e, 2) Calcio Imaging per lo studio di tensione gated canali del calcio (VGCC) mediata segnalazione di calcio in retina cellule gangliari. Il metodo di imaging del calcio descriviamo questioni aggira in materia di non-specifico carico di cellule amacrine sfollati nello strato di cellule gangliari.

Introduzione

Cellule gangliari retiniche (RGC) esprimono L, N-, P / Q e T-tipo VGCC come determinato attraverso il blocco farmacologico di queste componenti della cellula intera Ca canale corrente ^1,2. VGCC sono proteine ​​transmembrana multimerici che sono coinvolte nel rilascio del trasmettitore, la trascrizione del gene, regolazione cellulare e sinaptica plasticità ^3,4,5. VGCCs funzionali sono costituiti da almeno tre classi distinte di subunità: grandi, transmembrana α ₁ formano pori subunità che stabiliscono proprietà biofisiche e farmacologiche del canale, α ausiliario principalmente extracellulare ₂ subunità δ e subunità β intracellulari. Gli ultimi due complessi di forma eteromerici con diverse subunità α ₁ e alterano la cinetica gating e il traffico dei canali alla membrana plasmatica ^6.

Negli ultimi decenni, molte tecniche sono state impiegate per lo studio delle proteine ​​espresfissione, come la immunoistochimica, enzyme-linked test immunoenzimatico, analisi occidentale e citometria a flusso. Queste tecniche richiedono l'uso di anticorpi specifici per l'individuazione di una data proteina di interesse e forniscono strumenti potenti per la localizzazione e la distribuzione di proteine ​​specifiche nei diversi tessuti. Le tecniche utilizzate per rilevare e quantificare i livelli di espressione di mRNA di una particolare proteina come l'analisi Northern blot, RT-PCR, real-time RT-PCR, ibridazione in situ, cDNA microarray e analisi di protezione della ribonucleasi forniscono un approccio alternativo quando gli anticorpi non sono facilmente livelli di espressione disponibile o se di una particolare proteina sono bassi ^7. Tuttavia, una limitazione all'uso di tali tecniche molecolari è l'identificazione desiderata della sequenza genica.

Per localizzare proteine ​​nella retina, immunoistochimica può essere eseguita su retine wholemount. A causa della accessibilità dei RGCs, la wholemountpreparazione fornisce una piattaforma eccellente per studiare la localizzazione di specifiche proteine ​​al somata RGC e dei loro assoni.

Oltre alla loro localizzazione, alcune proprietà funzionali dei VGCCs in RGC sono evidenziabili attraverso l'uso di tecniche di imaging calcio. Descriviamo un protocollo di imaging del calcio di etichettare selettivamente RGCs con un indicatore di calcio colorante per misurare la dinamica del calcio intracellulare. Il contributo di diversi VGCCs al segnale calcio in differenti compartimenti cellulari può essere isolata con l'uso di specifici del sottotipo Ca bloccanti dei canali.

Forse uno degli aspetti più positivi della tecnica di imaging del calcio qui descritta è la capacità di registrare simultaneamente e indipendentemente da più RGCs e dei loro assoni. Anche se molte tecniche fisiologiche, come ad esempio intera registrazione patch clamp cellulare, forniscono ad alta risoluzione temporale registrazioni delle correnti di membrana, il somatico o fonte assonale di thesE le correnti registrate non possono essere discriminati e registrazioni possono essere effettuate solo da un singolo neurone alla volta. Array multielettrodico (MEA) sono in grado di registrare simultaneamente punte da molte cellule, ma possono né rilevare né discriminare l'attivazione di, ad esempio, diversi sottotipi di canali del calcio. MEAS preferenzialmente registrare da cellule che si trovano in prossimità di un dato elettrodo ⁸ e registrare da cellule che generano grandi picchi ^9. Metodi di imaging ottici forniscono una strategia alternativa per consentire le registrazioni simultanee e indipendenti di intere popolazioni di cellule che possono essere integrate con le informazioni ottenute da microelettrodo singola cellula e la registrazione patch clamp e la registrazione MEA. Sebbene le tecniche di imaging del calcio qui descritti sono stati impiegati per studiare la dinamica del calcio di RGCs, patch clamp e MEA può essere utilizzato anche in parallelo per chiarire ulteriormente le correnti ioniche e spiking proprietà dei RGCs.

Dato che le cellule amacrine sfollati costituiscono circa il 60% della popolazione neuronale nello strato di cellule gangliari della retina di topo ^10, il nostro obiettivo era quello di utilizzare una tecnica di carico che etichette selettivamente RGCs con un indicatore di calcio sintetico colorante in un preparazione wholemount. Sebbene coloranti sintetici indicatori di calcio offrono una piattaforma eccellente per lo studio della dinamica del calcio intracellulare, la sua diffusione è stata ostacolata dall'incapacità di caricare efficacemente specifiche popolazioni di neuroni all'interno di una data rete. Molte tecniche come la massa di carico ¹¹ ed elettroporazione ^8,12 sono stati eseguiti per caricare intere popolazioni di cellule, tuttavia, tali tecniche non discriminano tra i tipi cellulari specifici. Geneticamente codificati indicatori di calcio offrono la possibilità di etichettare selettivamente specifiche popolazioni di cellule, tuttavia, tali metodi richiedono la generazione di animali transgenici ^13. La nostra tecnica descrive un metod di etichettare selettivamente RGCs nella preparazione wholemount tramite ottico iniezione moncone del nervo di un indicatore di calcio colorante.

Nel loro insieme, le tecniche strutturali e fisiologiche descritte in questo articolo fornire una piattaforma per studiare la localizzazione e il contributo delle VGCCs al segnale calcio nel RGCs e dei loro assoni.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per il benessere degli animali da esperimento emesse dalla politica US Public Health Service on Human Care e uso di animali da laboratorio e la University of California-Los Angeles (UCLA) comitato per la ricerca degli animali. Sono stati utilizzati Maschio e femmina adulto ratti Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) tra l'età di 3-5 settimane.

1. animali e tessuti Preparazione Wholemount Retina e Immunoistochimica protocollo

1. Preparare i seguenti materiali e strumenti: un microscopio da dissezione, 2 pinze con punte molto fini, forbici, carta da filtro di cellulosa, pipetta di plastica e un vetrino da microscopio.
2. Euthanize il topo in una camera chiusa da anestetizzare profondamente l'animale con il 1-3% isoflurano seguita da decapitazione con una ghigliottina. Rimuovere gli occhi con un paio di forbici iris e posto in una capsula di Petri contenente la soluzione extracellulare. Hibernate A, Ames Mesono raccomandati dium o soluzioni fisiologiche.
3. [Passo Facoltativo se riempimento di RGCs con Fluo-4 è desiderato]. Eseguire l'etichettatura Fluo-4 come descritto nei passaggi 2,3-2,4.
4. Utilizzando il microscopio da dissezione (intensità della luce: 1,6 x 10 ⁸ fotoni / mm ² ⋅sec), rimuovere la cornea tagliando la parte anteriore del bulbo oculare. Rimuovere la lente e vitreo dalla superficie retinica interna con una pinza. Per rimuovere il vitreo, stabilizzare il bulbo oculare tenendo la sclera saldamente con una pinza. Rimuovere delicatamente la base del vitreo verso il centro della retina con l'altra pinza. La preparazione in questa fase si chiama oculare, che viene utilizzato per criosezioni. Maggiori informazioni su criosezioni possono essere trovati nei riferimenti ^14,15.
5. Rimuovere la retina dalla oculare. Quindi, fare quattro tagli per consentire la retina per distesi. Montare delicatamente la retina su un vetrino da microscopio con il fotorecettore livello verso l'alto. Aggiungere una goccia di soluzione alla retina e mettere cecarta da filtro llulose sulla retina. Una volta che la retina si attacca alla carta da filtro, posizionare la retina posteriore in soluzione. Se necessario, appiattire la retina con una spazzola o pinze.
6. Posizionare le retine wholemounted in PFA 4% per 10-15 minuti per il fissaggio.
7. Lavare le retine wholemounted tre volte per 30 min in tampone fosfato 0,1 M (PB), pH 7.4. Bloccare le retine con il 5% di siero di capra normale o siero asino in 0,1 PB contenente 0,3% Triton X-100 e 0,1% NaN ₃ a 4 ° C durante la notte. Si consiglia un volume finale di 500 ml per tutti i passi per salvare le soluzioni di blocco e anticorpi.
8. Il giorno dopo, incubare le wholemounts retine con le primarie di anticorpi 5-7 giorni a 4 ° C. Diluizioni ottimali devono essere determinati dall'utente.
9. Lavare le retine 3 x 30 min in PB 0.1 M e incubare una notte a 4 ° C nel corrispondente anticorpo secondario fluoroforo coniugato diretto contro le specie del anticorpo primario (concentrazione 1: 1.000).
10. Dopo tre lavaggi finali di 30 minuti ciascuno con PB, montare le retine di mezzo di montaggio. Sigillare il coprioggetto con smalto per lo stoccaggio prolungato. Conservare i campioni a 4 ° C e proteggere dalla luce.

2 Etichettatura delle cellule gangliari e degli assoni in Rat Wholemount retine con un calcio colorante indicatore

1. Preparare 1.000 ml di mammiferi Ringer contenente (in mM) 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 1 _MgCl2, 25 _NaHCO3 e 10 glucosio bolliti con 95% O _2/5% di CO ^­ _2.
2. Eseguire la dissezione, come descritto nella procedura 1.2-1.4.
3. Per caricare le cellule gangliari retiniche (RGC) e dei loro assoni con un indicatore di calcio colorante, iniettare 0,5 ml di Fluo-4 sale pentapotassico (40 mM magazzino in H ₂ O) nel moncone del nervo ottico di circa 1 mm posteriormente al bulbo oculare con una siringa . Per misurare gli aumenti dinamici in cellule gangliari [Ca ^{2 +} ] _ho un indicatore con alta affinità, come Fluo-4 con il suo K _d di 345 nm, è ottimale. Fluo-4 offre l'ulteriore vantaggio di avere una altissima efficienza quantica con un conseguente aumento delle emissioni di> 100 volte quando si lega al calcio.
4. Mettere il paraocchi in mammiferi di Ringer bollito con il 95% O _2/5% di CO ^­ ₂ per 1 ora a temperatura ambiente al buio.

3. Imaging di calcio Protocollo per cellule gangliari retiniche e assoni.

1. Rimuovere l'occhio, cristallino e vitreo come descritto nei passaggi 1,1-1,4. Isolare la retina dalla oculare e dividere in quadranti. Mount lato cellule gangliari un quadrante su un vetrino e utilizzare una griglia fetta arpa per stabilizzarlo. Mantenere gli altri pezzi dark-adattato in mammiferi di Ringer bollito con il 95% O _2/5% di CO ^­ ₂ su ghiaccio per un uso successivo.
2. Superfuse camera di registrazione con la soluzione di Ringer e mammiferimantenere la soluzione ribolle continuamente con il 95% O _2/5% di CO _2.
3. Immagine il tessuto al microscopio. Condurre esperimenti a temperatura ambiente (~ 23 ° C) o raggiungono temperature fisiologiche riscaldando il palco, riscaldando il bagno d'acqua sotto il campione o l'applicazione di aria calda sulla superficie del campione.
   Nota: E 'importante notare che molte funzioni cellulari sono regolate dalla temperatura, che svolge un ruolo chiave nel mantenimento dell'omeostasi intracellulare ^16. Tuttavia, l'introduzione di misure di riscaldamento può aumentare il tasso di photobleaching, evaporazione della deriva medio e fuoco causata dall'espansione termica ^17. L'uso della temperatura ambiente diminuisce intracellulare compartimentalizzazione di Fluo-4 ^18.
4. Eseguire un controllo di due K ⁺ impulsi alti appaiati in assenza di farmaci. Depolarizzare RGCs e assoni RGC aumentando la [K ^+] _o da 3 mm a 60 mm per 33 secondi durante ogni impulso per attivareVGCCs con un sistema di superfusione guidato otto gravità canale. Ridurre Na ⁺ da 57 mm per mantenere isosmolarity nella soluzione di elevata K ^+.
5. Valutare il contributo delle diverse VGCCs al segnale di calcio con l'uso di bloccanti generali o specifici del canale Ca. Ad esempio, la riduzione del segnale calcio dopo la somministrazione di un non-specifico bloccante dei canali del calcio, cobalto, purché una misura semi-quantitativa del contributo dei VGCCs all'alta K ⁺ segnale calcio -evoked.
6. Acquisire i valori di intensità di fluorescenza posizionando una regione di interesse (ROI) intorno alle RGC di interesse (Figura 2).
7. Normalizza la variazione di intensità di fluorescenza prodotta dal secondo alta K ⁺ picco alla variazione prodotta dalla prima alta K ⁺ picco. Poi, per la sperimentazione di specifici bloccanti dei canali del calcio, farmaci applicare solo nel corso del secondo alto K ⁺ impulso di una coppia e normalizzare questo picco controil primo valore di picco. Per misurare l'effetto del farmaco in alto K ⁺ picco, dividere l'ampiezza del secondo picco K ⁺ da quella del primo. L'analisi deve essere eseguita su questi valori rispetto ai loro controlli corrispondenti derivati ​​dal accoppiato alta K ⁺ picchi misurata in assenza di farmaco.
8. Acquisire immagini a intervalli di 5 sec. Per evitare foto-sbiancamento, mantenere l'eccitazione laser più basso possibile. Fornire eccitazione dalla linea 488 nm del laser argon, mentre il tubo fotomoltiplicatore raccoglie l'emissione fluorescente attraverso un filtro LP 505 nm.

Risultati

Immunomarcatura con anticorpi specifici fornisce una piattaforma per studiare la localizzazione di particolari proteine ​​di interesse nella retina e la tecnica di imaging calcio permette lo studio del contributo dei VGCCs verso le dinamiche di calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.

Utilizzando un anticorpo contro le RBPMS proteine ​​delle cellule gangliari (RNA binding protein con splicing multipla) che identifica selettivamente RGCs ^19, siamo stati i...

Discussione

In questo articolo, abbiamo descritto due diverse tecniche: 1) L'immunoistochimica per mostrare Fluo-4 localizzazione delle cellule gangliari della retina in wholemounts, e 2) Calcio Imaging per analizzare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.

Immunoistochimica utilizzando wholemounts è stato utilizzato per rivelare la localizzazione delle proteine ​​nei roditori retina ^20-23. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni. La qualità della c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight scissors	WPI	14124-G	dissecting tools
Straight Forceps	WPI	501985	dissecting tools
curved iris scissors	WPI	504487	dissecting tools
Cellulose filter paper	Millipore	HABP04700
Hibernate A	Invitrogen	A12475-01	Media
Vectashield	Vector	H-1000	Mounting Media for Fluorescence
Fluo-4 pentapotassium	Invitrogen	F-14200
Isoflurane	Abbott Laboratories	05260-05	anesthesia
Microscope slide	Fisher Scientific	22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal microscope	Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens	Zeiss
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Molecular Probes	A-11034	Secondary antibody
RBPMS	ProSci, Poway, CA		A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).