El uso de la cromatografía de gases para analizar los cambios de composición de ácidos grasos en el tejido de hígado de rata durante el embarazo

Resumen

El embarazo provoca cambios significativos en la composición de ácidos grasos de los tejidos maternos. Los perfiles lipídicos se pueden obtener por medio de la cromatografía de gases para permitir la identificación y cuantificación de los ácidos grasos en las clases de lípidos individuales entre las ratas alimentadas con diferentes dietas de alta y baja en grasa durante el embarazo.

Resumen

La cromatografía de gases (GC) es un método altamente sensible para identificar y cuantificar el contenido de ácidos grasos de los lípidos de los tejidos, las células y el plasma / suero, obteniéndose resultados con alta precisión y alta reproducibilidad. En estudios metabólicos y de la nutrición GC permite la evaluación de cambios en las concentraciones de ácidos grasos siguientes intervenciones o durante cambios en el estado fisiológico tal como el embarazo. Extracción en fase sólida (SPE) usando cartuchos de sílice aminopropilo permite la separación de las principales clases de lípidos incluyendo triglicéridos, fosfolípidos diferentes, y ésteres de colesterol (CE). GC combinado con SPE se utilizó para analizar los cambios en la composición de ácidos grasos de la fracción de CE en los hígados de ratas vírgenes y embarazadas que habían sido alimentados con diferentes dietas altas y bajas en grasa. Hay importantes efectos de la interacción dieta / el embarazo sobre el contenido de ácidos grasos omega-3 y omega-6 ácidos grasos de la CE de hígado, lo que indica que las mujeres embarazadas tienen una respuesta diferente a la dieta manipulatión que se observa entre las hembras vírgenes.

Introducción

La cromatografía de gases (GC) es una técnica bien establecida se utiliza para identificar y cuantificar la incorporación de ácidos grasos al interior de las acumulaciones de lípidos y membranas celulares ^{de 1,2} durante la suplementación o fisiológicas condiciones tales como la obesidad y enfermedades relacionadas (como la diabetes) o un embarazo ^{3 - 5.} También es adecuado para el análisis de los tipos y cantidades de grasas en los alimentos. Esto es útil cuando la caracterización de las dietas experimentales, así como garantizar que la industria alimentaria cumple con la normativa. Por ejemplo, GC se puede utilizar para confirmar la identidad y la cantidad de ácidos grasos dentro de un producto, tales como un suplemento dietético para asegurar que el etiquetado es correcto y reglamentos se adhiere a ^6,7. Análisis de ácidos grasos puede proporcionar información valiosa sobre el metabolismo de lípidos en la salud y la enfermedad, el impacto del cambio en la dieta, y el efecto de los cambios en el estado fisiológico ^8. Uso de GC para estudiar muestras durante el embarazo ha proporcionado importanteinformación sobre los cambios en los ácidos grasos y la homeostasis de los lípidos complejos ^3.

Antes de la separación cromatográfica, los lípidos son típicamente extrae de la muestra usando la solubilidad de los lípidos en mezclas de disolventes de cloroformo y metanol. Se añade cloruro de sodio para facilitar la separación de la mezcla en lípidos acuosa y orgánica que contiene fases ^9,10. Clases de lípidos complejo de interés se pueden separar a partir del extracto total de lípidos por extracción en fase sólida (SPE). Esta técnica de separación eluye clases de lípidos basados ​​en su polaridad o afinidad de unión. Triacilgliceroles (TAG) y los ésteres de colesterol (CE) se eluyen primero como una fracción combinada, otras clases, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), y ácidos grasos no esterificados (NEFA) se eluyen mediante el aumento de la polaridad del disolvente de elución . La separación de los TAG de CE explota la unión de TAG sólo a un cartuc SPE frescadge, lo que permite a la CE ser eluido. TAG puede entonces ser eluido mediante el aumento de la polaridad del disolvente de elución ^9,10. Este método permite múltiples muestras para ser separadas simultáneamente con un mayor rendimiento que se consigue con cromatografía en capa fina, lo que significa que muestras relativamente pequeñas de tamaño (por ejemplo, <100 l de plasma o suero, <100 mg de tejido) pueden ser analizados ^11,12.

GC es una técnica bien establecida descrita por primera vez en la década de 1950; se sugirió que la fase móvil en los sistemas a continuación, líquido-líquido podría ser sustituido con de vapor. Fue utilizado inicialmente para el análisis de petróleo, pero rápidamente se expandió a otras áreas como el análisis de aminoácidos y la bioquímica de los lípidos, que sigue siendo de gran interés. Los avances en equipos de GC y la tecnología, como el desarrollo de las columnas capilares de las columnas de relleno utilizados anteriormente han llevado a nuestras técnicas actuales en los que los ácidos grasos son capaces de serseparados de manera más eficiente a temperaturas más bajas que resultan en GC se utiliza rutinariamente para identificar y cuantificar los ácidos grasos en una amplia gama de investigaciones ^13.

GC requiere ácidos grasos para ser derivatizados con el fin de que puedan llegar a ser suficientemente volátil para ser eluida a temperaturas razonables sin descomposición térmica. Esto normalmente implica la sustitución de un grupo funcional que contiene hidrógeno para formar ésteres, tioésteres o amidas para el análisis. Los ésteres metílicos se estudian comúnmente derivados, que son producidos por metilación. En este método los enlaces éster en los lípidos complejos se hidrolizan para liberar ácidos grasos libres, que se transmethylated para formar ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME). El perfil resultante de FAME, determinado por GC, se conoce como la composición de ácidos grasos y puede ser fácilmente comparado entre los diferentes grupos experimentales ^9,10. La técnica permite tanto a las proporciones de indiviácidos grasos UAL y sus concentraciones a medir.

Además de la utilización de GC para el análisis de ácidos grasos en los estudios de nutrición y en la industria alimentaria, la técnica se puede utilizar en una amplia gama de campos analíticos. Por ejemplo, los análisis ambientales utilizando GC incluyen la medición de la contaminación del agua por los insecticidas y los análisis de suelos medir el contenido de clorobenceno. En toxicología, GC también se ha utilizado para identificar las sustancias ilegales en la orina y muestras de sangre de los individuos; unos potenciadores tales rendimiento deportivo ¹² y la capacidad de separar mezclas complejas de hidrocarburos hace que esta técnica popular en la industria petrolera para el análisis petroquímica ^12.

El embarazo se asocia con cambios significativos en la composición de ácidos grasos de los tejidos maternos, específicamente en el contenido de ácidos grasos omega-3 (n-3) y omega-6 (n-6) aci grasos poliinsaturadosds (PUFA) ^3. En el estudio actual, ejemplificamos el uso de GC en la medición de los ácidos grasos mediante la descripción de su uso en el análisis de la composición de ácidos grasos del tejido del hígado tomado de ratas vírgenes y gestantes alimentadas con dietas altas y bajas en grasa con diferentes fuentes de petróleo. Las dietas experimentales que aquí eran una base de aceite de soja dieta baja en grasas, una dieta alta en grasas a base de aceite de soja (130,9 g de grasa total / kg de grasa total) o (130,9 g de grasa total / kg con una dieta alta en grasas a base de aceite de linaza dieta), proporcionado por 20 días. La composición de ácido graso total de nutrientes y de estas dietas se han descrito previamente ^14. Las dietas de aceite de soja son ricos en ácido linoleico (18:2 n-6) y contienen algo de ácido α-linolénico (18:3 n-3), mientras que la dieta de aceite de linaza es rica en ácido α-linolénico. Estas dietas altas en grasas representan diferentes raciones de ácidos linoleicos a α-linolénico (raciones de 08:01 y 01:01, respectivamente). El método para el aislamiento de clases de lípidos individuales y el análisis por GC es quell establecido y validado, y que ha sido previamente publicado ¹⁰ pero sin la descripción técnica detallada contenida aquí.

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Protocolo

1. Procedimientos animales

1. Todo animal de trabajo debe llevarse a cabo de acuerdo con el Ministerio del Interior Animales (Procedimientos Científicos) de la Ley (1986).
2. Mate de ratas Wistar a partir de 10 semanas de edad mediante la cría monógama, y ​​confirmar el embarazo por la aparición de un tapón vaginal. Anote este como el día 1 de la gestación, y comenzar la dieta experimental. Para las hembras vírgenes, albergar cada rata individual, y comenzar la dieta experimental.
3. Después de alimentar a las dietas experimentales durante 20 días la eutanasia a las ratas por asfixia de CO ₂ seguido por dislocación cervical.
4. El uso de fórceps y tijeras de disección para exponer la cavidad abdominal y extirpar el hígado mediante la reducción de los ligamentos, que conectan el hígado al diafragma, la pared anterior del abdomen, el estómago y el duodeno. Lavar el hígado en PBS y congelar en nitrógeno líquido antes de guardarlo a -80 ° C.

2. Preparación de un extracto lipídico total ⁹

1. Añadir molecultamices ar (para llenar 1/10 del recipiente de disolvente) a todos los disolventes para crear disolventes "secos". Llevar a cabo todos los trabajos de disolvente dentro de una campana de humos.
2. Cortar aproximadamente 100 mg de hígado congelado y pesar. Coloque el tejido en un tubo en un cubo de hielo y se añade 0,8 ml de hielo frío 0,9% de NaCl. Homogeneizar el tejido.
3. Añadir estándares internos disueltos en 1 ml / mg de cloroformo seco: metanol (02:01, v / v) que contiene hidroxitolueno butilado (BHT; 50 mg / l) como anti-oxidante. Durante 100 mg de hígado de rata añaden 100 g de la norma CE (Cholesteryl heptadecanoato 17:00) Precaución:. Cloroformo y BHT son peligrosos.
4. Añadir 5,0 ml de cloroformo seco: metanol (02:01, v / v) que contenía BHT (50 mg / L).
5. Añadir 1,0 ml de 1 M NaCl, mezclar bien por agitación hasta que la mezcla se ve uniforme. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana.
6. Centrifugar a 1000 xg durante 10 minutos, bajo el freno a temperatura ambiente.
7. Recoger menorfase con una pipeta Pasteur de vidrio, traslado al nuevo tubo de vidrio de tapón de rosca y seco bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana.

3. La separación de clases de lípidos por extracción en fase sólida (SPE) ¹⁰

1. Conectar el depósito de la SPE a una bomba de vacío y colocar aminopropil cartucho SPE de sílice en el tanque.
2. Coloque el nuevo tubo de vidrio con tapón de rosca TAG marcado CE y en el bastidor del tanque en la columna para recoger primera fracción.
3. Disolver el extracto de lípidos totales en 1,0 ml de cloroformo seco y vórtice.
4. Aplicar la muestra a la columna usando una pipeta Pasteur de vidrio y dejar a gotear a través de en el tubo con tapón de rosca por gravedad. Cuando no hay más gotas caen, eliminar el líquido restante por medio de vacío.
5. Se eluye la fracción TAG y CE al vacío, se lava la columna con 2 x 1,0 ml lavados de cloroformo seco.
6. Cuando se elimina todo el líquido, se seca el TAG y CE fraction bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana.
7. Coloque el nuevo tapón de rosca tubo de vidrio PC marcado en la bandeja del tanque, en la columna.
8. Eluir la fracción de PC bajo vacío con la adición de 2 x 1,0 ml de cloroformo seco: metanol (60:40, v / v) hasta que se retira todo el líquido de la columna.
9. Retire y fracción PC seco bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana.
10. Colocar un nuevo tapón de rosca de tubo de vidrio de PE marcado en la bandeja de depósito y eluir la fracción de PE con la adición de 1,0 ml de metanol seco bajo vacío.
11. Retire y fracción PE seco bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana.
12. Coloque el nuevo tubo de vidrio con tapón de rosca marcado NEFA en la bandeja de depósito y eluir la fracción de NEFA bajo vacío por la adición de 2 x 1,0 ml de lavados de cloroformo seco: metanol: ácido acético glacial. (100:2:2, v / v / v) Precaución: El ácido acético glacial es peligroso.
13. Eliminar fracción recogida de NEFA y seco bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana.
14. Coloque un nuevo cartucho de SPE de sílice aminopropilo en el tanque de SPE y colocar un tubo de vidrio con tapón de rosca en la bandeja del tanque debajo del cartucho de recogida de residuos.
15. Lavar la columna con 3 lavados de hexano seco bajo vacío y luego un lavado de 1,0 ml final bajo la gravedad. No permita que el cartucho se seque (a su vez los canales de columna de cartucho a una posición cerrada cuando el nivel de hexano se encuentra cerca de la matriz de cartucho) Precaución:. Hexano es peligroso.
16. Vuelva a colocar el tubo de residuos con tubo de vidrio nuevo tapón de rosca marcado CE.
17. Disolver la fracción TAG y CE se secó (preparado en la etapa 3.6) en 1,0 ml de hexano seco y vórtice. Aplicar esto a la columna usando una pipeta Pasteur de vidrio y dejar a gotear a través de bajo gRavity.
18. Cuando no hay más gotas caen, eliminar el líquido restante al vacío.
19. En el vacío, se lava la columna con 2 x 1,0 ml lavados de hexano seco para eluir CE y fracción recogida seco bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana.
20. Coloque el nuevo tubo de vidrio con tapón de rosca de TAG marcado en la bandeja del tanque y TAG eluir con la adición de 2 x 1,0 ml de lavados de hexano seco: metanol: acetato de etilo (100:5:5) bajo vacío.
21. Fracción seco recogido en nitrógeno a 40 ° C. Las muestras pueden ser tapados y almacenados a -20 ° C en esta etapa hasta por una semana Precaución:. Acetato de etilo es peligroso.

4. Preparación de FAME de CE ¹⁰

1. Añadir 0,5 ml de tolueno seco a la fracción CE separados (recogido en el paso 3.19) y agitar Precaución:. Tolueno es peligroso.
2. Prepare el reactivo de metilación (metanol seco con 2% (v/ V) de H ₂ SO _4), de los cuales 1,0 ml se requiere por muestra. Dispensar el volumen de metanol seco en un vaso o recipiente de plástico con tapa apto y agregue la cantidad necesaria de H ₂ SO _4, gota a gota y mezcle por inversión Precaución:. El ácido sulfúrico es peligroso.
3. Añadir 1,0 ml de reactivo de metilación de las muestras disueltas en tolueno seco, tapar los tubos de forma segura, y mezclar suavemente.
4. Calentar las muestras durante 2 horas a 50 ° C.
5. Después de 2 horas retirar los tubos de calor. Una vez fría añadir 1,0 ml solución neutralizante (0,25 M _KHCO3 0.5MK ₂ CO ₃₎ Precaución:. Bicarbonato de potasio y carbonato de potasio son peligrosos.
6. Añadir 1,0 ml de hexano seco y vórtice.
7. Se centrifuga a 250 g durante 2 min, bajo el freno a temperatura ambiente.
8. Recoger la fase superior, que contiene la FAME, y transferir a un nuevo tubo de vidrio desechable sin tapa roscada.
9. Seque el FAMA recogido bajode nitrógeno a 40 ° C. Las muestras se pueden taparon y se almacenaron a -20 ° C en esta etapa hasta una semana.

5. Eliminación de la contaminación colesterol libre de FAME CE ¹⁴

(Colesterol libre puede contaminar la muestra; vea la Figura 1 en busca de rastros ejemplo cromatógrafo con y sin eliminación de colesterol).

1. Coloque un tubo de residuos en el tanque de SPE y colocar un cartucho de SPE de gel de sílice en el tanque.
2. Lavar la columna con 3 x 1 ml de lavados de hexano seco bajo vacío y 1 x 1 ml bajo la gravedad.
3. Retire los residuos lavados y agregar nuevo tubo de residuos en el tanque.
4. Disolver FAME CE en 1 ml de hexano seco, vórtice.
5. Aplicar a la columna usando una pipeta Pasteur de vidrio y dejar que gotee a través bajo gravedad.
6. Lavar la columna con 3 x 1 ml lavados de hexano al vacío.
7. Retire los residuos lavados y colocar nuevo tubo sin tapón de rosca en el tanque de la etiqueta FAME CE.
8. Eluir laFAME CE con 2 x 1 ml de hexano seco: éter dietílico (95:5 v / v) lavados.
9. Seco bajo nitrógeno a 40 ° C. Las muestras pueden ser tapados y almacenados a -20 ° C en esta etapa hasta por una semana Precaución:. Éter dietílico es peligroso.

6. Transferencia de FAME en GC Auto Sampler Vial

1. Añadir 75 l de hexano seco para probar, vórtice, y la transferencia a un GC muestra auto vial.
2. Añadir un 75 hexano l seca aún más a la muestra, vórtice y traslado a la misma GC muestra auto vial. Las muestras pueden ser tapados y almacenados a -20 ° C en esta etapa hasta por un mes.

7. Análisis utilizando el cromatógrafo de gases ¹⁴

1. Analizar FAME en un cromatógrafo de gases. Ejemplo creado: 30 mx 0,25 m x 0,25 mm BPX-70 columna capilar de sílice fundida con el protocolo de la temperatura:
   Temperatura inicial de 115 ° C, mantenga 2 min, rampa de 10 ° C / min hasta 200 ° C, mantenga 18,5 min, rampa de 60 ° C / min hasta 245 ° C, hedad 4 min.
   Columna: de gas helio, velocidad de flujo 1.0, 14.6 presión y la velocidad 29.
   Inyector: Temperatura = 300 ° C.
   Detector: El flujo de hidrógeno 40.0, aire fluya 184.0, conforman Helio gas, flujo 45.0, temperatura = 300 º C.
2. Establecer relación de división en su caso (por ejemplo, 25:1 para el análisis FAME CE).
3. Determinar el área bajo cada pico usando el software apropiado y FAME identificar por comparación con patrones. Consulte la Figura 2, por ejemplo cromatogramas.
4. Utilice el área bajo los picos de los datos para calcular la contribución de los ácidos grasos individuales como porcentaje de los ácidos grasos totales.
5. Cálculo de las concentraciones absolutas de los ácidos grasos dividiendo el área del patrón interno por la cantidad añadida. Divida el área de cada ácido graso por este resultado a obtener concentraciones absolutas de cada ácido graso dentro de la cantidad de tejido usado.

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Resultados

El éxito de este método depende de la siguiente protocolo con precisión y en el uso de disolventes y reactivos limpio con el fin de reducir el "ruido" y la contaminación que puede aparecer en un cromatograma. Las muestras contaminadas son más difíciles de analizar, la reducción de la exactitud de la zona bajo los cálculos de la curva. Si el protocolo es seguido con éxito un cromatograma con picos simétricos claros y bien definidos y con un mínimo de ruido de fondo debe ser obtenido como se ilustra e...

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Discusión

La cromatografía de gases es una técnica precisa a utilizar para el análisis de ácido graso, y su alta reproducibilidad considere esta técnica adecuada para análisis clínicos. Columnas de CG apropiados deben ser utilizados para permitir la identificación de ácidos grasos de interés, con columnas disponibles que tiene variaciones en la polaridad de la fase estacionaria, longitud de la columna y el diámetro interno. El uso de una columna capilar de sílice fundida en este método de análisis proporciona una bu...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methanol	Fisher Scientific	M/4056/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Chloroform	Fisher Scientific	C/4966/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
BHT	Sigma- Aldrich	W218405	'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous
NaCl	Sigma- Aldrich	S9888	Anhydrous
Hexane	Fisher Scientific	H/0406/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Glacial acetic acid	Sigma- Aldrich	695084	'CAUTION' Burns - 99.85%
Sulfuric acid	Sigma- Aldrich	339741	'CAUTION' Burns - 99.999%
Potassium carbonate	Sigma- Aldrich	209619	99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate	Sigma- Aldrich	237205	99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate	Fisher Scientific	10204340	'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied
Toluene	Fisher Scientific	T/2300/15	'CAUTION' Fumes
Diethyl ether	Sigma- Aldrich	309966	'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder	BOC	44-w	'CAUTION' Compressed gas - explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges	Agilent	12102014	Cartridge - Bead mass 100 mg
Silica gel SPE cartidges	Agilent	14102010	Cartridge - Bead mass 100 mg
Molecular seives	Sigma- Aldrich	334324	Pellets, AW-300, 1.6 mm
Glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	FB50251