Hamilelik sırasında Sıçan Karaciğer dokusunda yağ asitleri arasında kompozisyon değişiklikleri analiz Gaz Kromatografi Kullanımı

Özet

Gebelik maternal dokuların yağlı asit bileşimine önemli değişikliklere yol açmıştır. Lipid profilleri sıçanlarda, kimlik ve tek tek lipid sınıflarında yağlı asitlerin ölçümü gebelik sırasında çeşitli yüksek ve düşük yağlı diyetler beslenmiştir izin vermek için gaz kromatografisi ile elde edilebilir.

Özet

Gaz kromatografisi (GC), yüksek hassasiyet ve yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ile sonuçlar alındı, dokular, hücreler ve plazma / serum Lipidlerin yağlı asit içeriğini belirlemek ve ölçmek için kullanılan bir çok hassas bir yöntemdir. Metabolik ve beslenme çalışmaları GC sağlar müdahaleleri aşağıdaki yağ asidi konsantrasyonlarında veya gebelik gibi fizyolojik durumuna değişiklikleri sırasında değişikliklerin değerlendirilmesi. Aminopropil silis kartuşları kullanılarak katı faz ekstraksiyon (SPE) sağlar Triasilgliserollerin, farklı fosfolipidler ve kolesteril esterleri (CE) de dahil olmak üzere başlıca lipid sınıflarının ayrılması. SPE ile birlikte GC çeşitli yüksek ve düşük yağlı diyetler ile beslenmiş olan bakir ve hamile sıçanların karaciğerlerinde CE fraksiyonun yağ asidi bileşimi değişiklikleri analiz etmek için kullanıldı. Karaciğer CE omega-3 ve omega-6 yağ asit içeriği üzerine önemli beslenme / gebelik etkileşim etkileri hamile kadın diyet manipulat farklı bir tepki olmadığını belirten vardırdaha iyon bakire kadınlarda görülür.

Giriş

Gaz kromatografisi (GC) takviyesi veya fizyolojik obezite gibi koşullarda (ve diyabet gibi ilişkili hastalıklar) veya gebelik süresince ³ lipid havuzları ve hücre zarları ^1,2 yağ asitlerinin dahil edilmesini belirlemek ve ölçmek için kullanılan bir köklü bir tekniktir ^{- 5.} Ayrıca, gıdalarda türleri ve yağların miktarları analiz için uygundur. Deneysel diyetler karakterize yanı sıra, gıda sanayi yönetmeliklerine uygunluğunu sağlamaya yararlıdır. Örneğin, GC etiketleme doğru olan ve ^{düzenlemelerin, 6,7} yapıştırılır sağlamak için bir besin takviyesi olarak bir ürün içinde kimlik ve yağ asitlerinin miktarını doğrulamak için kullanılabilir. Yağ asitlerinin Analizi sağlığı ve hastalıkları, diyet değişikliği etkisi ve fizyolojik durumuna ⁸ değişikliklerin etkisi lipid metabolizması içine değerli bilgiler sağlayabilir. Gebelikte örnekleri çalışmak için GC kullanımı önemli sağladıyağ asidi ve kompleks lipid homeostazı ³ değişiklikler hakkında bilgi.

Kromatografik ayırma öncesinde, yağlar, genellikle kloroform ve metanol çözücü karışımları lipidlerin çözünürlüğünü kullanarak numuneden ekstre edilmiştir. Sodyum klorür fazları ^9,10 ihtiva eden sulu ve organik lipid olarak karışımın ayrılmasını kolaylaştırmak üzere eklenir. Ilgi Kompleks lipid sınıfları, katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile, toplam lipid ekstreden ayrılabilir. Bu ayırma işlemi, teknik polaritelerine veya bağlanma afinitesine bağlı olarak lipid sınıfları çözülür. Triacyglycerols (TAG) ve kolesteril esterleri (CE) kombine bir fraksiyon, bundan başka sınıfları, fosfatidilkolin (PC) gibi ilk önce elüte edilir, fosfatidiletanolamin (PE) ve esterleşmemiş yağ asitlerinin (NEFA) yıkama çözücünün artan polarite ile taşınacağı . CE gelen TAG ayrılması sadece taze bir SPE cartri için TAG bağlanma yararlananDGE, CE elüt edilmesi için izin verir. TAG daha sonra elüsyon solvent ^9,10 polaritesinin artırılması ile elüte edilebilir. Bu yöntem, daha yüksek bir verim ile eş zamanlı olarak ayrılması için çok sayıda örnek, nispeten küçük boyutlu örnekler (örneğin <100 ul plazma ya da serum, <100 mg doku) ^11,12 analiz edilebilir, yani, ince tabaka kromatografisi ile elde edilmesine izin verir.

GC ilk olarak 1950 de tarif edilen bir köklü bir tekniktir, bu daha sonra, sıvı-sıvı sistemlerinde, mobil faz, buhar ile değiştirilebilir önerildi. Bu, ilk olarak petrol analizi için kullanılabilir, ancak bu tür hızlı bir şekilde, amino asit analizi ve büyük ilgi halen lipid biyokimya gibi başka alanlara genişletilmiştir. Örneğin daha önce kullanılan paketlenmiş sütunlar kılcal sütun gelişme olarak GC ekipman ve teknolojisindeki gelişmeler, yağ asitleri için mümkün olduğu mevcut tekniklere açmıştırGC rutin araştırmalar ¹³ arasında geniş bir aralıkta yağlı asitleri belirlemek ve ölçmek için kullanılan ile sonuçlanan daha düşük sıcaklıklarda daha verimli bir şekilde ayrılır.

GC bunlar termal ayrışma olmadan, makul sıcaklıklarda elüt için yeterince uçucu olabilir bu sırayla türetilebilir için yağ asitleri gerektirir. Bu analiz için, genellikle esterler, tiyoesterler veya amidleri oluşturmak için hidrojen içeren fonksiyonel bir grubun ikamesi içerir. Metil esterleri yaygın metilasyon tarafından üretilen türevleri, incelenmiştir. Bu yöntemde, kompleks lipidler içindeki ester bağları yağlı asit metil esterleri (FAME) oluşturmak için transmethylated olan serbest yağ asitlerini, serbest bırakmak için hidrolize edilmektedir. GC ile belirlendi FAME profili elde edilen, yağlı asit bileşimi olarak adlandırılır ve kolay bir şekilde farklı deney grupları ^9,10 arasında karşılaştırılabilir. Teknik olanak Tek sıralamada oranlarını hemual yağ asitleri ve bunların konsantrasyonları, ölçülecek.

Beslenme çalışmalarında ve gıda endüstrisi içinde yağ asitleri analiz etmek için GC kullanımına ek olarak, teknik, analitik alanlarda geniş bir aralığında kullanılabilir. Örneğin, GC kullanılarak çevre analizleri böcek ve toprak su kirlenmesini ölçme içerir chlorobenzene içeriğini ölçme analiz eder. Toksikoloji, GC de idrar ve bireylerin kan örneklerinde yasadışı maddeleri tanımlamak için kullanılır olmuştur, bu tür bir spor performans artırıcılar ¹² ve hidrokarbonların kompleks karışımlarını ayırmak için yeteneği petrokimya analizi ¹² için petrol sektöründe bu tekniği popüler hale getirir.

Gebelik, özellikle omega-3 içeriği maternal dokuların yağlı asit bileşimine önemli bir değişiklik, (n-3) ve omega-6 (n-6) çoklu doymamış yağ aci ile ilişkilids (PUFA) ^3. Mevcut çalışmada, farklı yağ kaynakları ile, düşük ve yüksek yağlı diyet ile beslenmiştir bakir ve hamile sıçanlardan alınan karaciğer dokusu yağlı asit bileşiminin analizinde kullanımını açıklayan yağ asitlerinin ölçümünde GC kullanımını örnekler. Burada sağlanan deneysel diyetler, düşük yağlı soya yağı bazlı diyet, yüksek yağlı soya yağı bazlı diyet (130.9 g toplam yağ / kg toplam yağ) veya yüksek yağ bezir yağı bazlı diyet (130.9 g toplam yağ / kg idi 20 gün için sağlanan beslenme). Bu diyetler tam besin ve yağlı asit bileşimi, daha önce ¹⁴ tarif edilmiştir. Soya fasulyesi yağı diyeti linoleik asit (18:2 n-6) açısından zengindir ve keten tohumu yağı diyeti, α-linolenik asit açısından zengin iken, bir α-linolenik asit (18:03 n-3) içerir. Bu yüksek-yağlı diyetler, linoleik α-linolenik asit için (sırasıyla, 8:01 ve 01:01 arasında katyonları), farklı yem oranlarını temsil eder. Bireysel lipid sınıfları ve GC ile analiz izolasyonu için bir yöntem olup bizll oluşturulmuş ve valide, ve daha önce ¹⁰ ama burada bulunan ayrıntılı teknik açıklama olmadan yayımlanmıştır.

Protokol

1.. Hayvan Prosedürleri

1. Tüm hayvan çalışmaları Home Office Hayvanlar (Scientific Procedures) Act (1986) göre yapılmalıdır.
2. Tekeşli ıslah tarafından eski 10 hafta arası Wistar sıçan Mate, ve vajinal tamponun görünümü ile gebelik onaylayın. Gebelik günü 1 olarak kaydedin, ve deneysel diyet başlar. Bakire kadın için, tek tek her bir sıçan ev ve deneysel diyet başlar.
3. 20 gün boyunca deney diyetlerinin besleme sonra servikal dislokasyon takiben _CO2 ile boğularak sıçan euthanize.
4. Karın boşluğu ortaya çıkarmak ve diyaframa karaciğer bağlamak bağ, karın ön duvarı, mide ve onikiparmak bağırsağı keserek karaciğer çıkarılması için diseksiyon forseps ve makas kullanın. -80 ° C'de depolamadan önce PBS içinde karaciğer yıkayın ve sıvı azot içinde dondurularak

2. Bir Toplam Lipid hazırlanması ekstrakte ⁹

1. Molekül Eklear elekler 'kuru' solventler oluşturmak için tüm solventler (çözücü kabın 1/10 doldurmak için). davlumbaz içindeki tüm solvent çalışmaları yürütmek.
2. Yaklaşık 100 mg donmuş karaciğer kesin ve tartın. Bir buz kovası bir tüp içine doku yerleştirin ve 0.8 ml buz gibi soğuk% 0.9 NaCI ekleyin. Doku homojenize.
3. Kuru kloroform içinde 1 ml / mg içerisinde çözündürüldü iç standartları ekleyin: metanol (2:1, v / v) butile hidroksitoluen (BHT, 50 mg / l) ihtiva eden bir anti-oksidan olarak. Rat karaciğer 100 mg standart CE 100 mikrogram eklemek için (Kolesteril 17:00 heptadekanoat) Dikkat:. Kloroform ve BHT tehlikelidir.
4. 5,0 ml kuru kloroform ekleme: metanol (2:1, v / v), BHT (50 mg / L) ihtiva etmektedir.
5. , 1.0 ml 1 M NaCl ekle karışım formasını görünüyor kadar vorteks ile iyice karıştırın. Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
6. 10 dakika oda sıcaklığında düşük fren 1000 xg'de santrifüj.
7. Alt toplayınbir cam Pasteur pipet kullanılarak faz, 40 ° C'de nitrojen altında, yeni vidalı kapaklı cam tüp ve kuru transfer Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.

3. Katı Faz Ekstraksiyon tarafından Lipid Sınıflar ayrılması (SPE) ¹⁰

1. Bir vakum pompasına SPE tankı bağlayın ve tank aminopropil silis SPE kartuşu yerleştirin.
2. İlk fraksiyon toplamak için sütunun altında tankı rafa yeni vidalı kapak cam tüp etiketli TAG ve CE yerleştirin.
3. 1.0 ml kuru kloroform ve girdap toplam lipid ekstresi çözülür.
4. , Bir cam Pasteur pipet kullanılarak kolona örnek uygulanır ve yerçekimi altında vidalı kapaklı bir tüp içine üzerinden akmasına izin verilir. Başka damlar düştüğünde, vakum kalan sıvı çıkarın.
5. Kuru kloroform içinde 2 x 1.0 mi yıkama ile sütun yıkama, vakum altında TAG ve CE fraksiyonu Zehir.
6. Tüm sıvı kaldırıldığında, TAG ve CE fractio kuru40 ° C'de azot altında n Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
7. Sütununda tankı tepsisine yeni vidalı kapak cam tüp etiketli PC yerleştirin.
8. 2 x 1.0 ml kuru kloroform ilavesiyle, vakum altında PC fraksiyonu Zehir: metanol (60:40, v / v) tüm sıvı sütundan çıkarılır kadar.
9. 40 ° C'de nitrojen altında çıkarın ve kuru PC fraksiyon Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
10. Tank tepsiye yeni bir vidalı kapak cam tüp PE etiketli yerleştirin ve vakum altında 1.0 ml kuru metanol ilavesiyle PE fraksiyonu elüte.
11. 40 ° C'de nitrojen altında çıkarın ve kuru PE fraksiyon Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
12. Tank tepsiye yeni bir vidalı kapaklı cam tüp etiketli NEFA koyun ve kuru kloroform içinde 2 x 1.0 ml yıkama eklenmesiyle vakum altında NEFA fraksiyonu elüte: metanol: glasiye asetik asit. (100:2:2, v / v / v) Dikkat: Buzlu asetik asit tehlikelidir.
13. 40 ° C'de nitrojen altında toplandı NEFA fraksiyonu ve kuru kaldırma Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
14. SPE tank üzerine yeni bir ammopropil silika SPE kartuşu yerleştirin ve atık toplamak için kartuşun altına tankı tepsisine bir vidalı kapak cam tüp yerleştirin.
15. 3, vakum altında kuru heksan ile yıkama ve yer çekiminin etkisi altında daha sonra 1.0 ml nihai bir yıkama ile sütun yıkayın. . Kartuş (hekzan düzeyi kartuş matris yakınken bir kapalı konuma kartuş kolon kanalları açmak) Dikkat kuru olmasına izin vermeyin: Hekzan tehlikelidir.
16. Yeni vidalı kapak cam tüp etiketli CE ile atık borusunu değiştirin.
17. Kuru heksan ve girdap 1.0 ml (adım 3.6 hazırlandı), kurutuldu ve TAG CE fraksiyonu çözündürülür. , Bir cam Pasteur pipet kullanılarak kolona uygulanır ve bu gr altmda damla izinRavity.
18. Başka bir damla düştüğünde, vakum altında kalan sıvı boşaltılır.
19. Vakum altında, 40 ° C'de nitrojen altında kuru CE ve toplanan fraksiyonun elüsyonu için kuru heksan 2 x 1.0 mi yıkama ile sütun yıkayın Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
20. Kuru heksan 2 x 1.0 ml yıkama ilavesi ile tank tepsi ve elute TAG yeni vidalı kapaklı cam tüp etiketli TAG Sıra: metanol: etil asetat (100:5:5), vakum altında.
21. 40 ° C'de nitrojen altında kuru fraksiyon toplandı . Numuneler bir hafta kadar Dikkat kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de muhafaza edilebilir: Etil asetat tehlikelidir.

4. FAME hazırlanması CE ¹⁰

1. . Ayrılmış CE fraksiyonu (adım 3.19 toplanan) ve girdap Dikkat kuru toluen içinde 0.5 ml ilave edilir: Toluene tehlikelidir.
2. % 2 (v ile metilasyon reaktifi hazırlayın (kuru metanol/ V), 1.0 ml numune başına gerekli olduğu H _{2 SO4).} Cam veya kapaklı uygun bir plastik kap içine kuru metanol hacmi dağıtın ve SO ₄ damla damla sonra Dikkat ters çevirme ile karıştırın H _2'nin gerekli miktarda ekleyin:. Sülfürik asit tehlikelidir.
3. Kuru toluen içinde çözüldü numunelere metilleme reaktifi 1.0 ml ilave edilir, güvenli bir şekilde tüpler kapak, yavaşça karıştırın.
4. 50 ° C'de 2 saat boyunca ısıtılır örnekleri
5. 2 saat sonra ısı tüpleri kaldırmak. . Potasyum bikarbonat ve potasyum karbonat zararlı: Bir kere soğuk çözeltisi (0.25 M KHCO ₃ 0.5MK ₂ CO ₃₎ Dikkat nötralize 1.0 ml.
6. 1.0 ml kuru heksan ve vorteks ekleyin.
7. 2 dakika, oda sıcaklığında düşük bir fren boyunca 250 x g'de santrifüjleyin.
8. FAME içeren üst faz, toplamak ve yeni bir non-vidalı kapak atılabilir cam tüp içine aktarın.
9. Altında toplanan FAME Kuru40 ° C'de azot Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.

5. CE FAME ¹⁴ Free Kolesterol Kirlilik giderimi

(Free Kolesterol örnek kontamine edebilir, ve serbest kolesterol çıkarmadan örnek kromatografının izleri bkz. Şekil 1).

1. SPE tanka atık tüp yerleştirin ve tankın üzerine bir silika jel SPE kartuşu yerleştirin.
2. Vakum altında kuru heksan, 3 x 1 ml yıkama ve yerçekimi altında 1 x 1 ml 'si ile sütun yıkayın.
3. Atık yıkar çıkarın ve depoya yeni atık tüp ekleyin.
4. 1 ml kuru heksan, girdap CE FAME çözülür.
5. , Bir cam Pasteur pipet kullanılarak kolona uygulanır ve yer çekiminin etkisi altında boyunca akmasına izin verilir.
6. Vakum altında heksanın 3 x 1 mi yıkama ile sütun yıkayın.
7. Atık yıkar çıkarın ve tank etiketli CE FAME yeni olmayan vidalı kapak tüp yerleştirin.
8. Zehir2 x 1 ml kuru heksan ile CE FAME: dietil eter (95:5 v / v) yıkama.
9. 40 ° C'de nitrojen altında kuru . Numuneler bir hafta kadar Dikkat kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de muhafaza edilebilir: Dietil eter tehlikelidir.

6. GC Otomatik Numune şişenin içine FAME transferi

1. , Vorteks örnek ve bir GC otomatik numune şişesine transfer etmek için 75 ul kuru hekzan ekleyin.
2. , Örnek vorteks ve aynı GC otomatik numune şişesine aktarmak için bir başka 75 ul kuru hekzan ekleyin. Numuneler, bir ay kadar için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.

7. Gaz Kromatograf ¹⁴ ile Analiz

1. Bir gaz kromatografisinde FAME analiz. Örnek kurmak: 30 mx x 0.25 mm 0.25 mikron BPX-70 sıcaklık protokolü ile erimiş silika kapiler kolon:
   Başlangıç ​​sıcaklığı 115 ° C, 2 dakika tutma, rampa 10 ° C / dk ila 200 ° C, 245 ° C 18.5 dk, rampa 60 ° C / dk süreyle, hEski 4 dk.
   Sütun: Helyum gazı, akış hızı 1.0, basınç 14.6 ve hız 29.
   Enjektör: Sıcaklık = 300 ° C
   Dedektör: Hidrojen akış 40.0, hava sıcaklığı = 300 ° C, 45,0 akış, gaz Helyum makyaj, 184,0 akış
2. (CE FAME analiz için örneğin 25:1) uygun olarak ayarlayın split oranı.
3. Uygun bir yazılım kullanarak her bir tepe noktasının altındaki alanın belirlemek ve standartlar ile karşılaştırılarak tespit FAME. Örnek Kromatogramlarda için Şekil 2'ye bakınız.
4. Toplam yağ asitlerinin bir yüzdesi olarak tek tek yağlı asitlerin katkı hesaplamak için zirve veri altındaki alanı kullanın.
5. Miktarı ile iç standardın alanına bölünmesi ile yağ asitlerinin mutlak konsantrasyonlarını hesaplamak ilave edildi. Kullanılan doku miktarı içinde her yağ asidi mutlak konsantrasyonları elde etmek için, bu sonuç, her bir yağ asidinin alanı bölün.

Sonuçlar

Bu yöntemin başarısı tam protokolü takip ve "gürültü" ve kromatogramda görünebilir kirlenmesini azaltmak amacıyla temiz çözücüler ve reaktifler kullanılarak bağlıdır. Kirlenmiş örnekleri eğri hesaplamaları altındaki alanın doğruluğunu düşürücü, analiz etmek için daha zor bulunmaktadır. Açık protokol simetrik, iyi tanımlanmış zirveler ve minimal arka plan gürültüsü ile başarılı bir kromatogramını takip edilirse, Şekil 3'te gösterildiği gibi...

Tartışmalar

Gaz kromatografisi yağlı asit analizi için kullanılacak doğru bir tekniktir, ve yüksek tekrarlanabilirliği klinik analizler için müsait bu tekniği görmektedir. Uygun GC sütun mevcut sütun durağan faz, kolon uzunluğu ve iç çapı polaritesine varyasyonlara sahip olan, ilgi konusu olan yağlı asitleri tanımlanmasını sağlamak için kullanılmalıdır. Bu analiz yönteminde, bir kaynaşık silika kılcal kolonunun kullanılması, iyi bir termal stabilitesi ve yüksek yüzey inertlik ve iyi çözünürl?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methanol	Fisher Scientific	M/4056/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Chloroform	Fisher Scientific	C/4966/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
BHT	Sigma- Aldrich	W218405	'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous
NaCl	Sigma- Aldrich	S9888	Anhydrous
Hexane	Fisher Scientific	H/0406/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Glacial acetic acid	Sigma- Aldrich	695084	'CAUTION' Burns - 99.85%
Sulfuric acid	Sigma- Aldrich	339741	'CAUTION' Burns - 99.999%
Potassium carbonate	Sigma- Aldrich	209619	99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate	Sigma- Aldrich	237205	99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate	Fisher Scientific	10204340	'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied
Toluene	Fisher Scientific	T/2300/15	'CAUTION' Fumes
Diethyl ether	Sigma- Aldrich	309966	'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder	BOC	44-w	'CAUTION' Compressed gas - explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges	Agilent	12102014	Cartridge - Bead mass 100 mg
Silica gel SPE cartidges	Agilent	14102010	Cartridge - Bead mass 100 mg
Molecular seives	Sigma- Aldrich	334324	Pellets, AW-300, 1.6 mm
Glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	FB50251