השימוש בגז כרומטוגרפיה לנתח הלחנה שינויים של חומצות שומן ברקמות חולדה כבד במהלך הריון

Summary

הריון גורם לשינויים משמעותיים בהרכב חומצות שומן של רקמות אימהיות. ניתן להשיג פרופילי שומנים בדם באמצעות גז כרומטוגרפיה כדי לאפשר זיהוי וכימות של חומצות שומן בכיתות שומנים בודדות בקרב חולדות קבלו תזונה שומן גבוה ונמוך שונות במהלך הריון.

Abstract

גז כרומטוגרפיה (GC) היא שיטה רגישה מאוד המשמשת לזיהוי ולכמת את תכולת חומצות שומן של שומנים ברקמות, תאים ופלזמה / סרום, מניב תוצאות ברמת דיוק גבוהה ושחזור גבוה. במחקרים מטבוליים והתזונה GC מאפשר הערכה של שינויים בריכוז חומצות השומן הבאים התערבויות או במהלך שינויים במצב פיסיולוגי כגון הריון. מיצוי שלב מוצק (SPE) באמצעות aminopropyl מחסניות סיליקה מאפשר הפרדה של מעמדות שומנים בדם הגדולות, כולל triacylglycerols, פוספוליפידים שונים, ואסטרים כולסטריל (CE). GC בשילוב עם SPE שימש כדי לנתח את השינויים בהרכב חומצות שומן של שבריר CE בכבדים של חולדות בתולה והרות שקבלו תזונה שומן גבוהה ונמוכה שונות. ישנן השפעות אינטראקציה דיאטה / הריון משמעותיות על תכולת חומצות אומגה 3 ואומגה 6 וחומצות השומן של CE כבד, מצביעים על כך שנשים בהריון יש תגובה שונה לmanipulat התזונתייון ממה שראה אצל נקבות בתולה.

Introduction

גז כרומטוגרפיה (GC) היא טכניקה מבוססת היטב המשמשת לזיהוי ולכמת את השילוב של חומצות שומן לתוך בריכות שומנים בדם וקרומים תא ^1,2 בתנאי תוספים או פיסיולוגיים כמו השמנה (ומחלות הקשורות כגון סוכרת) או הריון ^{- 3 5.} זה מתאים גם לניתוח הסוגים והכמויות של שומנים במזון. זה שימושי כאשר אפיון דיאטות ניסיוניות, כמו גם להבטיח כי תעשיית המזון עומדת בתקנות. לדוגמא, GC ניתן להשתמש כדי לאשר את זהותו וכמות של חומצות שומן בתוך מוצר כגון תוסף תזונה כדי להבטיח התיוג שהוא נכון ותקנות הם דבקו ^6,7. ניתוח של חומצות שומן יכול לספק תובנות רבות ערך חילוף חומרים של שומנים בבריאות ובחוליים, את ההשפעה של שינוי תזונתי, ואת ההשפעה של שינויים במצב פיסיולוגי ^8. שימוש של GC כדי ללמוד דגימות במהלך ההריון סיפק חשובמידע על שינויים בחומצות שומן והומאוסטזיס שומנים מורכבים ^3.

לקראת הפרדת chromatographic, שומנים המחולצים בדרך כלל מהמדגם באמצעות המסיסות של שומנים בתערובות ממיסים של כלורופורם ומתנול. נתרן כלורי הוא הוסיף כדי להקל על הפרדת התערובת לתוך שומנים מימיים ואורגניים המכילים שלבי ^9,10. כיתות שומנים מורכבות של עניין ניתן להפריד בסך הכל תמצית שומנים בדם על ידי מיצוי שלב מוצק (SPE). טכניקת הפרדה זו elutes כיתות שומנים המבוססות על הקוטביות שלהם או זיקה מחייבת. Triacyglycerols (TAG) ואסטרים כולסטריל (CE) הם eluted הראשון כשבר משולבת, כיתות נוספות, phosphatidylcholine (PC), Phosphatidylethanolamine (PE), וחומצות שאינם esterified שומן (NEFA) הם eluted על ידי הגדלת הקוטביות של ממס משחררי . ההפרדה של TAG מהספירה מנצלת מחייבת של TAG רק למחסניות SPE טריותdge, המאפשר לספירה להיות eluted. TAG אז יכול להיות eluted על ידי הגדלת הקוטביות של ^9,10 ממס משחררי. שיטה זו מאפשרת דגימות מרובות כדי להפריד בו זמנית עם תשואה גבוהה יותר מזו שהושגה עם כרומטוגרפיה בשכבה דקה, מה שאומר שדגימות בגודל קטנות יחסית (למשל <פלזמה 100 μl או סרום, <רקמת מ"ג 100) ניתן לנתח ^11,12.

GC הוא טכניקה מבוססת היטב תוארה לראשונה בשנת 1950s; הוצע כי השלב הנייד במערכות אז נוזל נוזל יכול להיות מוחלף עם אדים. בהתחלה זה היה בשימוש לניתוח נפט אך התרחב במהירות לתחומים אחרים כגון ניתוח חומצת אמינו וביוכימיה שומנים בדם, שהוא עדיין עניין גדול. התקדמות בציוד GC וטכנולוגיה, כגון הפיתוח של עמודות נימים מהשתמשו בעבר הטורים עמוסים הובילה לטכניקות הנוכחיות שלנו שבו חומצות שומן יכולות להיותנפרד בצורה יעילה יותר בטמפרטורות נמוכות יותר וכתוצאה מכך GC בשימוש באופן שגרתי כדי לזהות ולכמת את חומצות שומן במגוון רחב של חקירות ^13.

GC דורש חומצות שומן להיות derivatized על מנת שהם עשויים להיות תנודתי במידה מספקת כדי להיות eluted בטמפרטורות סבירות ללא פירוק תרמי. בדרך כלל הדבר כרוך ההחלפה של קבוצה פונקציונלית המכילה מימן ליצירת אסטרים, thioesters או אורגני חיבור לניתוח. אסטרים מתיל בדרך כלל נלמדים נגזרים, אשר מיוצרים על ידי מתילציה. בשיטה זו אג"ח אסתר בשומנים מורכבים הידרוליזה לשחרר חומצות שומן חופשיות, הtransmethylated כדי ליצור אסטרים מתילים של חומצות שומן (FAME). הפרופיל וכתוצאה מכך של תהילה, שנקבע על ידי GC, שמכונה הרכב חומצות שומן וניתן להשוות בקלות בין קבוצות ניסוי השונות ^9,10. הטכניקה מאפשרת גם את הפרופורציות של אדם מסוים עלחומצות שומן רע"מ וריכוזיהם כדי להימדד.

בנוסף לשימוש של GC לניתוח חומצות שומן בלימודי תזונה ובתוך תעשיית המזון, הטכניקה יכולה לשמש במגוון רחב של תחומים אנליטיים. לדוגמא, ניתוח סביבתי באמצעות GC כולל מדידת זיהום מים על ידי חומרי הדברה ואדמה מנתחת מדידת תכולת chlorobenzene. בטוקסיקולוגיה, GC שימש גם לזיהוי חומרים לא חוקיים בשתן ודגימות של אנשים בדם; משפרי ביצועים כגון ספורט ¹² ואת היכולת להפריד תערובות מורכבות של פחמימנים הופכים טכניקה זו פופולרית בתעשיית הנפט לניתוח פטרוכימי ^12.

הריון קשור לשינויים משמעותיים בהרכב חומצות השומן של רקמות אימהיות, במיוחד בתוכן של אומגה 3 (n-3) ואומגה 6 (n-6) ACI שומן רב בלתי רוויDS (PUFA) ^3. במחקר הנוכחי, אנו מדגימים את השימוש של GC במדידה של חומצות שומן על ידי המתאר את השימוש בו בניתוח של הרכב חומצות שומן של רקמת כבד שנלקחה מחולדות בתולה ובהריון קבלו תזונה דלת שומן וגבוהה עם מקורות נפט שונים. הדיאטות הניסיוניות הניתנות כאן היו דיאטת סויה דלת שומן על בסיס שמן, תזונה עתירה שומן סויה על בסיס שמן (סה"כ שומן סה"כ שומן / קילוגרם 130.9 ז) או דיאטה הבוסס על שמן פשתן עשיר בשומן (סה"כ שומן / קילוגרם 130.9 גרם דיאטה), ובלבד ל20 ימים. הרכב חומצות שומן התזונתי ומלא של דיאטות אלה תוארו בעבר ^14. דיאטות שמן הסויה עשירות בחומצה לינולאית (18:02 n-6) ומכילות כמה חומצת α לינולנית (18:03 n-3) בזמן דיאטת שמן הפשתן עשירה בחומצה לינולנית α. תזונה עשירה בשומן אלה מייצגות מנות שונות של חומצות לינולאית לα לינולנית (מנות של 08:01 ו1:1, בהתאמה). השיטה לבידוד של כיתות שומנים בודדות וניתוח על ידי GC היא שאנחנוll הוקם ותוקף, וכבר פורסם בעבר ¹⁰ אך ללא התיאור הטכני מפורט מצא במסמך זה.

Protocol

1. נהלי בעלי חיים

1. כל העבודה של בעלי החיים צריכה להתבצע בהתאם לבעלי חיים בית המשרד (הליכים מדעיים) Act (1986).
2. Mate חולדות Wistar בני 10 שבועות ישנים על ידי רבייה מונוגמיים, ולאשר את ההריון על ידי הופעתו של תקע נרתיק. להקליט זה כמו יום 1 של הריון, ולהתחיל בדיאטה ניסיונית. לנקבות בתולה, בית עכברוש אחד בנפרד, ולהתחיל בדיאטה ניסיונית.
3. לאחר האכלת הדיאטות הניסיוניות ל20 ימים להרדים חולדות על ידי CO מחנק ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם.
4. שימוש במלקחיים ומספריים לנתיחה על מנת לחשוף את חלל הבטן, ולהסיר את הכבד על ידי חיתוך הרצועות המחברות את הכבד לסרעפת, קיר קדמי של הבטן, הקיבה והתריסריון. שטוף את הכבד ב-PBS ולהקפיא בחנקן נוזלי לפני האחסון ב -80 ° C.

2. הכנת ליפידים סה"כ חלץ ⁹

1. הוספת moleculמסננות ar (כדי למלא 1/10 של מיכל ממס) לכל הממסים ליצור ממסים "יבשים". לבצע את כל עבודת הממס בתוך מנדף.
2. חותכים כ 100 מ"ג כבד קפוא ולשקול. הנח את הרקמה לתוך צינור בדלי קרח ולהוסיף 0.8 0.9% הקרח קר מיליליטר NaCl. Homogenize הרקמות.
3. הוספת התקנים פנימיים המומסים ב 1 מיליליטר / מ"ג של כלורופורם יבש: מתנול (2:1, V / V) מכיל hydroxytoluene butylated (BHT; 50 מ"ג / ליטר) כנוגד חמצון. לשל כבד חולדה 100 מ"ג להוסיף לסטנדרטים של CE 100 מיקרוגרם (כולסטריל heptadecanoate 17:00) זהירות:. כלורופורם וBHT הם מסוכנים.
4. הוספת 5.0 מיליליטר כלורופורם יבש: מתנול (2:1, V / V) מכיל BHT (50 מ"ג / ליטר).
5. הוספת 1.0 מיליליטר 1 M NaCl, ומערבב היטב על ידי vortexing עד שתערובת נראית אחידה. ניתן הכתירה דגימות ומאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה לתקופה של עד שבוע.
6. צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 10 דקות, בלם נמוך בטמפרטורת חדר.
7. אסוף נמוךשלב באמצעות זכוכית פיפטה פסטר, להעביר לצינור חדש כובע בורג זכוכית ויבש תחת חנקן ב40 ° C. ניתן הכתירה דגימות ומאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה לתקופה של עד שבוע.

3. הפרדה של חוגים ליפידים ידי מיצוי שלב מוצק (SPE) ¹⁰

1. חבר את מיכל SPE למשאבת ואקום ולמקם aminopropyl מחסנית SPE סיליקה על הטנק.
2. מקם תג חדש שפופרת זכוכית ההברגה כובע שכותרתו ו 'לסה"נ במעמד הטנק תחת העמודה לאסוף חלק ראשון.
3. ממיסים בסך הכל תמצית שומנים ב1.0 מיליליטר כלורופורם ומערבולת יבשים.
4. החל המדגם לעמודה באמצעות פיפטה פסטר זכוכית ולאפשר לטפטף אל תוך צינור בורג יתר תחת כוח הכבידה. כאשר אינו מטפטפים נוסף ליפול, להסיר את הנוזל שנותר בחלל ריק.
5. Elute שבריר TAG ו 'לסה"נ תחת ואקום, לשטוף את העמודה עם שטיפת 2 x 1.0 מיליליטר של כלורופורם יבש.
6. כאשר כל הנוזלים מוסרים, לייבש את fractio TAG ו 'לסה"נn תחת חנקן ב40 ° C. ניתן הכתירה דגימות ומאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה לתקופה של עד שבוע.
7. מקם את מחשב שפופרת זכוכית חדש בורג יתר שכותרתו לתוך מגש הטנק תחת העמודה.
8. Elute שבריר המחשב תחת ואקום עם התוספת של 2 x 1.0 מיליליטר כלורופורם יבש: מתנול (60:40, V / V) עד שכל הנוזל הוא להסיר את העמודה.
9. הסר ושבריר מחשב יבש תחת חנקן ב40 ° C. ניתן הכתירה דגימות ומאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה לתקופה של עד שבוע.
10. הנח PE שפופרת זכוכית חדש בורג יתר שכותרתו לתוך מגש הטנק וelute שבריר PE עם התוספת של 1.0 מיליליטר מתנול היבש תחת ואקום.
11. הסר וחלק PE יבש תחת חנקן ב40 ° C. ניתן הכתירה דגימות ומאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה לתקופה של עד שבוע.
12. מניחים שפופרת זכוכית ההברגה כובע חדשה NEFA שכותרתו לתוך מגש הטנק וelute שבריר NEFA תחת ואקום על ידי התוספת של 2 x 1.0 מיליליטר שוטף של כלורופורם יבש: מתנול: חומצה אצטית קרחונית. (100:2:2, v / v / v) זהירות: החומצה אצטית קרחונית היא מסוכנת.
13. הסר שבריר NEFA שנאסף ויבש תחת חנקן ב40 ° C. ניתן הכתירה דגימות ומאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה לתקופה של עד שבוע.
14. הנח מחסנית SPE סיליקה aminopropyl חדשה על טנק SPE ולמקם את שפופרת זכוכית בורג מכסה במגש הטנק מתחת למחסנית לאיסוף פסולת.
15. לשטוף את העמודה עם 3 שוטף של הקסאן היבש תחת ואקום ולאחר מכן לשטוף 1.0ml סופי תחת כובד. אל תאפשר את המחסנית להיות יבשה (להפוך את ערוצי עמודת מחסנית למצב סגור כאשר רמת הקסאן היא קרובה למטריקס המחסנית) זהירות:. הקסאן הוא מסוכן.
16. החלפת צינור פסולת עם CE שכותרתו שפופרת זכוכית ההברגה כובע חדש.
17. ממיסים את החלק המיובש TAG ו 'לסה"נ (מוכן בשלב 3.6) ב1.0 מיליליטר של הקסאן ומערבולת יבשים. ליישם את זה לעמודה באמצעות פיפטה פסטר זכוכית ולאפשר לטפטף דרך תחת gravity.
18. כאשר אינו מטפטפים נוסף ליפול, להסיר את הנוזל שנותר תחת ואקום.
19. תחת ואקום, לשטוף את העמודה עם 2 x 1.0 מיליליטר שוטף של הקסאן היבש לelute CE וחלק שנאסף יבש תחת חנקן ב40 ° C. ניתן הכתירה דגימות ומאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה לתקופה של עד שבוע.
20. מקם תג שפופרת זכוכית ההברגה כובע חדש שכותרתו במגש הטנק וTAG elute עם התוספת של 2 x 1.0 מיליליטר שוטף של הקסאן היבש: מתנול: אתיל אצטט (100:5:5) תחת ואקום.
21. חלק קטן שנאסף יבש תחת חנקן ב40 ° C. ניתן הכתירה דגימות ומאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה לתקופה של עד שבוע זהירות:. אתיל אצטט היא מסוכן.

4. הכנת התהילה מספירה ¹⁰

1. הוסף 0.5 מיליליטר של טולואן היבש לשבריר המופרד לסה"נ (שנאסף בשלב 3.19) ו מערבולת זהירות:. טולואן הוא מסוכן.
2. הכן מגיב מתילציה (מתנול יבש עם 2% (v/ V) H ₂ SO _4), מתוכם 1.0 מיליליטר נדרש לדגימה. לוותר על הנפח של מתנול היבש לתוך כוס או מיכל פלסטיק עם מכסה מתאים ולהוסיף את הכמות הנדרשת של H ₂ SO ₄ dropwise אז מערבב על ידי היפוך זהירות:. חומצה גופרתית היא מסוכנת.
3. הוספת 1.0 מיליליטר של מגיב methylating לדגימות המומסים בטולואן היבש, מכסה את הצינורות באופן מאובטח, ומערבבים בעדינות.
4. מחממים את הדגימות לשעה 2 ב 50 ° C.
5. לאחר 2 שעות להסיר את הצינורות מחום. ברגע שמגניב להוסיף 1.0 מיליליטר נטרול פתרון (0.25 M KHCO ₃ 0.5MK ₂ CO ₃₎ זהירות:. יקרבונט אשלגן פחם אשלגן הוא מסוכנים.
6. הוספת 1.0 מיליליטר הקסאן ומערבולת יבשים.
7. צנטריפוגה ב 250 XG במשך 2 דקות, בלם נמוך בטמפרטורת חדר.
8. לאסוף שלב עליון, המכיל את התהילה, ולהעביר לתוך צינור שאינו חדש בורג מכסה זכוכית חד פעמית.
9. ייבש את התהילה שנאסף תחתחנקן ב40 ° C. ניתן הכתירה דגימות ומאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה לתקופה של עד שבוע.

5. ההסרה של כולסטרול חינם זיהום מתהילה לספירה ¹⁴

(כולסטרול חינם יכול לזהם את המדגם; ראה איור 1 עבור עקבות דוגמא כרומטוגרף עם ובלי הסרת כולסטרול חופשי).

1. הנח צינור פסולת למכל SPE ולמקם את מחסנית SPE ג'ל סיליקה על גבי הטנק.
2. לשטוף טור עם 3 x 1 מיליליטר שוטף של הקסאן היבש תחת ואקום ו1 x 1 מיליליטר תחת כובד.
3. הסר שוטף פסולת ולהוסיף צינור שפכים חדש לתוך טנק.
4. ממיסים FAME CE ב1 הקסאן, מערבולת מיליליטר יבשה.
5. אחול על העמודה בעזרת פיפטה פסטר זכוכית ולאפשר לטפטף דרך תחת כוח הכבידה.
6. לשטוף טור עם 3 x 1 מיליליטר שוטף של הקסאן תחת ואקום.
7. הסר שוטף פסולת ומניח את צינור כובע בורג שאינו חדש לתהילה לספירה טנק שכותרתו.
8. Eluteתהילה לספירה עם הקסאן היבש 2 x 1 מיליליטר: אתר diethyl (95:5 V / V) שוטף.
9. ייבש תחת חנקן ב40 ° C. ניתן הכתירה דגימות ומאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה לתקופה של עד שבוע זהירות:. דיאתיל האתר הוא מסוכן.

6. העברת תהילה לGC האוטומטי סמפלר ויאל

1. הוסף 75 הקסאן μl היבש לדגום, מערבולת, ולהעביר לבקבוקון מדגם האוטומטי GC.
2. הוספת הקסאן μl יבש נוסף 75 לדגום, מערבולת ולהעביר לאותו בקבוקון המדגם האוטומטי GC. ניתן הכתירה דגימות ומאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה לתקופה של עד חודש.

7. ניתוח שימוש בגז כרומטוגרף ¹⁴

1. נתח את התהילה בגז כרומטוגרף. דוגמא להגדיר: 30 MX 0.25 מיקרומטר x 0.25 מ"מ BPX-70 עמודת נימי סיליקה התמזגו עם פרוטוקול טמפרטורה:
   הטמפרטורה ההתחלתית 115 ° C, להחזיק 2 דקות, כבש 10 ° C / min 200 ° C, החזק 18.5 דקות, 60 ° C / min רמפה ל245 ° C, hדקות בן 4.
   טור: גז הליום, קצב זרימת 1.0, לחץ 14.6 ומהירות 29.
   מזרק: טמפרטורה = 300 ° C.
   גלאי: זרימת מימן 40.0, אוויר זורמת 184.0, לפצות הליום גז, תזרום 45.0, טמפרטורה = 300 ° C.
2. יחס פיצול קבע כמתאים (למשל 25:1 לניתוח תהילה לספירה).
3. לקבוע את האזור מתחת לכל שיא באמצעות תוכנה מתאימה ולזהות תהילה בהשוואה לסטנדרטים. ראה איור 2 לchromatograms ירושלים.
4. השתמש בשטח מתחת לשיא נתונים כדי לחשב את התרומה של חומצות שומן בודדות כאחוז מכלל חומצות שומן.
5. חישוב ריכוזים מוחלטים של חומצות שומן על ידי חלוקת השטח של תקן הפנימי על ידי הכמות הוסיף. לחלק את השטח של כל חומצת שומן על ידי תוצאה זו כדי להשיג ריכוזים מוחלטים של כל חומצת שומן בכמות הרקמה בשימוש.

תוצאות

ההצלחה של שיטה זו תלויה בביצוע הפרוטוקול מדויק ועל שימוש בממסים וריאגנטים נקיים על מנת להקטין 'רעש' וזיהום שיכול להופיע על הכרומתוגרמה. דגימות מזוהמות הן יותר מאתגר כדי לנתח, הפחתת הדיוק של השטח מתחת לעקומת החישובים. יש לקבל אם הפרוטוקול ואחריו בהצלחה הכרומתוגרמ...

Discussion

גז כרומטוגרפיה היא טכניקה מדויקת לשימוש לניתוח חומצות שומן, והשחזור הגבוה שלו ימצא לטכניקה זו מתאימה לניתוחים קליניים. עמודות GC מתאימות חייבים להיות בשימוש על מנת לאפשר זיהוי של חומצות שומן של עניין, עם עמודות זמינות שיש וריאציות בקוטביות של השלב נייח, אורך עמודה וה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methanol	Fisher Scientific	M/4056/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Chloroform	Fisher Scientific	C/4966/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
BHT	Sigma- Aldrich	W218405	'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous
NaCl	Sigma- Aldrich	S9888	Anhydrous
Hexane	Fisher Scientific	H/0406/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Glacial acetic acid	Sigma- Aldrich	695084	'CAUTION' Burns - 99.85%
Sulfuric acid	Sigma- Aldrich	339741	'CAUTION' Burns - 99.999%
Potassium carbonate	Sigma- Aldrich	209619	99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate	Sigma- Aldrich	237205	99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate	Fisher Scientific	10204340	'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied
Toluene	Fisher Scientific	T/2300/15	'CAUTION' Fumes
Diethyl ether	Sigma- Aldrich	309966	'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder	BOC	44-w	'CAUTION' Compressed gas - explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges	Agilent	12102014	Cartridge - Bead mass 100 mg
Silica gel SPE cartidges	Agilent	14102010	Cartridge - Bead mass 100 mg
Molecular seives	Sigma- Aldrich	334324	Pellets, AW-300, 1.6 mm
Glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	FB50251