O uso de cromatografia gasosa para analisar composicional Alterações de ácidos graxos no tecido de fígado de rato durante a gravidez

Resumo

Gravidez leva a mudanças significativas na composição de ácidos graxos dos tecidos maternos. Perfil lipídico pode ser obtido através de cromatografia de gás para permitir a identificação e quantificação de ácidos graxos em classes de lipídios individuais entre ratos alimentados com dietas ricas em gordura vários altos e baixos durante a gravidez.

Resumo

Cromatografia em fase gasosa (GC) é um método altamente sensível para identificar e quantificar o teor de ácidos graxos de lipídios a partir de tecidos, células e plasma / soro, produzindo resultados com alta precisão e alta reprodutibilidade. Em estudos metabólicos e nutricionais GC permite a avaliação de alterações nas concentrações de ácidos graxos seguintes intervenções ou durante mudanças no estado fisiológico, como a gravidez. Extracção em fase sólida (SPE) com aminopropilo cartuchos de sílica permite a separação das principais classes de lípidos incluídos triacilgliceróis, fosfolípidos diferentes, e ésteres de colesterol (CE). GC combinada com SPE foi utilizado para analisar as mudanças na composição de ácidos graxos da fração CE nos fígados de ratos virgens e grávidas que tinham sido alimentados várias dietas de alto e baixo teor de gordura. Há efeitos significativos de interação dieta / gravidez sobre o teor de ácido ômega-3 e ômega-6 ácidos graxos do fígado CE, indicando que as fêmeas grávidas têm uma resposta diferente para Manipulat dietéticoíon que é visto entre as mulheres virgens.

Introdução

Cromatografia em fase gasosa (GC) é uma técnica bem estabelecida utilizada para identificar e quantificar a incorporação de ácidos gordos para piscinas lipídicas e das membranas celulares durante ^1,2 ou suplementação condições fisiológicas, tais como a obesidade (e doenças relacionadas tais como diabetes) ou gravidez ^{3 - 5.} Também é adequado para a análise dos tipos e quantidades de gorduras em alimentos. Isto é útil na caracterização dietas experimentais, bem como garantir que a indústria de alimentos está em conformidade com os regulamentos. Por exemplo, GC, pode ser utilizado para confirmar a identidade e a quantidade de ácidos gordos num produto, como um suplemento dietético para assegurar que a rotulagem é correcta e regulamentos são respeitados ^6,7. Análise de ácidos graxos podem fornecer informações valiosas sobre o metabolismo lipídico na saúde e na doença, o impacto da mudança na dieta, e os efeitos das mudanças no estado fisiológico ^8. A utilização de GC para estudar amostras durante a gravidez tem proporcionado importanteinformação sobre alterações no ácido graxo e complexo homeostase lipídica ^3.

Antes da separação cromatográfica, os lípidos são tipicamente extraída da amostra, utilizando a solubilidade dos lípidos em misturas de solventes de clorofórmio e metanol. O cloreto de sódio é adicionado a fim de facilitar a separação da mistura de lípidos em solução aquosa e orgânica contendo ^9,10 fases. Classes de lípidos complexos de interesse podem ser separados a partir do extracto de lípido total por extracção de fase sólida (SPE). Esta técnica de separação elui classes de lipídios com base em sua polaridade ou afinidade de ligação. Triacyglycerols (TAG) e éster de colesterol (EC) são eluidos primeiro como uma fracção combinada, outras classes, a fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), e os ácidos gordos não esterificados (NEFA) são eluídas por aumento da polaridade do solvente de eluição . A separação do TAG da CE explora a ligação da TAG apenas a um cartri SPE frescodge, permitindo CE a ser eluído. TAG pode então ser eluída por aumento da polaridade do solvente de eluição ^9,10. Este método permite que várias amostras a serem separados, simultaneamente, com um rendimento mais elevado do que é conseguido com a cromatografia em camada fina, o que significa que relativamente pequenas amostras de tamanho (por exemplo, <100 ul de plasma ou soro, <100 mg de tecido) podem ser analisados ^​​11,12.

CG é uma técnica bem estabelecida primeiro descrita em 1950, e foi sugerido que a fase móvel, em seguida, os sistemas de líquido-líquido pode ser substituído por vapor. Ele foi inicialmente usado para a análise de petróleo, mas rapidamente se expandiu para outras áreas, como análise de aminoácidos e bioquímica lipídica, que ainda é de grande interesse. Avanços na tecnologia e equipamento de GC, como o desenvolvimento de colunas capilares das colunas empacotadas utilizadas anteriormente conduziu a nossas técnicas actuais, em que os ácidos gordos são capazes de serseparadas de forma mais eficiente a baixas temperaturas, resultando em GC sendo rotineiramente utilizado para identificar e quantificar os ácidos gordos numa vasta gama de investigações ^13.

GC requer ácidos gordos de ser derivatizados de modo que eles podem tornar-se suficientemente volátil para ser eluída a temperaturas razoáveis ​​sem decomposição térmica. Isto normalmente envolve a substituição de um grupo funcional contendo hidrogénio para formar ésteres, tioésteres ou amidos para análise. Os ésteres metílicos são vulgarmente estudada derivados, os quais são produzidos por metilação. Neste método, as ligações éster em lípidos complexos são hidrolisados ​​para libertar os ácidos gordos livres, que são transmethylated para formar os ésteres metílicos dos ácidos gordos (FAME). O perfil resultante de FAME, determinada por GC, é referida como a composição de ácidos gordos e podem ser facilmente comparadas entre os diferentes grupos experimentais ^9,10. A técnica permite que ambas as proporções de indiácidos gordos e as suas concentrações ual a ser medido.

Em adição à utilização de GC para análise de ácidos gordos em estudos de nutrição e na indústria alimentar, a técnica pode ser utilizada numa vasta gama de campos de análise. Por exemplo, as análises ambientais utilizando GC incluem a medição da contaminação da água por inseticidas e análises do solo medição do teor de clorobenzeno. Em toxicologia, GC também tem sido utilizada para identificar substâncias ilegais na urina e amostras de sangue de indivíduos; um tal de aumentar o rendimento desportivo ^{de 12} e a capacidade de separar misturas complexas de hidrocarbonetos torna esta técnica popular na indústria do petróleo para a análise petroquímica ^12.

A gravidez está associada com alterações significativas na composição de ácidos graxos dos tecidos maternos, especificamente no conteúdo de ácidos graxos ômega-3 (n-3) e ômega-6 (n-6) aci graxos poliinsaturadosds (PUFA) ^3. No estudo actual, que exemplificam o uso de GC na medição de ácidos gordos, descrevendo a sua utilização na análise da composição de ácido gordo do tecido do fígado de ratos virgens feita grávidas e alimentados com dietas de baixo e alto teor de gordura, com diferentes fontes de petróleo. As dietas experimentais foram fornecidas aqui uma dieta de baixa gordura à base de óleo de soja, uma dieta à base de óleo de soja rica em gordura (130,9 g Total de gordura / kg de gordura total) ou de uma dieta à base de óleo de linhaça rica em gordura (130,9 g Total de gordura / kg dieta), desde há 20 dias. A composição de ácidos gordos e nutrientes completo destas dietas têm sido descritos anteriormente ^14. As dietas com óleo de soja são ricas em ácido linoleico (18:2 n-6) e conter algum ácido linolénico-α (18:3 n-3) ao passo que a dieta de óleo de linhaça é rico em ácido linolénico-α. Estas dietas de alta gordura representam diferentes rações de linoléico para α-linolênico (rações de 08:01 e 01:01, respectivamente). O método para o isolamento de classes de lípidos individuais e análise por GC que éll estabelecido e validado, e tem sido publicado anteriormente ^10, mas sem a descrição técnica pormenorizada aqui encontrados.

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Protocolo

1. Procedimentos com animais

1. Todo o trabalho animal deve ser realizado de acordo com o escritório de animais domésticos (Scientific Procedures) Act (1986).
2. Acasalar ratos Wistar com idade de 10 semanas de idade, por meio de cruzamento monogâmico, e confirmar a gravidez pelo aparecimento de um tampão vaginal. Grave este como o dia 1 de gestação, e começar a dieta experimental. Para as fêmeas virgens, abrigar cada rato individualmente, e começar a dieta experimental.
3. Depois de alimentar as dietas experimentais durante 20 dias eutanásia ratos por asfixia CO ₂ seguido por deslocamento cervical.
4. Use uma pinça de dissecção e tesouras para expor a cavidade abdominal e extirpar o fígado, cortando os ligamentos, que ligam o fígado ao diafragma, parede anterior do abdômen, estômago e duodeno. Lavar o fígado em PBS e congelar em azoto líquido antes da armazenagem à temperatura de -80 ° C.

2. Preparação de um total de lipídeos Extrato ⁹

1. Adicionar moleculpeneiras ar (para encher 1/10 do recipiente de solvente) a todos os solventes para criar solventes "secos". Realizar todos os trabalhos de solvente dentro de um exaustor.
2. Cortar cerca de 100 mg de fígado congeladas e pesar. Coloque o tecido em um tubo em um balde de gelo e adicionar 0,8 ml gelada de NaCl 0,9%. Homogeneizar o tecido.
3. Adicionar padrões internos dissolvidos em 1 ml / mg de clorofórmio seco: metanol (2:1, v / v) contendo o hidroxitolueno butilado (BHT, 50 mg / l) como anti-oxidante. Para 100 mg de fígado de rato adicionar 100 mg de padrão do CE (Cholesteryl heptadecanoato 17:00) Atenção:. Clorofórmio e BHT são perigosos.
4. Adicionar 5,0 ml de clorofórmio seco: metanol (2:1, v / v) contendo BHT (50 mg / L).
5. Adicionar 1,0 ml de 1 M NaCl, misturar bem em vórtice até que a mistura parece uniforme. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
6. Centrifugar a 1000 xg por 10 min, baixo freio à temperatura ambiente.
7. Colete menorfase de Pasteur de vidro usando uma pipeta, transferir para novo tubo de vidro com tampa de rosca e seco sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.

3. A separação de classes lipídicas por extracção de fase sólida (SPE) ¹⁰

1. Ligar o tanque de SPE com uma bomba de vácuo e coloque aminopropil cartucho de SPE de sílica no tanque.
2. Coloque a nova tampa de rosca tubo de vidro TAG rotulados e CE no rack tanque na coluna para coletar primeira fracção.
3. Dissolver o extrato de lipídios totais em 1,0 ml de clorofórmio seco e vortex.
4. Aplicar a amostra para a coluna utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro e deixa-se escorrer para dentro do tubo por meio de rosca, por gravidade. Quando não mais pinga cair, remova o líquido restante por vácuo.
5. Eluir a fracção TAG e CE-se sob vácuo, lava-se a coluna com 2 x lavagens de 1,0 ml de clorofórmio seco.
6. Quando todo o líquido é removido, secar o TAG e CE fraccionamenton sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
7. Coloque a nova tampa de rosca tubo de vidro PC rotulado na bandeja de tanque na coluna.
8. Eluir a fracção de PC sob vácuo com a adição de 2 x 1,0 ml de clorofórmio seco: metanol (60:40, v / v) até que todo o líquido é removido da coluna.
9. Remover e fracção PC seca sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
10. Colocar uma nova tampa de rosca do tubo de vidro PE marcado na bandeja do tanque e eluir fracção de PE com a adição de 1,0 ml de metanol seco sob vácuo.
11. Remover e fracção de PE seca sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
12. Coloque novo tubo de vidro com tampa de rosca rotulado NEFA no tabuleiro de tanque e eluir fracção NEFA sob vácuo com a adição de 2 x 1,0 mL de lavagens de clorofórmio seco: metanol: ácido acético glacial. (100:2:2, v / v / v) Cuidado: ácido acético glacial é perigoso.
13. Retirar fracção recolhida NEFA e seco sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
14. Coloque um novo cartucho de SPE aminopropil sílica no tanque SPE e colocar um tubo de vidro com tampa de rosca na bandeja do tanque sob o cartucho para coletar resíduos.
15. Lavar a coluna com 3 lavagens de hexano seco sob vácuo e, em seguida, uma lavagem de 1,0 ml final, sob acção da gravidade. Não permita que o cartucho se torne seca (transformar os canais de colunas cartucho para uma posição fechada quando o nível de hexano fica perto da matriz cartucho) Cuidado:. Hexano é perigosa.
16. Substitua o tubo de resíduos com tubo de vidro novo tampa de rosca rotulado CE.
17. Dissolve-se o TAG e CE fracção seca (preparado no passo 3.6) em 1,0 ml de hexano seco e de vórtice. Aplicar esta para a coluna utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro e deixa-se escorrer através sob gravity.
18. Quando não mais pinga cair, remova o líquido restante sob vácuo.
19. Sob vácuo, lava-se a coluna com 2 x 1,0 mL de lavagens de hexano e seco para eluir CE fracção recolhida e seca sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
20. Coloque a nova tampa de rosca tubo de vidro TAG marcados na bandeja do tanque e elute TAG com a adição de 2 x 1,0 ml lavagens de hexano seco: metanol: acetato de etilo (100:5:5) sob vácuo.
21. Fracção recolhida a seco sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana Cuidado:. Acetato de etilo é perigoso.

4. Preparação de FAME do CE ¹⁰

1. Adicionar 0,5 ml de tolueno seco à fracção CE separado (recolhido no passo 3.19) e vórtice Cuidado:. Tolueno é perigoso.
2. Preparação do reagente de metilação (metanol seco, com 2% (v/ V) _de H ₂ SO _4), de que é necessário 1,0 ml por amostra. Dispensar volume de metanol seco em recipiente de vidro ou de plástico adequado com a tampa e adicionar a quantidade necessária de H ₂ SO _4, gota a gota, em seguida, misturar por inversão Cuidado:. Ácido sulfúrico é perigoso.
3. Adicionar 1,0 ml de reagente de metilação para as amostras dissolvidas em tolueno seco, a tampa de forma segura os tubos, e agitar suavemente.
4. Aquecer as amostras durante 2 horas a 50 ° C.
5. Após 2 horas retirar os tubos de calor. Uma vez que adicionar fresco 1,0 ml (0,25 M _KHCO3 0.5MK ₂ CO ₃₎ Cuidado neutralizantes:. Bicarbonato de potássio e carbonato de potássio são perigosos.
6. Adicionar 1,0 ml de hexano seco e de vórtice.
7. Centrifugar a 250 xg por 2 min, baixo freio à temperatura ambiente.
8. Recolhe fase superior, que contém a FAME, e transferir para um novo tubo de tampa de rosca não vidro descartável.
9. Seque o FAME coletados sobazoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.

5. Remoção de colesterol livre de contaminação de FAME CE ¹⁴

(Colesterol livre pode contaminar a amostra, ver Figura 1 para traços exemplo cromatógrafo com e sem a remoção do colesterol livre).

1. Coloque um tubo de resíduos dentro do tanque de SPE e colocar um cartucho de SPE de sílica gel para o tanque.
2. Lavar coluna com 3 x 1 mL lavagens de hexano seco sob vácuo e 1 x 1 ml sob gravidade.
3. Remover lavagens de resíduos e adicionar novo tubo de resíduos dentro do tanque.
4. Dissolver FAME CE em 1 ml de hexano seco, vórtice.
5. Aplicam-se à coluna, utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro e deixa-se escorrer através sob gravidade.
6. Lavar coluna com 3 x 1 mL lavagens de hexano sob vácuo.
7. Remover lavagens de resíduos e coloque novo tubo não tampa de rosca em tanque rotulado FAME CE.
8. Eluir aFAME CE com 2 x 1 ml de hexano seco: éter dietílico (95:5 v / v) lavagens.
9. Seca-se sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana Cuidado:. Éter dietílico é perigoso.

6. Transferência de FAME em GC Auto Sampler Vial

1. Adicionar 75 mL de hexano seco para provar, vortex, e transferir para um frasco de amostra auto GC.
2. Adicionar mais 75 mL de hexano seco para provar, vórtice e transferir para a mesma amostra GC auto frasco. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, até um mês.

7. Análise Usando o cromatógrafo a gás ¹⁴

1. Analisar FAME em um cromatógrafo a gás. Exemplo configurar: 30 mx 0,25 mM x 0,25 milímetros BPX-70 fundido coluna capilar de sílica com o protocolo de temperatura:
   Temperatura inicial de 115 ° C, manter 2 min, rampa de 10 ° C / min até 200 ° C, manter 18,5 min, rampa de 60 ° C / min até 245 ° C, hvelho 4 min.
   Coluna: gás hélio, vazão de 1,0, pressão de 14,6 e velocidade 29.
   Injector: Temperatura = 300 ° C.
   Detector: fluxo de hidrogênio 40,0, ar fluir 184,0, compõem Hélio Gás, Flow 45,0, temperatura = 300 ° C.
2. Definir taxa de divisão conforme o caso (por exemplo, 25:1 para análise FAME CE).
3. Para determinar a área sob cada pico, utilizando software apropriado e identificar FAME por comparação com padrões. Veja a Figura 2, por exemplo, cromatogramas.
4. Usar a área sob os picos de dados para calcular a contribuição de ácidos gordos individuais, como uma percentagem do total de ácidos gordos.
5. Calcular as concentrações absolutas dos ácidos gordos através da divisão da área do padrão interno pela quantidade adicionada. Dividir a área de cada um dos ácidos gordos por este resultado para obter concentrações absolutas de cada ácido gordo no interior do volume de tecido utilizado.

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Resultados

O sucesso deste método depende da sequência do protocolo de forma precisa e em utilizar solventes e reagentes de limpeza, a fim de reduzir o "ruído" e contaminação que podem aparecer em um cromatograma. Amostras contaminadas são mais difíceis de analisar, diminuindo a precisão da área sob a curva de cálculos. Se o protocolo é seguido com sucesso um cromatograma com claras simétricas, picos bem definidos e com um mínimo de ruído de fundo deve ser obtido tal como ilustrado na Figura 3.

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Discussão

A cromatografia gasosa é uma técnica precisa de usar para análise de ácidos graxos, e sua alta reprodutibilidade considere esta técnica adequada para análises clínicas. Colunas GC apropriadas deve ser utilizado para permitir a identificação dos ácidos graxos de interesse, com colunas disponíveis tendo variações na polaridade da fase estacionária, o comprimento da coluna e do diâmetro interno. A utilização de uma coluna capilar de sílica fundida no presente método de análise proporciona uma boa estabi...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methanol	Fisher Scientific	M/4056/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Chloroform	Fisher Scientific	C/4966/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
BHT	Sigma- Aldrich	W218405	'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous
NaCl	Sigma- Aldrich	S9888	Anhydrous
Hexane	Fisher Scientific	H/0406/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Glacial acetic acid	Sigma- Aldrich	695084	'CAUTION' Burns - 99.85%
Sulfuric acid	Sigma- Aldrich	339741	'CAUTION' Burns - 99.999%
Potassium carbonate	Sigma- Aldrich	209619	99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate	Sigma- Aldrich	237205	99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate	Fisher Scientific	10204340	'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied
Toluene	Fisher Scientific	T/2300/15	'CAUTION' Fumes
Diethyl ether	Sigma- Aldrich	309966	'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder	BOC	44-w	'CAUTION' Compressed gas - explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges	Agilent	12102014	Cartridge - Bead mass 100 mg
Silica gel SPE cartidges	Agilent	14102010	Cartridge - Bead mass 100 mg
Molecular seives	Sigma- Aldrich	334324	Pellets, AW-300, 1.6 mm
Glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	FB50251