임신 중 쥐의 간 조직에서 지방산의 작곡 변화를 분석하는 가스 크로마토 그래피의 사용

요약

임신 산모 조직의 지방산 조성에 상당한 변화를 이끈다. 지질 쥐 사이의 식별 및 개별 지질 클래스에있는 지방산의 정량 임신 중에 다양한 높고 낮은 지방 다이어트를 공급 할 수 있도록 가스 크로마토 그래피를 통해 얻을 수있다.

초록

기체 크로마토 그래피 (GC)은 높은 정확도 및 재현성 결과를 수득 조직, 세포 및 혈장 / 혈청에서 지질의 지방산 콘텐츠를 식별하고 정량화하기 위해 사용되는 매우 중요한 방법이다. 대사 및 영양 연구에서 GC는 허용 개입을 다음과 지방산 농도 또는 임신 등의 생리적 상태의 변화시 변화의 평가. 아미노 실리카 카트리지를 사용하여 고체상 추출 (SPE)가 허용 트리 아실 글리세롤, 다른 인지질 및 콜레 스테 릴 에스테르 (CE)를 포함한 주요 지질 클래스의 분리. SPE와 함께 GC 다양한 높고 낮은 지방 다이어트를 공급했다 처녀 임신 한 쥐의 간에서 CE 분획의 지방산 조성의 변화를 분석하는 데 사용되었다. 간 CE의 오메가 -3와 오메가 -6 지방산 함량에 따라 상당한 다이어트 / 임신 상호 작용 효과는 임신 한 여성은식이 manipulat에 ​​다른 반응을 나타내는 있습니다보다 이온 처녀 여성 사이에서 볼 수있다.

서문

기체 크로마토 그래피 (GC)의 보급이나 생리적 비만과 같은 조건 (및 당뇨병과 같은 관련 질환) 또는 임신 ³ 중에 지질 풀 및 세포막 ^1,2으로 지방산의 혼입을 식별하고 정량화하기 위해 사용 노포 기법 ^{- 5.} 또한 식품의 유형과 지방의 양을 분석에 적합하다. 실험 사료의 특성뿐만 아니라, 식품 업계가 규정을 준수 함을 보장하는 경우에 유용합니다. 예를 들어, GC는 라벨링가 정확하고 규제가 ^6,7에 부착되도록하는 등 건강 보조 식품 등의 제품 내의 아이덴티티 및 지방산의 양을 확인하기 위하여 사용될 수있다. 지방산의 분석은 질병과 건강식이 변화의 영향 및 생리적 상태 ^8의 변동 효과 지질 대사에 가치있는 통찰을 제공 할 수있다. 임신 중에 샘플을 연구하는 GC의 사용은 중요한 제공하고 있습니다지방산과 복합 지질 항상성 ^3의 변화에 대한 정보를 제공합니다.

크로마토 그래피 분리에 앞서, 지질은 일반적 클로로포름과 메탄올의 혼합 용매에서의 지질 용해도를 사용하여 샘​​플로부터 추출된다. 염화나트륨 ^{9,10 단계를} 포함하는 수성 및 유기 지방질로 혼합물의 분리를 용이하게하기 위해 첨가된다. 그 복잡한 지질 클래스는 고체상 추출 (SPE)에 의해 총 지질 추출물로부터 분리 될 수있다. 이 분리 기술은 극성 또는 결합 친화도에 따라 지질 클래스를 용출. Triacyglycerols (TAG) 및 콜레 스테 릴 에스테르 (CE)가 결합 분획, 상기 클래스, 포스파티딜콜린 (PC)와 같은 제 용출, 포스파티딜 에탄올 아민 (PE), 비 에스테르 화 지방산 (NEFA)은 용출 용매의 극성을 증가시킴으로써 용출 . CE에서 TAG의 분리는 신선한 SPE의 cartri에 태그의 결합을 이용DGE, CE가 용출 될 수 있도록. TAG는 용출 용매 ^9,10의 극성을 증가시킴으로써 용출 될 수있다. 이 방법은보다 높은 수율로 동시에 분리 될 여러 샘플들이 비교적 작은 크기의 샘플 (예를 들어 <100 μl의 혈장 또는 혈청, <100 밀리그램 티슈) ^{(11, 12)를} 분석 할 수 있음을 의미하는, 박막 크로마토 그래피로 달성한다.

GC는 제 1950에 기재된 잘 확립 된 기술이며, 이는 다음 액체 - 액체 시스템에서의 이동상이 증기로 대체 될 수 있다고 제안 하였다. 그것은 초기 석유 분석에 사용하지만 급속 같은 아미노산 분석 및 주요 관심 여전히 지질 생화학 같은 다른 영역으로 확장되었다. 이러한 이전에 사용 된 포장 열에서 모세관 컬럼의 개발과 같은 GC 장비 및 기술의 발전은 지방산이 될 수있는 우리의 현재 기술을 주도하고있다GC 일상적 조사 ^(13)의 넓은 범위에서 지방산을 식별하고 정량화하기 위해 사용되는 결과로 낮은 온도에서 더 효율적으로 분리된다.

GC들은 열분해없이 알맞은 온도에서 용출 될 정도로 충분히 휘발성이 될 수 있도록 유도되는 지방산을 필요로한다. 이것은 보통 분석 에스테르, 티오 에스테르 또는 아미드를 형성하는 수소 함유 작용기의 치환을 포함한다. 메틸 에스테르는 일반적으로 메틸화에 의해 생성되는 파생 상품을 연구한다. 이 방법에서는 복합 지질의 에스테르 결합은 지방산 메틸 에스테르 (FAME)을 형성 transmethylated되는 유리 지방산을 방출하는 가수 분해된다. GC에 의해 결정 FAME의 결과 프로파일은, 지방산 조성이라고 쉽게 다른 실험군 ^9,10 사이에 비교 될 수있다. 기술은 허용 individ의 비율 모두연간 지방산과 그 농도를 측정한다.

영양 연구 및 식품 산업 내의 지방산 분석을위한 GC의 용도 이외에, 분석적 기술은 폭 넓은 분야에서 사용할 수있다. 예를 들어, GC를 이용하여, 환경 분석은 살충제 및 토양에서 수질 오염을 측정 포함하는 클로로 벤젠 함량을 측정 분석한다. 독물학에서 GC 또한 소변 및 개인의 혈액 샘플에서 불법 물질을 식별하기 위해 사용 된, 예컨대 스포츠 퍼포먼스 강화제 ^(12)와 탄화수소의 복잡한 혼합물을 분리하는 능력은 화학 분석 ^(12)에 대한 석유 산업에서이 기술은 대중 만든다.

임신 구체적 오메가 -3 법적 산모 조직의 지방산 조성에 상당한 변화, (N-3) 및 오메가 -6 (N-6) 고도 불포화 지방산 ACI와 연결된DS (PUFA) ^3. 현재 연구에서, 우리는 다른 오일 소스와 낮은 고지방식이를 공급 처녀 임신 랫트로부터 취한 간 조직의 지방산 조성의 분석에서의 사용을 설명하는 순서 지방산의 측정에서 GC를 사용하는 방법을 예시. 여기에 제공된 실험 다이어트는 저지방 콩기름 식단, 고지방 대두유 기반의 다이어트 (130.9 g 총 지방 / kg 총 지방) 또는 높은 지방 아마씨 기름 기반의 다이어트 (130.9 g 총 지방 / kg이었다 20 일에 대한 가격을 제공하는 다이어트). 이러한 다이어트의 전체 영양 및 지방산 조성은 이전에 ¹⁴ 설명 하였다. 콩기름 다이어트는 리놀레산 (18시 2분 N-6)이 풍부하고, 아마씨 기름 다이어트 α-리놀렌산이 풍부 동안 일부 α-리놀렌산 (18시 3분 N-3)가 포함되어 있습니다. 이러한 높은 지방 다이어트는 리놀레산 α-리놀렌산하는 산 (각각 8:1 1:1의 배급)의 다른 식량을 나타냅니다. 개인 지질 클래스와 GC에 의한 분석의 분리를위한 방법은 우리입니다LL 설립 및 검증, 이전에 ¹⁰ 만, 여기에있는 자세한 기술 설명없이 게시되었습니다.

프로토콜

1. 동물 절차

1. 모든 동물의 작업은 홈 오피스 동물 (과학적인 절차) 법 (1986)에 따라 수행되어야한다.
2. 일부일처 번식에 의해 오래 십주 세의 Wistar 쥐 메이트, 및 질 플러그의 모양에 의해 임신을 확인합니다. 임신 중 하루 1로 이것을 기록하고 실험적인 다이어트를 시작. 처녀 여성의 경우, 개별적으로 쥐를 수용하고, 실험적인 다이어트를 시작.
3. 20 일을위한 실험 사료를 공급 한 후 자궁 경부 전위 다음 CO ₂ 질식하여 쥐를 안락사.
4. 복강을 노출하고 격막에 간을 연결하는 인대, 복부의 앞쪽 벽, 위, 십이지장을 절단하여 간을 절제하는 해부 집게와 가위를 사용합니다. C. -80 ° 저장하기 전에 PBS의 간을 세척하고 액체 질소에 동결

2. 총 지질의 제조 추출 ⁹

1. molecul 추가AR 체는 '건조'용제를 만들기 위해 모든 용제 (솔벤트 용기의 1 / 10을 채우기 위해). 흄 후드 내에서 모든 솔벤트 작업을 수행하십시오.
2. 약 100 mg의 냉동 간을 잘라 무게. 얼음 양동이에 튜브에 조직을두고 0.8 ㎖를 얼음 냉각 된 0.9 %의 NaCl을 추가합니다. 조직을 균질화한다.
3. 건조 클로로포름 1 ㎖ / MG에 용해 된 내부 기준을 추가 : 메탄올 (2:1 V / V) 부틸 히드 록시 톨루엔 (BHT, 50 ㎎ / ℓ)를 포함하는 산화 방지제로. 쥐의 간 100 밀리그램 CE 표준의 100 μg을 추가를 위해 (콜레 스테 릴은 17:0을 heptadecanoate)주의 :. 클로로포름 및 BHT는 위험하다.
4. 5.0 ㎖ 건조 클로로포름을 추가 : 메탄올 (2:1 V / V) BHT (50 ㎎ / L)를 포함.
5. 1.0 ㎖의 1 M NaCl을 추가 혼합물 유니폼을 보이는 때까지 소용돌이로 교반하여 잘 혼합. 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
6. 10 분, 실온에서 낮은 브레이크 1,000 XG에 원심 분리기.
7. 낮은 수집유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 단계는 40 ℃에서 질소하에 새로운 스크류 캡 유리 튜브와 건조로 전송 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

3. 고상 추출에 의한 지질 클래스의 분리 (SPE) ¹⁰

1. 진공 펌프에 SPE 탱크를 연결하고 탱크에 아미노 실리카 SPE 카트리지를 배치합니다.
2. 제 1 분획을 수집하기 위해 열에서 탱크 랙에 새로운 스크류 캡 유리 튜브 라벨 태그와 CE를 놓습니다.
3. 1.0 ㎖의 건조 클로로포름과 소용돌이에 총 지질 추출물을 용해.
4. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 열을 샘플을 적용하고 중력에서 스크류 캡 튜브를 통해 똑똑 떨어지는 것을 허용한다. 더 이상 물감이 빠지지 않을 때, 진공 청소기를 이용하여 남아있는 액체를 제거합니다.
5. 건조 클로로포름 2 × 1.0 ㎖의 세척과 열을 세척, 진공 하에서 TAG 및 CE 부분을 용출.
6. 모든 액체가 제거 될 때, TAG 및 CE fractio 말려40 ℃에서 질소하에 N 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
7. 열 아래에있는 탱크 트레이에 새로운 스크류 캡 유리 튜브 라벨 PC를 놓습니다.
8. 2 × 1.0 ㎖의 건조 클로로포름 첨가 진공 하에서 PC 분획을 용출 : 메탄올 (60:40, V / V) 모든 액체가 컬럼으로부터 제거 될 때까지.
9. 40 ℃에서 질소하에 제거하고 건조 PC 분율 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
10. 탱크 트레이에 새로운 스크류 캡 유리 튜브 라벨 PE를 삽입하고 진공 상태에서 1.0 ML 건조 메탄올의 추가와 함께 PE 분획을 용출.
11. 40 ℃에서 질소하에 제거하고 건조 PE 분획 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
12. 탱크 트레이에 새로운 스크류 캡 유리 튜브 라벨 NEFA를 놓고 건조 클로로포름 2 × 1.0 ㎖의 세척을 첨가하여 진공 상태에서 NEFA의 부분을 용출 : 메탄올 : 빙초산. (100:2:2, V / V / V)주의 : 빙초산은 위험합니다.
13. 40 ℃에서 질소하에 수집 된 NEFA의 부분 건조를 제거 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
14. SPE 탱크에 새로운 아미노 실리카 SPE 카트리지를 삽입하고 폐기물을 수집하는 카트리지에 따라 탱크 트레이에 스크류 캡 유리 튜브를 놓습니다.
15. 3 진공 건조 헥산으로 세척 및 중력에 따라 다음 최종 1.0 ㎖ 세척과 열을 씻으십시오. . 카트리지 (헥산 레벨이 카트리지 매트릭스에 근접 할 때 폐쇄 위치로 카트리지 컬럼 채널을 돌려)주의 건조 될 수 있도록하지 마십시오 헥산는 위험합니다.
16. 새로운 스크류 캡 유리 튜브 라벨 CE와 폐기물 튜브를 교체합니다.
17. 건조 헥산과 소용돌이의 1.0 ㎖에 (단계 3.6에서 준비) 건조 TAG 및 CE 부분을 녹입니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 열이를 적용하고 G 아래까지 떨어 뜨리지ravity.
18. 더 이상 물감이 빠지지 않을 때, 진공 상태에서 남아있는 액체를 제거합니다.
19. 진공에서 40 ℃에서 질소하에 CE 및 건조 수집 부분을 용출 건조 헥산 2 × 1.0 ㎖의 세척과 열을 씻어 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
20. 건조 헥산 2 × 1.0 ㎖의 세척을 추가하여 탱크 트레이 및 용출 TAG 새로운 스크류 캡 유리 튜브 라벨 태그를 : 메탄올 : 에틸 아세테이트 (100:5:5) 진공.
21. 40 ℃에서 질소하에 건조 수집 분수 . 샘플은 일주일에 최대주의를위한 출장이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 : 에틸 아세테이트는 위험합니다.

4. 명예의 준비 CE ¹⁰

1. . 분리 CE 분율 (단계 3.19에서 수집)와 소용돌이주의에 건조 톨루엔 0.5 ㎖를 추가 톨루엔은 위험합니다.
2. 2 % (v의 메틸화 시약을 준비한다 (건조 메탄올/ v) 1.0 ㎖를 샘플 당 요구되는 건 H ₂ SO _4). 유리 또는 뚜껑에 적합한 플라스틱 용기에 건조 메탄올의 양을 분배하고 SO ₄ 적하 후주의 반전하여 혼합 H _2의 필요한 양을 추가합니다. 황산 위험한입니다.
3. 건조 톨루엔에 용해 된 샘플을 메틸화 시약 1.0 mL를 넣고 단단히 튜브 캡을 조심스럽게 섞는다.
4. 50 ℃에서 2 시간 동안 샘플을 가열
5. 2 시간 후 열에서 튜브를 제거합니다. . 칼륨 탄산 수소 칼륨, 탄산 유해 일단 차가운 용액 (0.25 M KHCO ₃ 0.5MK ₂ CO _3)주의를 중화 1.0 ML를 추가합니다.
6. 1.0 ㎖의 건조 헥산과 소용돌이를 추가합니다.
7. 2 분 실온에서 낮은 브레이크 250 XG에 원심 분리기.
8. FAME가 들어 위의 위상을 수집하고, 새가 아닌 스크류 캡 일회용 유리 튜브로 전송할 수 있습니다.
9. 에서 수집 된 명성을 건조40 ° C에서 질소 샘플은 최대 일주일에 덮인이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

5. CE의 FAME ^{(14)로부터} 무료 콜레스테롤 오염 제거

(무료 콜레스테롤은 샘플을 오염시킬 수있는 무료 콜레스테롤 제거하지 않고 예를 들어 크로마토 그래프 추적 그림 1 참조).

1. SPE 탱크에 폐기물 튜브를 놓고 탱크에 실리카겔 SPE 카트리지를 배치합니다.
2. 진공 건조 헥산 3 × 1 ㎖ 세척 및 중력에서 1 x 1 ㎖로 컬럼을 씻으십시오.
3. 폐 세척을 제거하고 탱크에 새로운 폐기물 관을 추가합니다.
4. 1 ㎖의 건조 헥산, 소용돌이에 CE의 명성을 녹인다.
5. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 열을 적용하고 중력 하에서 통해 똑똑 떨어지는 것을 허용한다.
6. 진공 헥산 3 × 1 ㎖ 세척과 열을 씻으십시오.
7. 폐 세척을 제거하고 탱크 표시 CE의 명성에 새로운 아닌 스크류 캡 튜브를 놓습니다.
8. 용출2 x 1 ㎖의 건조 헥산 CE의 FAME : 디 에틸 에테르 (95:5 V / V) 세척.
9. 40 ℃에서 질소하에 건조 . 샘플은 일주일에 최대주의를위한 출장이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 : 디 에틸 에테르는 위험합니다.

6. GC 자동 샘플러 유리 병에 명예의 전송

1. , 소용돌이 샘플 및 GC 자동 견본 작은 유리 병에 전송하는 75 ㎕의 건조 헥산을 추가합니다.
2. , 샘플 소용돌이와 같은 GC 자동 견본 작은 유리 병에 전송하기 위해 추가로 75 ㎕의 건조 헥산을 추가합니다. 샘플은 한 달에 최대를위한 출장이 단계에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

7. 가스 크로마토 그래프 ^(14)를 사용하여 분석

1. 가스 크로마토 그래프에 명성을 분석합니다. 예 설정 : 30 MX X 0.25 mm 0.25 μm의 BPX-70 온도 프로토콜과 용융 실리카 모세관 컬럼 :
   초기 온도 115 ° C, 개최 2 분, 경사 10 ° C / 분 200 ° C에, 245 ° C에 18.5 분, 경사 60 ° C / 분을 보유, H4 세 분.
   칼럼 : 헬륨 가스, 유속 1.0, 압력 및 속도 14.6 29.
   인젝터 : 온도 = 300 ° C.
   검출기 : 수소 흐름 40.0, 공기 온도 = 300 ℃, 45.0 흐름, 가스 헬륨을 구성, 184.0 흐름
2. (CE의 FAME 분석 예를 들어 25:1) 적절하게 설정 분할 비율.
3. 적절한 소프트웨어를 사용하여 각 피크 아래의 영역을 결정하고 기준과 비교하여 명성을 확인합니다. 예제 크로마토 그램 그림 2를 참조하십시오.
4. 전체 지방산의 백분율로서 개별 지방산의 기여도를 계산하는 피크 데이터에서 영역을 사용한다.
5. 양만큼 내부 표준의 영역을 분할하여 지방산의 절대 농도를 산출 덧붙였다. 사용 된 조직의 양 내의 각 지방산의 절대 농도를 구하는이 결과에 의해 각 지방산의 영역을 나눈다.

결과

이 방법의 성공은 정확하게 프로토콜을 다음에와 '노이즈'와 크로마토 그램에 표시 할 수있는 오염을 줄이기 위해 청정 용매 및 시약을 사용하는 방법에 따라 달라집니다. 오염 된 샘플은 곡선 아래 면적 계산의 정확도를 저하 분석 할 더 많은 도전이다. 프로토콜이 분명 대칭, 잘 정의 된 피크와 최소한의 배경 소음이 성공적으로 크로마토 그램을 따라하는 경우 (그림 3)을 얻을...

토론

기체 크로마토 그래피는 지방산 분석을 위해 사용하는 정확한 방법이며, 그 재현성이 높은 임상 분석에 적합한이 기술을 판단. 적절한 GC 컬럼은 가능한 열 정지상, 컬럼 길이 및 내경의 극성의 변화를 갖는, 또한 지방산의 식별을 가능하게하기 위해 사용되어야한다. 분석 방법에있어서 용융 실리카 모세관 컬럼의 사용은 우수한 열 안정성과 높은 표면 불활성 양호한 해상도 ^8에 의한 유지...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methanol	Fisher Scientific	M/4056/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Chloroform	Fisher Scientific	C/4966/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
BHT	Sigma- Aldrich	W218405	'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous
NaCl	Sigma- Aldrich	S9888	Anhydrous
Hexane	Fisher Scientific	H/0406/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Glacial acetic acid	Sigma- Aldrich	695084	'CAUTION' Burns - 99.85%
Sulfuric acid	Sigma- Aldrich	339741	'CAUTION' Burns - 99.999%
Potassium carbonate	Sigma- Aldrich	209619	99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate	Sigma- Aldrich	237205	99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate	Fisher Scientific	10204340	'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied
Toluene	Fisher Scientific	T/2300/15	'CAUTION' Fumes
Diethyl ether	Sigma- Aldrich	309966	'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder	BOC	44-w	'CAUTION' Compressed gas - explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges	Agilent	12102014	Cartridge - Bead mass 100 mg
Silica gel SPE cartidges	Agilent	14102010	Cartridge - Bead mass 100 mg
Molecular seives	Sigma- Aldrich	334324	Pellets, AW-300, 1.6 mm
Glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	FB50251