L'uso di gas cromatografia per analizzare compositivo Variazioni degli acidi grassi nel fegato di ratto tessuto durante la gravidanza

Riepilogo

La gravidanza porta a cambiamenti significativi alla composizione in acidi grassi dei tessuti materni. Profili lipidici possono essere ottenuti tramite gascromatografia per consentire l'identificazione e la quantificazione degli acidi grassi nelle singole classi di lipidi tra i ratti alimentati con varie diete ad alto e basso contenuto di grassi durante la gravidanza.

Abstract

Gas cromatografia (GC) è un metodo altamente sensibile utilizzato per identificare e quantificare il contenuto di acidi grassi dei lipidi dai tessuti, cellule e plasma / siero, ottenendo risultati con elevata precisione e alta riproducibilità. Negli studi metabolici e della nutrizione GC permette la valutazione delle variazioni nelle concentrazioni di acidi grassi seguenti interventi o durante cambiamenti di stato fisiologico come la gravidanza. Estrazione in fase solida (SPE) utilizzando amminopropil cartucce di silice permette la separazione delle principali classi di lipidi, tra cui trigliceridi, diversi fosfolipidi e esteri del colesterolo (CE). GC combinato con SPE è stato utilizzato per analizzare i cambiamenti nella composizione in acidi grassi della frazione CE nel fegato dei ratti vergini e gravide che erano stati alimentati con varie diete ad alto e basso contenuto di grassi. Ci sono significativi effetti di interazione di dieta / gravidanza al momento il contenuto di acido omega-3 e omega-6 acidi grassi del fegato CE, che indica che le donne incinte hanno una risposta diversa a manipulat alimentareione che si vede tra le femmine vergini.

Introduzione

Gas cromatografia (GC) è una tecnica ben consolidata utilizzato per identificare e quantificare l'incorporazione degli acidi grassi in pool di lipidi e le membrane cellulari ^1,2 durante la supplementazione o fisiologiche condizioni come l'obesità (e le malattie correlate come il diabete) o la gravidanza ^{3 - 5.} E 'adatto per analizzare i tipi e le quantità di grassi negli alimenti anche. Questo è utile quando caratterizzare diete sperimentali, nonché di assicurare che l'industria alimentare è conforme alle normative. Ad esempio, GC può essere utilizzata per confermare l'identità e la quantità di acidi grassi di un prodotto come integratore alimentare per garantire che l'etichettatura è corretta e disposizioni sono rispettate ^6,7. Analisi di acidi grassi in grado di fornire preziose intuizioni metabolismo dei lipidi nella salute e nella malattia, l'impatto del cambiamento di dieta, e l'effetto delle variazioni di stato fisiologico ^8. Uso di GC per studiare campioni durante la gravidanza ha fornito importanteinformazioni sui cambiamenti in acidi grassi e complesso lipidico omeostasi ^3.

Prima della separazione cromatografica, lipidi sono generalmente estratti dal campione usando la solubilità dei lipidi in miscele di solventi di cloroformio e metanolo. Viene aggiunto cloruro di sodio per facilitare la separazione della miscela in lipidi acquosa e organica contenente ^9,10 fasi. Classi di lipidi complessi di interesse possono essere separati dall'estratto totale di lipidi mediante estrazione in fase solida (SPE). Questa tecnica di separazione eluisce classi di lipidi in base alla loro polarità o di affinità di legame. Triacyglycerols (TAG) ed esteri del colesterolo (CE) vengono eluiti prima come frazione combinata, altre classi, fosfatidilcolina (PC), Fosfatidiletanolamina (PE), e acidi grassi non esterificati (NEFA) sono eluiti aumentando la polarità del solvente di eluizione . La separazione di TAG da CE sfrutta il legame di TAG solo ad una SPE cartri frescodge, permettendo CE da eluito. TAG può essere eluito aumentando la polarità del solvente eluizione ^9,10. Questo metodo consente a più campioni da separare simultaneamente con una resa superiore è realizzato con cromatografia su strato sottile, il che significa che i campioni di dimensioni relativamente piccole (per esempio <100 microlitri di plasma o siero, <100 mg di tessuto) possono essere analizzati ^11,12.

GC è una tecnica ben consolidata prima descritto nel 1950, è stato suggerito che la fase mobile nei sistemi liquido-liquido poi potrebbe essere sostituito con il vapore. Inizialmente è stato utilizzato per l'analisi del petrolio, ma rapidamente esteso anche ad altri settori quali l'analisi degli aminoacidi e biochimica dei lipidi, che è ancora di grande interesse. Progressi nelle apparecchiature GC e tecnologie come lo sviluppo di colonne capillari dalle colonne impaccate utilizzati in precedenza ha portato alle nostre attuali tecniche in cui gli acidi grassi sono in grado di essereseparati più efficiente a temperature più basse con conseguente GC essendo ordinariamente usato per identificare e quantificare gli acidi grassi in una vasta gamma di indagini ^13.

GC richiede acidi grassi per essere derivatizzati in modo che essi possono diventare sufficientemente volatile per essere eluito a temperature ragionevoli senza decomposizione termica. Questo di solito comporta la sostituzione di un gruppo funzionale contenente idrogeno per formare esteri, tioesteri o ammidi per analisi. Esteri metilici vengono comunemente studiate derivati, che sono prodotti da metilazione. In questo metodo i legami estere in lipidi complessi vengono idrolizzati a rilasciare gli acidi grassi liberi, che sono transmethylated a formare esteri metilici degli acidi grassi (FAME). Il profilo risultante di FAME, determinato mediante GC, viene indicato come la composizione in acidi grassi e può essere facilmente confrontata tra diversi gruppi sperimentali ^9,10. La tecnica consente entrambe le proporzioni di indiviacidi grassi goli e della loro concentrazione da misurare.

Oltre all'uso di GC per l'analisi di acidi grassi in studi nutrizionali e all'interno del settore alimentare, la tecnica può essere utilizzata in un'ampia gamma di settori analitici. Ad esempio, analisi ambientali mediante GC includono la misurazione della contaminazione delle acque da insetticidi e analisi del suolo misurare il contenuto di clorobenzene. In tossicologia, GC è stato utilizzato anche per identificare le sostanze illegali in campioni di sangue di individui urine e, una tale stimolatori sport ¹² e la capacità di separare miscele complesse di idrocarburi rende questa tecnica popolare nell'industria petrolifera per l'analisi petrolchimica ^12.

La gravidanza è associata a cambiamenti significativi nella composizione in acidi grassi dei tessuti materni in particolare, nel contenuto di omega-3 (n-3) e omega-6 (n-6) polinsaturi aci grassids (PUFA) ^3. In questo studio, abbiamo esemplificare l'uso di GC nella misura di acidi grassi descrivendo il suo uso nell'analisi della composizione in acidi grassi del tessuto epatico prelevato da ratti vergini e gravidanza alimentati diete a basso ed alto contenuto di grassi con differenti fonti di petrolio. Le diete sperimentali forniti qui sono stati un olio a base di dieta a basso contenuto di grassi di soia, una dieta ricca di grassi a base di olio di soia (130,9 g di grassi totali / kg di grasso totale) o una dieta a base di olio di lino alto contenuto di grassi (130.9 g di grassi totali / kg dieta), disponibile per 20 giorni. La composizione in acidi pieno di nutrienti e grassi di queste diete sono state descritte in precedenza ^14. Le diete olio di soia sono ricchi di acido linoleico (18:02 n-6) e contengono alcuni acido α-linolenico (18:03 n-3) mentre la dieta olio di lino è ricco di acido α-linolenico. Queste diete ad alto contenuto di grassi rappresentano diverse razioni di linoleico di α-linolenico acidi (razioni di 08:01 e 01:01, rispettivamente). Il metodo per l'isolamento delle singole classi di lipidi e analisi mediante GC siamo noill stabilito e convalidato, ed è stato pubblicato in precedenza ^10, ma senza la descrizione tecnica dettagliata trovata qui.

Protocollo

1. Procedure di animali

1. Tutti i lavori degli animali deve essere effettuata in conformità con le Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986).
2. Mate ratti Wistar di età compresa tra 10 settimane da allevamento monogama, e confermare la gravidanza dalla comparsa di un tappo vaginale. Registrare questo come il giorno 1 di gestazione, e di iniziare la dieta sperimentale. Per le femmine vergini, ospitare ogni ratto individualmente, e iniziare la dieta sperimentale.
3. Dopo l'alimentazione diete sperimentali per 20 giorni euthanize ratti di CO ₂ asfissia seguita da dislocazione cervicale.
4. Utilizzare pinze e forbici dissezione per esporre la cavità addominale e asportare il fegato tagliando i legamenti, che collegano il fegato al diaframma, parete anteriore dell'addome, dello stomaco e del duodeno. Lavare il fegato in PBS e congelare in azoto liquido prima della conservazione a -80 ° C.

2. Preparazione di un estratto lipidico totale ⁹

1. Aggiungi moleculsetacci AR (per riempire 1/10 del contenitore di solvente) a tutti i solventi per creare solventi 'a secco'. Eseguire tutti i lavori di solvente all'interno di una cappa aspirante.
2. Tagliare circa 100 mg di fegato congelato e pesare. Collocare il tessuto in un tubo in un secchio di ghiaccio ed aggiungere 0,8 ml di ghiaccio freddo 0,9% NaCl. Omogeneizzare il tessuto.
3. Aggiungere standard interni disciolti in 1 ml / mg di cloroformio secco: metanolo (2:1, v / v) contenente idrossitoluene butilato (BHT; 50 mg / l) come antiossidante. Per 100 mg di fegato di ratto aggiungono 100 mg di campione del CE (Cholesteryl heptadecanoate 17:00). Attenzione: Cloroformio e BHT sono pericolosi.
4. Aggiungere 5,0 ml di cloroformio: metanolo secco (2:1, v / v) contenente BHT (50 mg / L).
5. Aggiungere 1,0 ml di 1 M NaCl, mescolare accuratamente nel vortex fino a quando la miscela appare uniforme. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana.
6. Centrifugare a 1000 xg per 10 min, bassa freno a temperatura ambiente.
7. Raccogliere più bassofase utilizzando Pasteur vetro pipetta, trasferire al nuovo tubo di vetro tappo a vite e secco sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana.

3. Separazione delle classi di lipidi mediante estrazione in fase solida (SPE) ¹⁰

1. Collegare il serbatoio SPE ad una pompa da vuoto e posizionare aminopropyl cartuccia SPE silice sul serbatoio.
2. Posizionare nuovo tubo di vetro con tappo a vite TAG etichettati e CE nel rack serbatoio sotto la colonna di raccogliere prima frazione.
3. Sciogliere l'estratto totale di lipidi in 1,0 ml di cloroformio secco e vortex.
4. Applicare il campione alla colonna con una pipetta Pasteur di vetro e far gocciolare attraverso la colonna tappo a vite per gravità. Quando ulteriori gocce cadono, rimuovere il liquido residuo sotto vuoto.
5. Eluire la frazione TAG e CE sotto vuoto, lavare la colonna con 2 x 1,0 ml di cloroformio lavaggi a secco.
6. Quando viene rimosso tutto il liquido, asciugare il TAG e CE frazionamenton sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana.
7. Posizionare nuovo tappo a vite tubo di vetro PC etichettata nel cassetto serbatoio sotto la colonna.
8. Eluire la frazione PC sotto vuoto con l'aggiunta di 2 x 1,0 ml di cloroformio secco: metanolo (60:40, v / v) fino a quando tutto il liquido viene rimosso dalla colonna.
9. Rimuovere e frazione PC secco sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana.
10. Collocare un nuovo tappo a vite tubo di vetro PE etichettato nel vassoio serbatoio ed eluire frazione PE con l'aggiunta di 1,0 ml di metanolo secco sotto vuoto.
11. Rimuovere e frazione PE secco sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana.
12. Posizionare nuovo tubo di vetro con tappo a vite etichettata NEFA nel vassoio serbatoio ed eluire frazione NEFA sotto vuoto con l'aggiunta di 2 x 1,0 ml di cloroformio lavaggi a secco: metanolo: acido acetico glaciale. (100:2:2, v / v / v) Attenzione: acido acetico glaciale è pericoloso.
13. Rimuovere frazione NEFA raccolta e secco sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana.
14. Inserire una nuova cartuccia SPE amminopropil silice sul serbatoio SPE e posizionare un tubo di vetro con tappo a vite nel cassetto serbatoio sotto la cartuccia per la raccolta dei rifiuti.
15. Lavare la colonna con 3 lavaggi di esano secco sotto vuoto e poi un lavaggio 1,0 ml finale gravità. Non lasciare la cartuccia a diventare secca (girare i canali colonna a cartuccia in posizione di chiusura quando il livello esano è vicino alla matrice cartuccia) Attenzione. Esano è pericolosa.
16. Sostituire il tubo di scarico con il tubo nuovo vetro con tappo a vite marcato CE.
17. Sciogliere il TAG e CE frazione secca (preparato nella fase 3.6) in 1,0 ml di esano secco e vortex. Applicare questo alla colonna con una pipetta Pasteur di vetro e lasciare gocciolare attraverso sotto gravity.
18. Quando ulteriori gocce cadono, rimuovere il liquido residuo sotto vuoto.
19. Sotto vuoto, lavare la colonna con 2 x 1,0 ml di esano lavaggi a secco per eluire CE e frazione raccolta secco sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana.
20. Posizionare nuovo tubo di vetro con tappo a vite TAG marcato nel cassetto serbatoio ed eluire TAG con l'aggiunta di 2 x 1,0 ml di esano lavaggi a secco: metanolo: acetato di etile (100:5:5) sotto vuoto.
21. Lavaggio frazione raccolta sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana. Attenzione: acetato di etile è pericoloso.

4. Preparazione di FAME da CE ¹⁰

1. Aggiungere 0,5 ml di toluene secca alla frazione CE separati (raccolti nella fase 3.19) e vortex. Attenzione: Il toluene è pericoloso.
2. Preparare reagente di metilazione (metanolo secco con 2% (v/ V) H ₂ SO _4), di cui 1,0 ml è richiesto per campione. Dispensare volume di metanolo asciutto in contenitore di vetro o di plastica adatti con coperchio e aggiungere la quantità di H ₂ SO ₄ gocce necessaria quindi mescolare per inversione. Attenzione: L'acido solforico è pericoloso.
3. Aggiungere 1,0 ml di reattivo metilante ai campioni disciolti in toluene asciutto, tappare i tubi in modo sicuro, e mescolare delicatamente.
4. Riscaldare i campioni per 2 ore a 50 ° C.
5. Dopo 2 ore togliere i tubi dal fuoco. Una volta freddo aggiungere 1,0 ml di soluzione neutralizzante (0,25 M KHCO ₃ 0.5MK ₂ CO _3). Attenzione: bicarbonato di potassio e carbonato di potassio sono pericolosi.
6. Aggiungere 1,0 ml di esano asciutto e vortex.
7. Centrifugare a 250 xg per 2 minuti, bassa freno a temperatura ambiente.
8. Raccogliere fase superiore, che contiene il FAME, e trasferire in un nuovo tappo a vite tubo non monouso in vetro.
9. Asciugare il FAME raccolti sottoazoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana.

5. La rimozione del colesterolo libero contaminazione da CE FAME ¹⁴

(Colesterolo libero può contaminare il campione, si veda la Figura 1 per tracce esempio cromatografo con e senza rimozione del colesterolo libero).

1. Posizionare un tubo di scarico nel serbatoio SPE e inserire una cartuccia SPE gel di silice sul serbatoio.
2. Lavare colonna con 3 x 1 ml di esano lavaggi a secco sotto vuoto e 1 x 1 ml sotto gravità.
3. Rimuovere lavaggi rifiuti e aggiungere nuovo tubo di scarico nel serbatoio.
4. Sciogliere FAME CE in 1 ml di esano asciutto, vortice.
5. Applicare alla colonna con una pipetta Pasteur di vetro e far gocciolare attraverso gravità.
6. Lavare colonna con 3 x 1 ml di esano lavaggi sotto vuoto.
7. Rimuovere lavaggi rifiuti e collocare nuovi tubi non tappo a vite nel serbatoio del marchio CE FAME.
8. Eluire l'FAME CE con 2 x 1 ml di esano a secco: etere etilico (95:5 v / v) lavaggi.
9. Essiccare sotto azoto a 40 ° C. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di una settimana. Attenzione: Etere etilico è pericoloso.

6. Trasferimento di FAME in GC Auto Sampler Vial

1. Aggiungere 75 ml di esano a secco a campione, vortice, e trasferire ad un campione di GC auto fiala.
2. Aggiungere un ulteriore 75 esano microlitri secca a campione, vortice e trasferire alla stessa GC campione auto fiala. I campioni possono essere ricoperti e conservati a -20 ° C in questa fase, per un massimo di un mese.

7. Analisi di Utilizzo del gascromatografo ¹⁴

1. Analizzare FAME su un gascromatografo. Esempio istituito: 30 mx 0,25 micron x 0,25 millimetri BPX-70 silice fusa colonna capillare con protocollo temperatura:
   Temperatura iniziale 115 ° C, premuto 2 min, rampa 10 ° C / min a 200 ° C, tenere 18.5 min, rampa 60 ° C / min a 245 ° C, hvecchio 4 min.
   Colonna: gas elio, portata 1.0, 14.6 pressione e velocità 29.
   Injector Temperatura = 300 ° C.
   Rivelatore: flusso di idrogeno 40.0, aria flusso 184.0, make up elio gas, portata 45,0, temperatura = 300 ° C.
2. Imposta rapporto di divisione a seconda dei casi (ad esempio 25:1 per l'analisi FAME CE).
3. Determinare l'area sotto ciascun picco utilizzando il software appropriato e identificare FAME rispetto agli standard. Vedere la Figura 2 per esempio i cromatogrammi.
4. Utilizzare l'area sotto i dati di picco per calcolare il contributo dei singoli acidi grassi come percentuale di acidi grassi totali.
5. Calcolare le concentrazioni assolute di acidi grassi dividendo l'area dello standard interno per l'importo aggiunto. Dividere l'area di ciascun acido grasso da questo risultato avere concentrazioni assolute di ciascun acido grasso entro la quantità di tessuto utilizzato.

Risultati

Il successo di questo metodo dipende seguendo il protocollo preciso e sull'utilizzo di solventi puliti e reagenti per ridurre 'rumore' e contaminazione che può apparire su un cromatogramma. Campioni contaminati sono più difficili da analizzare, abbassando la precisione dell'area sotto i calcoli della curva. Se il protocollo è seguito con successo un cromatogramma con chiare simmetriche, picchi ben definiti e con il minimo rumore di fondo dovrebbe essere ottenuto come illustrato nella Figura 3....

Discussione

Gascromatografia è una tecnica accurata da utilizzare per l'analisi degli acidi grassi, e la sua elevata riproducibilità ritenga tecnica adatta per analisi cliniche. Colonne GC appropriate devono essere utilizzati per consentire l'identificazione di acidi grassi di interesse, con colonne disponibili avere variazioni nella polarità della fase stazionaria, lunghezza della colonna e il diametro interno. L'uso di una colonna capillare di silice fusa in questo metodo di analisi fornisce una buona stabilità te...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methanol	Fisher Scientific	M/4056/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Chloroform	Fisher Scientific	C/4966/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
BHT	Sigma- Aldrich	W218405	'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous
NaCl	Sigma- Aldrich	S9888	Anhydrous
Hexane	Fisher Scientific	H/0406/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Glacial acetic acid	Sigma- Aldrich	695084	'CAUTION' Burns - 99.85%
Sulfuric acid	Sigma- Aldrich	339741	'CAUTION' Burns - 99.999%
Potassium carbonate	Sigma- Aldrich	209619	99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate	Sigma- Aldrich	237205	99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate	Fisher Scientific	10204340	'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied
Toluene	Fisher Scientific	T/2300/15	'CAUTION' Fumes
Diethyl ether	Sigma- Aldrich	309966	'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder	BOC	44-w	'CAUTION' Compressed gas - explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges	Agilent	12102014	Cartridge - Bead mass 100 mg
Silica gel SPE cartidges	Agilent	14102010	Cartridge - Bead mass 100 mg
Molecular seives	Sigma- Aldrich	334324	Pellets, AW-300, 1.6 mm
Glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	FB50251