Monitoreo Funcionalidad y Morfología de Vasculatura Reclutado por factores secretados por las células tumorales generadoras de crecimiento rápido

Resumen

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Resumen

El ensayo de tapón de matrigel subcutánea en ratones es un método de elección para la evaluación in vivo de los factores pro- y anti-angiogénicos. En este método, los factores deseados se introducen en gel-ECM sinóptico frío líquido que, después de la inyección subcutánea, se solidifica para formar un entorno que imita el entorno cáncer. Esta matriz permite la penetración de las células huésped, tales como células endoteliales, y por lo tanto, la formación de la vasculatura.

En este documento se propone un nuevo ensayo de tapón de matrigel modificado, que puede ser explotada para ilustrar el potencial angiogénico de un grupo de factores secretados por las células de cáncer, a diferencia de un factor específico (por ejemplo, bFGF y VEGF) o agente. El tapón que contiene gel ECM imitador se utiliza para introducir el anfitrión (es decir, el ratón) con un grupo de factores secretados a la CM de células de glioblastoma tumorales generadoras de crecimiento rápido. Hemos descrito previamente una extensa comparación del potencial angiogénico deU-87 MG glioblastoma humano y su clon derivado latente, en este modelo de sistema, que muestra la angiogénesis inducida en las células U-87 MG parentales. El CM se prepara mediante el filtrado de los medios recogidos a partir de placas de cultivo confluente de cualquiera de las líneas de células después de la incubación de 48 horas. Por lo tanto, sólo contiene factores secretados por las células, sin las propias células. Describe aquí es la combinación de dos modalidades de imagen, las microburbujas de imágenes por ultrasonido de contraste mejorado y intravital endomicroscopía con fibras confocal, para una precisa, la caracterización en tiempo real de la medida, la morfología y la funcionalidad de los vasos sanguíneos recién formados dentro de los tapones.

Introducción

El ensayo de angiogénesis enchufe matrigel fue descrita por primera vez por Kibbey et al., En 1992, donde fue utilizado para evaluar la estimulación de la angiogénesis por el SIKVAV péptido (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) ^1. En contraste con otros ensayos de angiogénesis in vivo, como el ratón angiogénesis corneal o ensayos de membrana corioalantoidea de pollo, este ensayo es relativamente fácil de realizar ^2. El gel-ECM mímica inyectado puede contener células, pro-angiogénico o un compuestos y / o factores anti-angiogénicos. Al evaluar la actividad de un compuesto anti-angiogénico, el tapón normalmente contiene una mezcla de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), y la sustancia anti-angiogénico se puede administrar directamente en el enchufe o sistémicamente ^{3, 4.}

El gel-ECM sinóptico se inyecta por vía subcutánea donde se solidifica dentro de minutos. Evaluación de reclutamiento de vasos sanguíneos en el tapón resultante es typically realizado mediante la medición de los niveles de hemoglobina dentro del tapón, por medición de la señal de fluorescencia después de la inyección de isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con dextrano, por inmunotinción de secciones histológicas para marcadores endoteliales específica o por células activadas por fluorescencia (FACS) ^{2,5, 6.} Sin embargo, esta evaluación sólo permite el análisis de punto final y carece de información acerca de la funcionalidad y la morfología de los vasos sanguíneos. Además, las mediciones de volumen de plasma, ya sea por niveles de hemoglobina o mediante el uso de dextrano-FITC como un indicador, puede ser engañosa ya que el contenido de la sangre se ve afectada por el tamaño de los vasos sanguíneos y el grado de charcos estancados de sangre. Esto es especialmente crucial cuando la vasculatura reclutado se caracteriza por la permeabilidad mejorada y retención (EPR) efecto ^7.

Nos proponemos en el presente documento un nuevo más precisa, el método para la visualización de los vasos sanguíneos reclutados por la combinación de dos modalidades de imágenes complementarias. High microburbujas resolución mejorada de ultrasonido-contraste (Estados Unidos) combinado con intravital fibred-confocal endomicroscopía puede proporcionar información no sólo acerca de la densidad de los vasos sanguíneos, sino también en su morfología y funcionalidad. Además, este análisis se puede realizar en varios puntos de tiempo permitiendo así el seguimiento de la cinética de la angiogénesis. Estados Unidos es una técnica de imagen utilizada ampliamente que posee una alta resolución espacial de los vasos sanguíneos de imagen siguiente intravenosa (iv) la inyección de microburbujas que permanecen exclusivamente en el compartimento vascular ^8-11. Las microburbujas son microburbujas llenas de gas que producen una señal ecogénica fuerte cuando se excita con un pulso de Estados Unidos y por lo tanto servir como un buen agente de contraste. Imágenes 3D del tapón se adquieren mediante el software de sistema de imagen de Estados Unidos después de microburbujas destrucción. Las imágenes resultantes se componen de cuadros de imágenes de antes y después de la destrucción de microburbujas y reflejan la diferencia en la intensidad de vídeo en color. Estos superpuestolas imágenes se muestran de forma automática por el software. En consecuencia, el porcentaje de vasos funcionales dentro de la clavija puede ser cuantificada. Alta resolución Fibered endomicroscopía confocal sirve como modalidad de imagen complementaria al informar sobre los vasos sanguíneos morfología. En este método mínimamente invasivo, las imágenes se adquieren después de la administración iv de dextrano conjugado con FITC ^12. El polímero fluorescente tiñe el torrente sanguíneo y por lo tanto sirve como un "agente de contraste" para los vasos sanguíneos morfología y el flujo sanguíneo. Además, dado que el polímero inyectado es en un tamaño de 70 KDa, sólo puede atravesar los vasos con fugas como se encuentra en la vasculatura del tumor. Esto resultará en alto fondo de la dextrano marcado con FITC fuera de los vasos sanguíneos. En consecuencia, endomicroscopía confocal fibrado se puede utilizar para visualizar características típicas del efecto EPR en el tumor neovasculature- agrandados, los vasos que gotean, altamente enmarañadas-, con extremos romos.

Este modelo del sistema se descricama en la comparación del potencial angiogénico de U-87 MG glioblastoma humano y su clon inactivo ^13. Vascularización dentro de los tapones se evaluó tres semanas después de la inoculación gel-ECM sinóptico. Se demostró que la vascularización dentro de tapones que contienen CM de U-87 MG de rápido crecimiento de células tumorales de generación se incrementó significativamente en términos de número, la densidad y la funcionalidad, en comparación con la vascularización dentro de los tapones que contienen CM de las células tumorales de generación latentes. Por lo tanto, los autores fueron capaces de concluir que CM aislado de U-87 MG de rápido crecimiento de células tumorales de generación contiene niveles más altos de factores pro-angiogénicos, en comparación con la CM a partir de células tumorales de generación latentes. Estos factores estimulan la formación de vasos sanguíneos funcionales al afectar positivamente todos los pasos de la cascada angiogénica (es decir, la proliferación, la brotación, la migración y, finalmente, la formación de estructuras tubulares de las células endoteliales).

Protocolo

NOTA: fueron aprobados y realizados en el cumplimiento de las normas de Tel Aviv Universidad Escuela de Medicina Sackler Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) Todos los animales procedimientos.

1. acondicionado Preparación de Medios

1. Seed 2 x 10 ⁶ U-87 células mg en una placa de cultivo de 10 cm en un volumen de 8 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y solución de penicilina / estreptomicina / nistatina 1%.
2. Se incuban las células a 37 ° C; 5% de CO ₂ hasta alcanzar la plena confluencia en 48 horas.
3. Con una jeringa de 10 ml, retirar todo el medio del plato y filtrar a través de un filtro de 0,45 micras en un tubo de 15 ml.
4. Sin lavar la placa de células, añadir 1 ml de solución de tripsina (0,25%) y se incuba.
5. Cuando se separan todas las células, inactivar la tripsina usando al menos 5 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y preformar un recuento de células.
> Contar el número de células utilizando un hemocitómetro u otro dispositivo de recuento celular y calcular el número de células de acuerdo con el método de recuento utilizado.
NOTA: se utilizará más adelante con el fin de normalizar la concentración de CM.
6. Transferir el CM a un matraz de fondo redondo de vidrio y se concentra al rotavapor de alto vacío. Con el fin de acelerar el proceso, aumentar la temperatura del baño a 37 ° C, si se desea. Continúe hasta que el CM logra una textura pastosa.
7. Resuspender el CM de cada placa de cultivo de 400 l de solución salina. Cuando se utiliza más de una placa, utilice volumen equivalente. Por ejemplo, para 2 placas de cultivo, utilice 800 l. Use cada placa de 4 ratones.
8. Con el fin de comparar las diferentes líneas celulares o tratamientos, ajustar el volumen de acuerdo con la relación de célula recibida en el paso 1.6. Por ejemplo, si una placa contiene 1.5x más células, añadir 200 l de solución salina a los 400 l pre-existentes. Este será el CM ajustado

title "> 2. ECM-mímica Gel Plug inoculación en ratones

1. Antes de inocular el gel-ECM mímica en ratones, prepare los siguientes materiales:
   1. Factores de crecimiento reducidas gel ECM imitador-fenol libre (descongelar durante la noche, un día antes del experimento, a 4 ° C en hielo).
   2. Máquina de afeitar eléctrica.
   3. La ketamina y xilazina con el fin de anestesiar a los ratones.
   4. Helada 1.000 consejos l estériles.
   5. Helada jeringa de 1 ml y 27 g agujas.
2. Preparar para cada ratón un tubo Eppendorf de 1,5 ml contiene 80 l ajustados CM y mantener en hielo.
3. A cada tubo, añadir 600 mu l factores de crecimiento heladas reducido gel ECM imitador-fenol libre que se descongela la noche a 4 ° C, en hielo. El gel-ECM mimo es líquido en 4 ° C y se solidifica a la temperatura corporal; con el fin de evitar que el gel-ECM sinóptico se solidifique, utilizar heladas 1000 consejos mu l. Mezclar cuidadosamente los tubos sin formar burbujas y mantener en hielo.
4. Anestesiar 6 semanas de edad BALB / c ratones utilizando ketamina (100 mg / kg) y xilazina (12 mg / kg). Confirmar la anestesia adecuada de acuerdo al cuidado y uso de animales institucional comité, es decir, antes de comenzar el experimento. Los animales han llegado a su avión adecuado de anestesia cuando ya no responden a una pizca dedo del pie firme.
5. Afeitarse la zona abdominal de los ratones y desinfectar usando un exfoliante / alcohol quirúrgico.
6. Utilice un resfriado jeringa de 1 ml y una aguja de 27 G para inyectar el contenido del tubo de Eppendorf por vía subcutánea. Realizar la inyección muy lentamente para evitar la formación de burbujas. Una vez que se administra todo el volumen, no expulse la aguja durante varios minutos, hasta que se produce la solidificación.

3. Evaluación de ECM-mímica Gel Plug Vascularización Usando Ultrasonido

NOTA: Esta parte del protocolo requiere conocimientos previos de funcionamiento de un sistema de imágenes de ultrasonido, o la ayuda de un técnico autorizado.

1. Antes de empezar, tener la fmateriales e instrumentos listos ras:
   1. Máquina de afeitar eléctrica.
   2. Crema depilatoria.
   3. La ketamina y xilazina con el fin de anestesiar a los ratones.
   4. Microburbujas no específica.
   5. Dispositivo de activación.
   6. Sistema de imágenes de Estados Unidos, incluyendo una sonda de 708 MHz 55 y un micromanipulador adquisición 3D.
2. Medir la vascularización dentro de los tapones de tres semanas después de la inoculación:
   NOTA: En el modelo animal U-87 a base de MG, 3 semanas se encontraron para representar el punto de tiempo ideal para formación de imágenes. Bajo diferentes configuraciones, calibre cinética de vascularización a partir de unos pocos días después de la inoculación de los tapones.
   1. Anestesiar a los ratones utilizando ketamina (100 mg / kg) y xilazina (12 mg / kg). Confirmar la anestesia adecuada de acuerdo al cuidado y uso de animales institucional comité, es decir, antes de comenzar el experimento. Los animales han llegado a su avión adecuado de anestesia cuando ya no responden a una pizca dedo del pie firme.
   2. Afeitarse lazona abdominal de los ratones y tratar con crema depilatoria.
   3. Fijar los ratones supina en el escenario de la micro-manipulador.
   4. Utilizando una solución salina que contiene 1 ml de la jeringa y una aguja de 30 G, colocar la aguja dentro de la vena de la cola, fijar firmemente la aguja y aflojar la jeringa.
   5. La configuración de la sesión de adquisición de imágenes en modo 3D Contraste:
      1. Pulse el botón "3D" para inicializar la etapa motor 3D y colocar el transductor en el medio del área de escaneado deseada.
      2. Pulse el botón "3D" y la entrada de la distancia y el paso de tamaño de digitalización, a continuación, pulse "Scan".
      3. Asegúrese de que todo el tapón fue escaneada en los datos de imagen en 3D que se muestran. Si no, ajuste el transductor de forma que todo el tapón es visible en la exploración y repita el paso 3.5.2.
      4. Presione "Contraste" y empujar la compensación de ganancia de tiempo (TGC) controla a la izquierda para oscurecer la imagen.
   6. Activar las microburbujas utilizando un mezclador vial que es designated para la activación de microburbujas durante 45 segundos.
   7. Mezclar en un 1 ml jeringa de 50 l de microburbujas con 50 l de solución salina.
   8. Vuelva a colocar la jeringa aflojado contiene solución salina con una jeringa que contiene microburbujas activados. Inyectar las microburbujas diluidas en la vena de la cola de los ratones, espere unos segundos para que las burbujas de alcanzar un estado de equilibrio, y luego adquirir cine loop con contraste 3D del tapón, usando el motor de cámara 3D:
      1. Pulse el botón "3D" y seleccione "Scan" para adquirir imágenes de realce 3D y pulse "Cine tienda" para guardar los datos de imagen.
      2. Pulse el botón "3D" y haga clic en "Destroy 3D" para destruir las microburbujas.
      3. Pulse el botón "3D" de nuevo y seleccione "Scan" para adquirir un bucle de cine post-destrucción, a continuación, pulse "Cine tienda".
   9. Generar la superposición de tramas de imágenes anteriores y posteriores a la destrucción de microburbujas:
      1. En el y# 8220; Configuración de referencia "en el lado izquierdo de la pantalla, haga clic en" Crear de referencia ".
      2. Pulse el botón "Gestión de Estudio" para abrir el bucle de cine antes de la destrucción adquirida.
      3. Haga clic en "Cine de proceso" para generar el contraste de la superposición verde y, a continuación, haga clic en "Cargar en 3D".
   10. Utilice el software de imagen de Estados Unidos con el fin de cuantificar la imagen 3D resultante de volumen de sangre dentro de los tapones:
       1. Pulse el botón "Scan / Freeze" y luego presionar "ajustes del modo".
       2. Haga clic en "Volumen" y seleccione "Paralelo".
       3. Crear un volumen 3D del tejido diana mediante la segmentación de una serie de contornos.
       4. Haga clic en "Finalizar" para completar la segmentación.
          NOTA: El volumen del agente de contraste se mostrará en la parte inferior izquierda de la pantalla.
   11. Al final del procedimiento, coloque los ratones en un ambiente cálido, seco y limpio, tranquilo, lejos deotros animales. Proporcionar calor utilizando una almohadilla disponible comercialmente quirúrgica de calefacción o de una lámpara incandescente (50-75 vatios), colocado 12-14 pulgadas de distancia de los roedores. Monitorear ratones continuamente hasta mantener una postura erguida y caminar normalmente.

4. Evaluación de ECM-mímica Gel Plug Vasculatura Morfología El uso con fibras Confocal Endomicroscopía

NOTA: Esta parte del protocolo se realiza inmediatamente después de la imagen de Estados Unidos y requiere conocimiento previo de operar el sistema de formación de imágenes confocal fibrado endomicroscopía, o la ayuda de un técnico autorizado.

1. Antes de empezar, tiene los siguientes materiales e instrumentos listos:
   1. Equipo para cirugía como pinzas, tijeras e hilos de coser absorbibles.
   2. Dextrano conjugado con FITC (70 KDa).
   3. Soluciones de calibración (tres tubos de cada uno de peróxido de hidrógeno que contiene, agua o solución fluorescente).
   4. El sistema de imágenes y unasonda adecuada para obtener imágenes de los vasos sanguíneos según el fabricante.
2. Anestesiar a los ratones utilizando ketamina (100 mg / kg) y xilazina (12 mg / kg).
3. Administrar iv, a través de la vena de la cola, 200 l de 10 mg / dextrano marcado con FITC ml.
4. Desinfectar la zona abdominal usando un exfoliante / alcohol quirúrgico y aplicar una pequeña incisión de aproximadamente 1 cm desde el enchufe.
5. Coloque la sonda endomicroscopía en la parte superior de la clavija suavemente mientras se mantiene el tapón intacto.
6. Adquisición:
   1. Una vez que la sonda se encuentra en el tapón, presione "Start láser" utilizando el pedal. La fluorescencia se debe mostrar en la pantalla.
   2. Adquirir películas cortas (hasta 30 segundos) pulsando 'Record' en la pantalla o 'Seleccionar' usando el pedal.
   3. Entre las películas, lavar la sonda mediante la colocación de la punta en un tubo que contiene el agua.
   4. Cuando haya terminado, retire la sonda y limpie la punta con una punta de algodón.
7. Analizar ve mediadiámetro ssel:
   1. Haga clic en el icono de "Detectar microvasos" en el panel superior para abrir la ventana del módulo de detección de buques.
   2. Haga clic en "Preferencias" y marcar "el diámetro del vaso media" en la "Estadística de interés" y "Mostrar barras del histograma" en el "Modo de visualización".
   3. Haga clic en "Detectar" para mostrar las medidas seleccionadas.
8. Para analizar la intensidad de la señal fluorescente en las zonas adyacentes a los vasos sanguíneos:
   1. Haga clic en "Crear círculo ROI" en el panel izquierdo y crear un círculo en el área de interés.
   2. Haga clic en "Calcular histograma dentro de ROI" para calcular los valores relacionados con esta región.

Tratamiento 5. Post-procesal de ratones

1. Al final de cada procedimiento de imagen, coloque los ratones en un ambiente cálido, seco y limpio, tranquilo, lejos de otros animales. Proporcionar calor utilizando un comercialmente unalmohadilla térmica quirúrgica vailable o una lámpara incandescente (50-75 W), colocados en 12-14 lejos de los roedores. Monitorear ratones continuamente hasta mantener una postura erguida y caminar normalmente.
2. Para un análisis más detallado de la vascularización tapones 'en puntos de tiempo adicionales, se aplican las siguientes condiciones de recuperación:
   1. Suturar la incisión con suturas absorbibles.
   2. Dé analgesia ratones tales como buprenorfina (1 mg / kg) por vía subcutánea, y volver a jaulas individuales.
   3. Observe todos los animales para determinar si un tratamiento adicional analgésico es necesario y re-evaluar diariamente para monitorear y evaluar para el sufrimiento.
3. En el punto final del experimento, la eutanasia a los ratones por primera aplicación de isoflurano, seguido por dislocación cervical.
4. Si de imagen adicional se realizará en las semanas siguientes los pasos iniciales de imagen, todos los procedimientos deben ser lo más estéril posible. Un exfoliante de la piel quirúrgica debe ser realizada, wa estérilter y algodón estéril consejos deben ser utilizados para limpiar la sonda endomicroscopía, y la sonda se deben desinfectar después de cada animal utilizando agua estéril.

Resultados

La implantación de los tapones de gel ECM mímica con CM de rápido crecimiento línea de células tumorales generadoras angiogénico U-87 MG, se traduce en una amplia angiogénesis. Este vasculatura puede ser explorado extensamente utilizando dos métodos de imagen complementarios.

Las microburbujas con realce de contraste de formación de imágenes de Estados Unidos revela extensa reclutamiento de vasos sanguíneos funcionales en el enchufe ilustrando extensa flujo sanguíneo dentro de U-...

Discusión

Combinando métodos de imagen complementarios permite la adquisición de información sobre la densidad de microvasos, funcionalidad y morfología de los diferentes componentes de la angiogénesis. Cargando CM en los tapones de gel de ECM sinóptico genera un microambiente tumoral, que está separada de otras poblaciones de células, como las células endoteliales, que son reclutados y extravasación en el enchufe.

Mediante la realización, en paralelo, las microburbujas de contraste mejorad...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotary Vacuum Evaporator	-	-	-
Growth-factors reduced phenol-free Matrigel	BD Bioscience	FAL356231	Thaw overnight, at 4 °C on ice
Depilatory cream	-	-	-
Vevo2100 US imaging system	VisualSonics Inc.	-	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
55 MHz 708 probe	VisualSonics Inc.	-	-
Vevo2100 imaging software	VisualSonics Inc.	-	-
VialMix	DEFINITY Imaging	VMIX	-
DEFINITY microbubbles	DEFINITY Imaging	DE4	Activate for 45 sec using VialMix before use
CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)	Mauna Kea Technologies	-	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
ProFlex MiniO/30 probe	Mauna Kea Technologies	-	-
70 kD FITC-labeled dextran	Sigma-Aldrich	46945	-
ImageCell software	Mauna Kea Technologies	-	-
Calibration Kit	Mauna Kea Technologies	-	-
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco Life Tecchnologies	41965-039
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Penicillin/streptomycin/nystatin solution	Biological Industries	03-032-1B