Функция контроля и морфология сосудистой Завербован факторов, секретируемых быстрорастущих опухолевых генерирующих клеток

Резюме

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Аннотация

Подкожной матригель плагин анализ у мышей методом выбора для оценки в естественных условиях про- и анти-ангиогенных факторов. В этом способе желаемые факторы вводятся в холодной жидкости ECM-имитируют гель, который, после подкожной инъекции, затвердевает с образованием среды, имитирующего среду рака. Эта матрица позволяет проникновение клеток-хозяев, таких как эндотелиальные клетки, а следовательно, к образованию сосудистой.

В этом мы предлагаем новую модифицированную Матригель штекер анализа, которые могут быть использованы, чтобы проиллюстрировать ангиогенный потенциал пула факторов, секретируемых раковых клеток, в отличие от конкретного фактора (например, bFGF и VEGF) или агента. Вилка, содержащий ECM-мимические гель используется, чтобы ввести множество (т.е., мыши) с бассейном факторов, выделяемых на КМ быстрорастущих опухолей, генерирующих клеток глиобластомы. Ранее мы описали обширную сравнение ангиогенного потенциалаU-87 мг глиобластомы человека и его бездействующим, полученных клона, в этой системе модели, показывающий индуцированный ангиогенез в U-87 мг родительских клеток. CM готовится путем фильтрации, собранные СМИ из сливной культуры ткани пластин любой клеточной линии следующие 48 ч инкубации. Таким образом, он содержит только факторы, секретируемые клетками без самих клеток. Описанный здесь сочетание двух методов визуализации, микропузырьки контрастным усилением ультразвуковой визуализации и прижизненный расслаивается-конфокальной эндомикроскопии, для точного, в режиме реального времени характеристике степени, морфологии и функциональности новообразованных сосудов в пределах зажигания.

Введение

Матригель плагин ангиогенез анализ был впервые описан Kibbey и др. В 1992, где он был использован для оценки ангиогенеза стимуляцию пептидной SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) ^1. В отличие от других в естественных условиях ангиогенеза анализов, как мыши роговицы ангиогенеза или хорионалантоисной мембраны анализов, этот анализ относительно легко выполнить ^два. Вводят ECM-мимические Гель может содержать клетки, проангиогенных или антиангиогенные соединения и / или факторов. При оценке активности анти-ангиогенного соединения, вилка обычно содержит смесь фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста фибробластов (FGF), а анти-ангиогенный вещество может быть введено непосредственно в вилке или системно ^{3, 4.}

ЕСМ-имитируют гель инъецируют подкожно, где он затвердевает в течение нескольких минут. Оценка набора кровеносных сосудов в результате вилки typicallу выполняется путем измерения уровней гемоглобина в вилке, путем измерения сигнала флуоресценции после инъекции флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) меченных декстран, иммунным окрашиванием гистологических срезов для эндотелиальных-специфических маркеров или сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) ^{2,5, 6.} Тем не менее, эта оценка позволяет только анализ конечной точки и не содержит информации о функциональности и морфологии кровеносных сосудов. Кроме того, измерения объема плазмы, либо уровня гемоглобина или с помощью декстран-FITC в качестве индикатора, может ввести в заблуждение, так как содержание в крови зависит от размера кровеносных сосудов и степени застойных лужах крови. Это особенно важно, когда на работу сосудистой характеризуется повышенной проницаемости и удерживания (EPR) эффекта ^7.

Здесь мы предлагаем новый, более точный, метод визуализации, набранных кровеносных сосудов путем объединения двух взаимодополняющих методов визуализации. Higч разрешения микропузырьки с контрастным усилением ультразвуковое исследование (США) в сочетании с прижизненной расслоенной-конфокальной эндомикроскопии может предоставить информацию не только о плотности кровеносных сосудов, но и на их морфологии и функциональности. Кроме того, этот анализ может быть выполнен в нескольких временных точках, таким образом, позволяя мониторинг кинетики ангиогенеза. США является широко используемым изображений модальности, который обладает высоким пространственным разрешением для визуализации кровеносных сосудов после внутривенного (IV) введения микропузырьков, которые остаются исключительно в сосудистой отсеке ^8-11. Микропузырьки газонаполненные микропузырьки, которые производят сильное эхогенный сигнал при возбуждении импульсом США и, таким образом, служат хорошим контрастным веществом. 3D-изображения штекера приобретаются с помощью системы визуализации США ПО следующую уничтожения микропузырьков. Полученные изображения состоят из кадров изображения пред- и пост-разрушения микропузырьков и отражают разницу в интенсивности видео в цвете. Они перекрытыизображения автоматически отображаются с помощью программного обеспечения. Следовательно, процентов функциональных судов, находящихся в вилки может быть количественно. Высокое разрешение расслаивается конфокальной эндомикроскопии служит в качестве дополнения метода визуализации, сообщая о кровеносные сосуды морфологии. В этом минимально инвазивных методов, изображения получены следующие внутривенного введения FITC-конъюгированного декстрана ^12. Флуоресцентный полимер окрашивает кровь и, таким образом, выступает в качестве "контрастного вещества» для кровеносных сосудов морфологии и кровотока. Кроме того, поскольку полимер является вводили в размере 70 кДа, он может только пересекают незакрытой таре, которые содержатся в сосудистой сети опухоли. Это приведет к высокой фоне с FITC-меченого декстрана вне сосудов. Следовательно, расслаивается конфокальной эндомикроскопии может быть использован для визуализации типичные характеристики эффекта ЭПР в опухоли neovasculature- увеличена, протекающие, очень запутанную сосуды, с тупыми концами.

Эта модель система descriкровать в сравнении ангиогенеза потенциала U-87 MG глиобластомы человека и его покоя клона ^13. Васкуляризация в пробках оценивали три недели после ECM-мимические гель прививки. Было показано, что васкуляризация в заглушками, содержащих см от U-87 MG быстро растущая опухоль, генерирующих клетки была значительно увеличена с точки зрения количества, плотности и функциональности, по сравнению с васкуляризации в заглушками, содержащих см от спящих опухолевых генерирующих клеток. Таким образом, авторы смогли сделать вывод, что СМ, выделенный из U-87 мг быстрорастущих опухолевых клеток, генерирующих содержит более высокие уровни про-ангиогенных факторов, по сравнению с КМ от неактивных опухолевых клеток, генерирующих. Эти факторы стимулируют формирование функциональных кровеносных сосудов положительно влияет на все этапы ангиогенеза каскада (т.е., пролиферации, прорастания, миграции и наконец, формирование трубчатых структур эндотелиальных клеток).

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были одобрены и выполнены в соответствии со стандартами Тель-Авивского университета факультета Саклер Институциональные животных уходу и использованию комитета (IACUC).

1. кондиционером Подготовка СМИ

1. Семена 2 × 10 ⁶ U-87 мг клеток в 10 см культурального планшета в объеме 8 мл среды Игла в модификации Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% -ного раствора pencillin / стрептомицина / нистатина.
2. Инкубируйте клетки при 37 ° C; 5% CO ₂ до достижения полного слияния в 48 ч.
3. Использование 10 мл шприц, вывести все среды из пластины и фильтруют через фильтр 0,45 мкм в 15 мл пробирку.
4. Без промывания планшета клеток, добавить 1 мл раствора трипсина (0,25%) и инкубировать.
5. Когда все клетки отделяют, инактивации трипсина с использованием по меньшей мере, 5 мл DMEM с добавлением 10% FBS и заготовки подсчет клеток.
> Подсчитайте число клеток с помощью гемоцитометра или другие клетки-счетное устройство и подсчитать количество клеток в соответствии с методом подсчета, используемой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Он будет использоваться позже для того, чтобы нормализовать концентрацию УК.
6. Передача см до стеклянной круглодонную колбу и концентрируют под высоким вакуумом на роторном испарителе. Для того, чтобы ускорить процесс, повысить температуру ванны до 37 ° С, если это необходимо. Продолжайте, пока не достигнет СМ пастообразную консистенцию.
7. Ресуспендируют см друг от пластины культуры в 400 мкл физиологического раствора. При использовании более одной пластины, используйте эквивалентный объем. Например, в течение 2 культуральных планшетах, использовать 800 мкл. Используйте каждую пластину для 4 мышей.
8. Для того чтобы сравнить различные клеточные линии или процедуры, регулировки громкости в зависимости от соотношения клеток, полученной на стадии 1.6. Например, если одна пластина содержит в 1,5 раза больше клеток, добавить 200 мл физиологического раствора в уже существующих 400 мкл. Это будет регулировать CM

Название "> 2. ECM-мимические Гель Подключите Прививка мышам

1. Перед инокуляции ECM-мимические гель в мышей, подготовить следующие материалы:
   1. РОСТ-факторы уменьшается фенолов в ECM-мимические гель (растопить на ночь, за день до эксперимента, при 4 ° С на льду).
   2. Электробритва.
   3. Кетамин и ксилазина, чтобы анестезию мыши.
   4. Ледяной 1000 мкл стерильные наконечники.
   5. Ледяной 1 мл шприц и 27 г иглы.
2. Подготовка к каждой мыши в 1,5 мл Eppendorf трубки, содержащей 80 мкл скорректированные CM и держать на льду.
3. В каждую пробирку добавить 600 мкл ледяного роста факторы снижение фенолов в ECM-мимические гель, который оттаивали в течение ночи при 4 ° С, на льду. ЕСМ-имитируют гель жидкость в 4 ° С и затвердевает при температуре тела; для того, чтобы предотвратить ECM-мимические гель затвердевание, используйте ледяные 1000 советы мкл. Смешайте трубки тщательно, без образования пузырей и держать на льду.
4. Обезболить 6 неделя старый BALB / с мышей с использованием кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (12 мг / кг). Подтвердите надлежащего анестезии в соответствии с институциональной уходу и использованию животных комитета, то есть до начала эксперимента. Животные достигли надлежащего самолет анестезии, когда они больше не реагируют на твердой ног крайнем случае.
5. Бритье брюшной области мышей и дезинфицировать с помощью хирургического скраб / алкоголь.
6. Использование холодной 1 мл шприц и иглу 27 G, чтобы ввести содержимое трубки Эппендорфа подкожно. Выполните инъекции очень медленно, чтобы предотвратить образование пузырьков. После того, как весь объем вводят, не извлекайте иглу в течение нескольких минут, пока затвердевания не происходит.

3. Оценка ECM-мимические Гель Подключите Васкуляризация с помощью ультразвука

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола требует предварительного знания операционной системы ультразвуковое или помощь авторизованного специалиста.

1. Перед началом имеют Following материалы и инструменты готовы,
   1. Электробритва.
   2. Крем для депиляции.
   3. Кетамин и ксилазина, чтобы анестезию мыши.
   4. Нецелевой микропузырьков.
   5. Активация устройства.
   6. Система визуализации США, включая 55 МГц 708 зонда и 3D микроманипулятором приобретения.
2. Измерьте васкуляризации в пробках три недели после прививки:
   Примечание: В MG основе животной модели U-87, 3 недели было обнаружено, представляют собой идеальную точку времени для визуализации. При разных настройках, калибровки васкуляризации кинетики, начиная от нескольких дней после прививки зажигания.
   1. Обезболить мышей с помощью кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (12 мг / кг). Подтвердите надлежащего анестезии в соответствии с институциональной уходу и использованию животных комитета, то есть до начала эксперимента. Животные достигли надлежащего самолет анестезии, когда они больше не реагируют на твердой ног крайнем случае.
   2. Бритьебрюшной области мышей и обработать для удаления волос крем.
   3. Fix мышей безвольно на сцене микро-манипулятором.
   4. Использование 1 мл шприц, содержащий солевой раствор и 30 G иглу, поместить иглу внутри хвостовой вены, закрепить иглу надежно и ослабить шприц.
   5. Настройка для сессии Контраст 3D-режим захвата изображений:
      1. Пресс "3D", чтобы инициализировать этап 3D двигателя и поместить преобразователь в середине желаемой области сканирования.
      2. Нажмите "3D" и введите сканирования расстояния и размер шага, затем нажмите "Scan".
      3. Убедитесь, что вся пробка была отсканирована в данных изображения 3D отображаются. Если нет, отрегулируйте датчик так, чтобы вся пробка видна на этапе сканирования и повторите 3.5.2.
      4. Нажмите "Контраст" и нажать на компенсацию выигрыш во времени (ТГК) управляет слева, чтобы затемнить изображение.
   6. Активируйте микропузырьков с использованием флакон смеситель, который Дезиgnated для активации микропузырьков в течение 45 сек.
   7. Смешайте в 1 мл шприца 50 мкл микропузырьков с 50 мкл физиологического раствора.
   8. Заменить солевым содержащих разрыхленной шприц с шприц, содержащий активированные микропузырьков. Вводите разбавленные микропузырьков в хвостовую вену мышей, подождите несколько секунд, пока пузырьки, чтобы достичь устойчивого состояния, а затем приобрести 3D контрастным усилением кинопетли пробки, используя двигатель 3D приема:
      1. Нажмите "3D" и выберите "Scan", чтобы приобрести 3D с контрастированием изображения, а затем нажмите "Cine-магазин", чтобы сохранить данные изображения.
      2. Нажмите "3D" и нажмите "Уничтожить 3D" для уничтожения микропузырьков.
      3. Нажмите "3D" снова и выберите "Scan", чтобы приобрести кинопетли после уничтожения, а затем нажмите "Cine-магазин".
   9. Создать наложение кадров изображения до и после разрушения микропузырьков:
      1. В &# 8220; Ориентир Настройки "на левой стороне экрана нажмите кнопку" Создать ссылку ".
      2. Нажмите "Исследование управления", чтобы открыть перед уничтожения кинопетли приобретены.
      3. Нажмите кнопку "Process Cine", чтобы создать зеленый контраст наложения, затем нажмите кнопку "Загрузить в 3D".
   10. Используйте программное обеспечение визуализации США для того, чтобы количественного определения результате 3D изображение для объема крови в пробках:
       1. Нажмите "Scan / Стоп", а затем нажмите "настройки режима".
       2. Нажмите кнопку "Громкость" и выберите "Параллель".
       3. Создание 3D объем ткани-мишени путем сегментации серию контуров.
       4. Нажмите кнопку "Готово" для завершения сегментации.
          ПРИМЕЧАНИЕ: объем контрастного вещества будет отображаться в нижней левой части экрана.
   11. В конце процедуры, поместите мышей в теплой, чистой, сухой, тихой обстановке вдали отдругие животные. Обеспечить тепло, используя коммерчески доступный хирургического грелку или лампы накаливания (50-75 Вт), расположенный 12-14 см от грызунов. не Монитор мышей непрерывно, пока поддержание вертикальной позы и ходьбы нормально.

4. Оценка ECM-мимические Гель Подключите сосудистой Морфология Использование расслаивается конфокальной эндомикроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: эта часть протокола выполняется сразу же после УЗ изображения, и это требует предварительных знаний о работе с расслаивается конфокальной системы визуализации эндомикроскопии, или помощь авторизованного специалиста.

1. Перед началом следующие материалы и инструменты готовы:
   1. Хирургия инструменты, такие как щипцы, ножницы и рассасывающиеся швейных ниток.
   2. FITC-сопряженных декстрана (70 кДа).
   3. Калибровочные растворы (три пробирки каждый из которых содержит перекись водорода, воды или флуоресцентные раствора).
   4. Система визуализации изонд подходит для визуализации кровеносных сосудов в зависимости от производителя.
2. Обезболить мышей с помощью кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (12 мг / кг).
3. Администрирование IV, через хвостовую вену, 200 мкл 10 мг / мл FITC-меченого декстрана.
4. Дезинфекцию брюшной области с использованием хирургической скраб / спирт и применять небольшой разрез приблизительно 1 см от пробки.
5. Поместите эндомикроскопии зонд на верхней части плунжера аккуратно, сохраняя при этом штекер нетронутыми.
6. Приобретение:
   1. После того, как зонд установлен на вилке, нажмите кнопку "Начать лазер" с помощью ножной педали. Флуоресценции будет показано на экране.
   2. Приобретать короткометражных фильмов (до 30 сек) нажав на кнопку "Запись" на экране или "Выбрать", используя педаль.
   3. Между фильмов, мыть зонд помещая кончик в пробирку, содержащую воду.
   4. Когда закончите, удалите зонд и очистить наконечник с наконечником хлопка.
7. Для анализа средняя веSSEL диаметр:
   1. Нажмите на иконку "Detect микрососудов" в верхней панели, чтобы открыть окно модуля обнаружения судна.
   2. Нажмите кнопку "Настройки" и отметьте "Средний диаметр сосуда" в "Статистика интерес" и "Гистограмма баров" в меню "Display Mode".
   3. Нажмите "Detect" для отображения выбранных измерений.
8. Для анализа интенсивности флуоресцентного сигнала в районах, прилегающих кровеносных сосудов:
   1. Нажмите на кнопку "Создать круг ROI" в левой панели и создайте круг в интересующей области.
   2. Нажмите кнопку "Вычислить гистограмму в течение Roi» для вычисления значений, связанных с этой области.

5. постабортных Лечение мышей

1. В конце каждой процедуры визуализации, место мышей в теплой, чистой, сухой, тихой обстановке вдали от других животных. Обеспечить тепло, используя коммерчески-амодели шириной хирургическое грелку или лампа накаливания (50-75 Вт), расположенный 12-14 в от грызунов. не Монитор мышей непрерывно, пока поддержание вертикальной позы и ходьбы нормально.
2. Для дальнейшего анализа васкуляризации Вилки "в дополнительных временных точках, применяются следующие условия восстановления:
   1. Шовный небольшой разрез с помощью рассасывающиеся швы.
   2. Дайте мышей аналгезию, такие как бупренорфин (1 мг / кг) подкожно, и вернуться в индивидуальных клетках.
   3. Соблюдайте всех животных, чтобы определить, если дальнейшее обезболивающее лечение необходимо и по-новому оценить ежедневно отслеживать и оценивать дистресса.
3. В конечной точке эксперимента, эвтаназии мышей от первого, применяя изофлуран, а затем путем цервикальной дислокации.
4. Если дополнительная визуализация будет выполнена в течение нескольких недель после первоначальных шагов изображений, все процедуры должны быть максимально стерильной, насколько это возможно. Хирургическое скраб кожи должны быть выполнены, стерильный ватер и стерильной ватой советы должны быть использованы для очистки эндомикроскопии зонд, и датчик должны быть продезинфицированы между каждого животного, используя стерильную воду.

Результаты

Имплантация ECM-мимические пробки гель с см от быстро растущих кровеносных сосудов, линии опухоли генерации клеток U-87 MG, приводит к обширным ангиогенеза. Это сосудистая может быть широко изучены с помощью двух дополнительных методов визуализации.

Микропузырьки контраст...

Обсуждение

Сочетание взаимодополняющих методов визуализации позволяет приобретение информации о различных компонентах ангиогенеза »микрососудов плотности, функциональности и морфологии. Загрузка CM на ECM-мимические зажигания гель создает микросреду опухоли, которая отделена от других клеточ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotary Vacuum Evaporator	-	-	-
Growth-factors reduced phenol-free Matrigel	BD Bioscience	FAL356231	Thaw overnight, at 4 °C on ice
Depilatory cream	-	-	-
Vevo2100 US imaging system	VisualSonics Inc.	-	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
55 MHz 708 probe	VisualSonics Inc.	-	-
Vevo2100 imaging software	VisualSonics Inc.	-	-
VialMix	DEFINITY Imaging	VMIX	-
DEFINITY microbubbles	DEFINITY Imaging	DE4	Activate for 45 sec using VialMix before use
CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)	Mauna Kea Technologies	-	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
ProFlex MiniO/30 probe	Mauna Kea Technologies	-	-
70 kD FITC-labeled dextran	Sigma-Aldrich	46945	-
ImageCell software	Mauna Kea Technologies	-	-
Calibration Kit	Mauna Kea Technologies	-	-
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco Life Tecchnologies	41965-039
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Penicillin/streptomycin/nystatin solution	Biological Industries	03-032-1B