고속 성장하는 종양 생성 세포에 의해 분비 요인에 의해 보충 모니터링 기능 및 혈관의 형태학

요약

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

초록

마우스의 피하 마트 리겔 플러그 어 세이는 프로 및 항 - 혈관 신생 인자의 생체 내 평가를위한 선택 방법이다. 이 방법에서는, 원하는 인자, 피하 주사 후 암 환경을 흉내 낸 환경을 형성하도록 응고 초기 액체 ECM-모방 겔에 도입된다. 이 행렬은 내피 세포 및 혈관의 따라서 형성과 같은 숙주 세포의 침투를 허용한다.

여기서 우리는 특정 인자 (예를 들면, VEGF 및 bFGF에) 또는 에이전트는 대조적으로, 암 세포에 의해 분비 인자 풀의 혈관 신생 가능성을 설명하기 위해 이용 될 수있는 새로운 변형 마트 리겔 플러그 어 세이를 제안한다. ECM-모방 젤을 포함하는 플러그 - 빠르게 성장하는 종양 발생 아교 모세포종 세포의 CM에 분비 요인의 풀과 호스트 (즉, 마우스)를 소개하기 위해 사용된다. 우리는 이전의 혈관 전위의 광범위한 비교를 설명했다U-87 MG 부모의 세포에서 유도 된 혈관 신생을 보여주는 U-87 MG 인간 아교 모세포종이 시스템 모델에서의 휴면 유래 복제,,. CM은 48 시간 배양 한 다음 세포주 어느 합쳐진 조직 배양 플레이트로부터 수집 된 매체를 필터링함으로써 제조된다. 그러므로, 세포 자체가없는 세포에 의해 분비되는 유일한 요소가 포함되어 있습니다. 두 영상 방식의 조합이 여기에 설명 된, 플러그 내에서 새로 형성된 혈관의 정확한 실시간 범위, 형태의 특성과 기능을, 조영 증강 초음파 영상 및 생체 내에 다발 - 공 초점 endomicroscopy을 미세 기포.

서문

마트 리겔 플러그 어 세이는 혈관 신생 제 Kibbey 등에 의해 설명되었다.이 펩타이드 SIKVAV (SER-일드리스 Val으로부터의 Ala-val) 인 ^(1)에 의해 혈관 신생 자극을 평가하는 데 사용 된 1992 년. 다른 생체 내 혈관 신생 어 세이는 대조적으로, 마우스 각막 신생 병아리 또는 융모 막 세이 원한다면, 상기 ^{분석을 수행이} 비교적 용이하다. 주입 ECM-모방 겔 세포 친 혈관 또는 항 혈관 신생 화합물 및 / 또는 요소를 포함 할 수있다. 항 - 혈관 신생 화합물의 활성을 평가할 때, 플러그가 정상적으로 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)의 혼합물을 포함하고, 항 - 혈관 신생 물질 직접 플러그 또는 전신적으로 ^(3)에 투여 될 ^{수있다, 4.}

이 분 이내에 굳은 곳 ECM-모방 젤 피하 주입된다. 그 결과 플러그의 혈관 모집의 평가 typicall입니다Y 형광 염료의 주입 (FITC) 다음 형광 신호의 측정에 의해, 플러그 내에서 헤모글로빈 농도를 측정함으로써 ^수행이 내피 특이 마커 조직학 섹션의 면역 염색에 의해 또는 정렬 ​​형광 - 활성화 된 세포 (FACS) ^2,5-하여, 덱스 트란 - 표지 ^6. 그러나,이 평가는 단지 종점 분석이 가능하고 혈관의 기능 및 형태에 대한 정보가 부족하다. 혈액 콘텐츠 혈관의 크기와 혈액의 정체 풀의 정도에 의해 영향을 받기 때문에 또한 혈장 부피의 측정 중 헤모글로빈 수치 또는 지표로서 덱스 트란-FITC를 사용함으로써, 잘못 될 수있다. 모집 혈관 투과성을 향상 및 보존 (EPR) 효과 ^(7)을 특징으로하는 경우에 특히 중요하다.

우리는 본원에서 두 개의 상보적인 이미징을 조합하여 채용 혈관의 시각화를위한 새롭고보다 정확한 방법을 제안한다. HIG혈관 밀도에 대한뿐만 아니라, 자신의 형태와 기능에뿐만 아니라 정보를 제공 할 수있는 생체 내에 섬유질의-공 초점 endomicroscopy과 함께 시간 해상도 미세 기포 조영 증강 초음파 (US). 또한,이 분석함으로써 혈관 형성의 동력학 모니터링을 가능하게 여러 시간 지점에서 수행 될 수있다. US는 혈관 구획 ^{8-11에서만} 남아 미세 기포 정맥 내 (IV) 주입 다음 혈관 조영 높은 공간 분해능을 가지고 폭넓게 사용되는 영상 기법이다. 마이크로 버블은 미국 펄스 흥분 때문에 좋은 조영제 역할을 할 때 강한 에코 신호를 생성 가스 충전 마이크로 버블 수 있습니다. 플러그의 3D 영상은 마이크로 버블 파괴 다음 US 이미징 시스템 소프트웨어를 사용하여 획득된다. 결과 이미지는 마이크로 버블의 사전 및 사후 파괴의 이미지 프레임에서 구성 및 색상의 비디오 강도의 차이를 반영합니다. 이러한 오버레이이미지는 소프트웨어에 의해 자동으로 표시됩니다. 따라서, 플러그 내에서 혈관의 기능적 %가 정량화 될 수있다. 공 초점 endomicroscopy 다발, 고해상도 혈관의 형태에보고함으로써 상호 보완적인 영상 기법의 역할을한다. 이 최소 침습적 방법, 이미지는 FITC 접합 된 덱스 트란 ^(12)의 정맥 투여 후 취득. 중합체 형광 염료 및 혈류에 따라서 혈관의 형태 및 혈류 '조영제'로서 기능한다. 주입 된 중합체의 70 KDa의 크기이기 때문에, 종양 혈관 검색된 더욱이, 그것은 단지 새는 혈관을 통과 할 수있다. 이것은 혈관 외부 FITC 표지 된 덱스 트란의 높은 배경 초래할 것이다. 따라서, 다발, 촛점 endomicroscopy은 평활 말단으로, 종양 내 neovasculature- 확대 누설 고도로 얽힌 혈관 EPR 효과의 전형적인 특성을 시각화 할 수있다.

이 시스템 모델은 descri했다U-87 MG 인간 아교 모세포종과 휴면 클론 ^(13)의 혈관 전위의 비교 침대. 플러그 내에서 혈관 신생은 3 주 ECM-모방 젤 접종을 게시 평가 하였다. 그것은 보였다 그에서 CM을 포함하는 플러그 내의 혈관 U-87 MG 휴면 종양 생성 세포에서 CM을 포함하는 플러그 내에서 혈관과 비교했을 때 종양 생성 세포가 크게 수, 밀도 및 기능면에서 증가 하였다 빠르게 성장. 따라서 저자는 CM이 분리한다는 결론을 내릴 수 있었다 U-87 MG 빠르게 성장하는 종양 세포 생성하는 휴면 종양 생성 세포에서 CM에 비해 프로 혈관 신생 인자의 높은 수준을 포함​​하고 있습니다. 이러한 요소 (최종적 내피 세포의 관 구조의 형성, 즉, 증식, 발아, 영동) 양 혈관 신생 캐스케이드의 모든 단계에 영향을 미치는 작용하여 혈관 형성을 자극한다.

프로토콜

참고 : 모든 동물 절차 승인 및 의료 기관 동물 관리 및 사용위원회의 텔 아비브 대학 Sackler하십시오 학교 (IACUC)의 표준을 준수 하였다.

1. 조정 배지 준비

1. 의 체적 10cm 배양 플레이트에 씨앗 2 × ¹⁰⁶ U-87 MG 세포를 8 ml의 둘 베코 변형 된 이글 배지, 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % pencillin / 스트렙토 마이신 / 니 스타틴 용액 보충 (DMEM).
2. 37 세포를 품어 C를 °; 48 시간에서 완전 포화 상태를 달성 할 때까지 5 % CO _2.
3. 10 ㎖ 주사기를 사용하여, 15 ㎖의 튜브에 0.45 ㎛의 필터를 통해 모든 플레이트로부터 배지를 회수하고 필터링.
4. 세포 플레이트를 세척하지 않고, 1 ml의 트립신 용액 (0.25 %)를 첨가하고, 배양한다.
5. 모든 세포가 분리되는 경우, 10 % FBS가 보충 된 최소 5 ㎖의 DMEM을 사용하여 트립신을 불 활성화하고 세포 수 프리폼.
> 또는 다른 혈구 세포 계산 장치를 이용하여 세포의 수를 계산하고 사용 계산 방법에 따라 세포의 수를 계산한다.
주 : CM 농도를 정상화하기 위해 나중에 사용됩니다.
6. 유리 둥근 바닥 플라스크에 CM을 전송하고 높은 진공 회전 증발기하에 농축. 원하는 경우, 프로세스를 가속화하기 위해, 37 ° C로 욕 온도를 증가시킨다. CM가 붙여 넣기 같은 질감을 달성 할 때까지 계속합니다.
7. 400 μL 식염수의 각 문화 판에서 CM을 재현 탁. 하나 이상의 플레이트를 사용하는 경우, 동등한 볼륨을 사용한다. 예를 들어, 2 배양 플레이트를 들어, 800 μl를 사용합니다. 4 마우스 각 플레이트를 사용합니다.
8. 다른 세포주 또는 치료를 비교하기 위하여, 단계 160에서 수신 된 셀의 비율에 따라 볼륨을 조정한다. 한 플레이트는 1.5 이상의 셀을 포함하는 경우, 예를 들어, 기존에 400 μL의 생리 식염수 200 μl를 추가. 이 조정 된 CM됩니다

마우스로 제목 "> 2. ECM-모방 젤 플러그 접종

1. 마우스로 ECM-모방 젤을 접종하기 전에 다음 자료를 준비 :
   1. 성장 요인은 (얼음에 4 ° C에서, 실험 전에 하루 밤새 해동) 페놀없는 ECM-모방 젤을 감소시켰다.
   2. 전기 면도기.
   3. 쥐를 마취하기 위해 케타민과 자일 라진 (xylazine).
   4. 얼음처럼 차가운 1,000 μL 멸균 팁.
   5. 얼음처럼 차가운 1 ML의 주사기와 27 G 바늘.
2. 각 마우스 CM 조정 80 μl를 포함하는 1.5 에펜 도르프 튜브를 준비하고 얼음에 보관하십시오.
3. 각각의 튜브에 600 ㎕의 얼음처럼 차가운 성장 요인을 얼음에, 4 ° C에서 하룻밤 해동 된 감소 페놀없는 ECM-모방 젤을 추가합니다. ECM-모방 젤은 4 ° C에서 액체와 신체 온도에서 응고; 고화 ECM-모방 겔을 방지하기 위해, 빙냉 1000 μL 팁을 사용한다. 조심스럽게 거품을 형성하지 않고 튜브를 혼합하고 얼음에 보관하십시오.
4. 육주 된 B를 마취케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (12 ㎎ / ㎏)를 사용하여 ALB / c 마우스. 이전에 실험을 시작하기 제도적 동물 관리 및 사용위원회, 즉에 따라 적절한 마취를 확인합니다. 더 이상 회사 발가락 핀치에 응답하지 않을 때 동물은 마취 자신의 적절한면에 도달했습니다.
5. 쥐의 복부를 면도하고 수술 스크럽 / 알코올을 사용하여 소독.
6. 에펜 도르프 튜브 피하의 내용을 주입하는 추운 1 ML의 주사기와 27 G 바늘을 사용합니다. 기포 형성을 방지하기 위해 매우 천천히 주입을 수행한다. 모든 볼륨이 투여되면 응고가 발생할 때까지, 몇 분 동안 바늘을 배출하지 않습니다.

초음파를 사용하여 3. 평가 ECM-모방 젤 플러그 혈관 신생

주 : 프로토콜의이 부분은 초음파 촬상 시스템, 또는인가 기술자의 도움을 동작시키는 사전 지식을 필요로한다.

1. 시작하기 전에, F를 가질용 재료 및기구 준비를 따르게 :
   1. 전기 면도기.
   2. 탈모 크림.
   3. 쥐를 마취하기 위해 케타민과 자일 라진 (xylazine).
   4. 마이크로 버블 비 대상.
   5. 정품 인증 장치.
   6. 55 메가 헤르츠 (708) 프로브와 3D 취득 미세 조작기을 포함하여 미국 이미징 시스템.
2. 플러그 접종 후 삼주 내 혈관을 측정한다 :
   주 : U-87 MG 계 동물 모델에서 3 주에 대한 이상적인 촬상 시각을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 다른 설정에서 플러그 접종 다음 몇 일부터 혈관 반응 속도를 보정.
   1. 케타민 (100 ㎎ / kg)과 자일 라진 (/ kg 12 mg)을 사용하여 마우스를 마취. 이전에 실험을 시작하기 제도적 동물 관리 및 사용위원회, 즉에 따라 적절한 마취를 확인합니다. 더 이상 회사 발가락 핀치에 응답하지 않을 때 동물은 마취 자신의 적절한면에 도달했습니다.
   2. 면도쥐의 복부 및 제모 크림을 취급합니다.
   3. 마이크로 매니퓰레이터의 무대에 드러 쥐를 수정합니다.
   4. 1ml의 주사기 함유 식염수 30 G 바늘을 사용하여 꼬리 정맥 내부에 바늘을 배치 단단히 고정시키고 바늘을 주사기를 풀고.
   5. 대비 3D 모드 이미지 수집 세션에 설정합니다
      1. 눌러 "3D"는 3D 모터 스테이지를 초기화하고, 원하는 스캔 영역의 중간에 트랜스 듀서를 배치한다.
      2. 보도는 "3D"를 입력 스캔 거리 단계 크기는 다음 "검색"을 누릅니다.
      3. 전체 플러그가 표시되는 3D 이미지 데이터 검색되는 있는지 확인합니다. 그렇지 않으면 전체 플러그가 스캔 단계를 반복 3.5.2에서 볼 수 있도록, 트랜스 듀서를 조정합니다.
      4. 보도는 "대비"및 시간 이득 보상을 밀어 (TGC) 이미지를 어둡게 왼쪽으로 제어합니다.
   6. DESI이다 바이알 혼합기를 사용하여 미세 기포를 활성화45 초 미세 기포의 활성화를 위해 gnated.
   7. 1ml의 50 μL 식염수로 미세 기포 50 μl를 주사기에 섞는다.
   8. 활성화 된 미세 기포가 들어있는 주사기와 염분 함유 느슨해 주사기를 교체합니다. 3D 취득 모터를 사용하여, 정상 상태에 도달 한 후, 플러그의 3D 조영 증강 시네 루프를 취득 방울이 몇 초 후에 마우스의 꼬리 정맥 내로 희석 미세 기포 주입한다 :
      1. 보도는 "3D"와 3D 조영 증강 이미지를 수집 한 다음 이미지 데이터를 저장하기 위해 "시네 저장"을 눌러 "스캔"을 선택합니다.
      2. 보도는 "3D"를 클릭하여 미세 기포를 소멸하는 "3D를 파괴".
      3. 보도는 "3D는"다시하고, 이후 파괴 시네 루프를 취득 "시네 스토어"를 눌러 "스캔"을 선택합니다.
   9. 이미지 프레임이 프리 - 오버레이 및 미세 기포의 사후 파괴를 생성합니다 :
      1. 에서 &# 8220; 참조 설정 "참조 만들기"화면의 왼쪽에 클릭 ".
      2. 보도는 "연구 관리는"인수 사전 파괴 시네 루프를 엽니 다.
      3. 다음 "3D에로드"를 클릭, 녹색 대비 오버레이를 생성하는 "프로세스 시네"를 클릭합니다.
   10. 플러그 내의 혈액량에 대한 3D 이미지 생성을 정량화하기 위해 US 이미징 소프트웨어를 사용하여
       1. 보도는 "스캔 / 일시 정지"다음 "모드 설정"을 누릅니다.
       2. "볼륨"을 클릭하고 "병렬"를 선택합니다.
       3. 윤곽의 시리즈를 분할하여 대상 조직의 3D 볼륨을 만듭니다.
       4. 분할을 완료하기 위해 "마침"을 클릭합니다.
          주 : 조영제의 부피가 화면의 하부 좌측에 표시 될 것이다.
   11. 절차의 끝에서, 거리에서 따뜻하고, 깨끗하고, 건조, 조용한 환경에서 마우스를 배치다른 동물. 설치류에서 12~14인치 거리에 위치 시판 수술 가열 패드 또는 백열 램프 (50~75w)를 사용하여 따뜻함을 제공합니다. 직립 자세를 유지하고 일반적으로 걷는 때까지 계속 마우스를 모니터링합니다.

다발, 공 초점 Endomicroscopy를 사용하여 4. 평가 ECM-모방 젤 플러그 혈관 형태학

주 : 프로토콜의이 부분은 바로 다음 US 이미징을 수행하며 다발 촛점 endomicroscopy 촬상 시스템, 또는인가 기술자의 도움을 동작시키는 사전 지식을 필요로한다.

1. 시작하기 전에 다음과 같은 물질 및 악기 준비가 :
   1. 집게, 가위 및 흡수 바느질 스레드 같은 수술 도구.
   2. FITC 접합 된 덱스 트란 (70 KDa의).
   3. 교정 용액 (세 각 튜브 함유 과산화수소, 물 또는 형광 용액).
   4. 촬상 시스템 및제조 업체에 따라 혈관의 영상에 적합한 프로브.
2. 케타민 (100 ㎎ / kg)과 자일 라진 (/ kg 12 mg)을 사용하여 마우스를 마취.
3. , 꼬리 정맥을 통해 10 ㎎ / ㎖의 FITC 표지 된 덱스 트란의 200 μl를 관리 IV.
4. 수술 스크럽 / 알코올을 사용하여 복부를 소독하고, 플러그에서 약 1cm을 작은 절개를 적용합니다.
5. 그대로 플러그를 유지하면서 부드럽게 플러그의 상단에있는 endomicroscopy 프로브를 놓습니다.
6. 취득 :
   1. 프로브가 플러그에 설정되면, Enter 키를 눌러 발 페달을 사용하여 "레이저를 시작합니다". 형광 화면에 표시해야한다.
   2. 화면에 '기록'을 누르거나 풋 페달을 사용하여 '선택'에 의해 (30 초까지) 짧은 동영상을 획득.
   3. 영화 사이, 튜브 포함 된 물에 팁을 배치하여 프로브를 세척한다.
   4. 완료되면, 프로브를 제거하고면 팁 팁을 청소합니다.
7. 평균 VE를 분석하려면SSEL 직경 :
   1. 선박 탐지 모듈 창을 열려면 상단 패널에서 "미세 혈관 감지"아이콘을 클릭합니다.
   2. "환경 설정"을 클릭하고 "관심의 통계"및 "디스플레이 모드"에서 "디스플레이 히스토그램 바"에서 "혈관 직경을 의미"표시합니다.
   3. 클릭 선택한 측정을 표시 할 "감지".
8. 혈관에 인접한 영역에서 형광 신호 강도를 분석하기 :
   1. 왼쪽 패널에서 "원 ROI 만들기"를 클릭하고 관심의 영역에서 원을 만듭니다.
   2. 이 지역에 관련된 값을 계산하기 위해 "투자 수익 (ROI) 내에서 계산 히스토그램"를 클릭합니다.

마우스 5. 시술 후 치료

1. 각각의 이미지를 만드는 절차의 끝에서 멀리 다른 동물에서 따뜻하고, 깨끗하고, 건조, 조용한 환경에서 마우스를 놓습니다. 시중를 사용하여 따뜻함을 제공로만 제공 외과 가열 패드 또는 백열 램프 (50 ~ 75 W)는 설치류에서 멀리에서 12 ~ 14를 배치했다. 직립 자세를 유지하고 일반적으로 걷는 때까지 계속 마우스를 모니터링합니다.
2. 추가 시점에서 플러그 '혈관의 추가 분석을 위해, 다음의 복구 조건을 적용
   1. 흡수성 봉합사를 사용하여 작은 절개 봉합.
   2. 피하 같은 부 프레 노르 핀 (1 ㎎ / ㎏)와 같은 마우스 진통제를주고, 개별 케이지로 돌아갑니다.
   3. 더 진통제 치료가 필요하고 있는지 확인하기 위해 모든 동물을 준수 모니터링하고 고통에 대해 평가하기 위해 매일 다시 평가합니다.
3. 실험 종료 시점에서 경추 탈구이어서 제 도포함으로써 마우스를 이소 플루 란, 안락사.
4. 추가 영상이 초기 이미징 단계 다음 주에 수행 될 경우, 모든 절차는 가능한 멸균 보관해야합니다. 수술 피부 스크럽을 수행해야 멸균 WA터와 소독면 팁 endomicroscopy 프로브를 청소하는 데 사용되어야하고, 프로브는 멸균 수를 사용하여 각 동물 소독한다.

결과

빠르게 성장하는 혈관 신생 종양 발생 세포주 U-87 MG, 광범위한 혈관 신생의 결과에서 CM으로 ECM-모방 젤 플러그를 주입하는. 이 맥관 광범위 개의 상보 촬상 방법을 사용하여 탐색 될 수있다.

마이크로 버블의 조영 증강 US 이미징 U-87 MG CM로드 플러그, 휴면 종양 발생 세포에서 CM 함유 플러그 내에 탐지 혈류 달리 (도 1) 내에서 광범위한 혈액 흐름을 도시하여 플러?...

토론

상보 촬상 방법을 결합하여 다른 혈관 형성 구성 요소의 미세 혈관의 밀도 및 형태의 기능에 관한 정보의 취득을 허용한다. ECM-모방 겔 플러그에로드 CM은 플러그로 모집 extravasate되어 내피 세포, 같은 다른 세포 집단에서 분리 된 종양 미세 환경을 생성합니다.

병렬로 수행함으로써, 조영 증강 US 이미징 및 다발 촛점 endomicroscopy 이미징 마이크로 버블, 우리는 암세포 자체없이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotary Vacuum Evaporator	-	-	-
Growth-factors reduced phenol-free Matrigel	BD Bioscience	FAL356231	Thaw overnight, at 4 °C on ice
Depilatory cream	-	-	-
Vevo2100 US imaging system	VisualSonics Inc.	-	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
55 MHz 708 probe	VisualSonics Inc.	-	-
Vevo2100 imaging software	VisualSonics Inc.	-	-
VialMix	DEFINITY Imaging	VMIX	-
DEFINITY microbubbles	DEFINITY Imaging	DE4	Activate for 45 sec using VialMix before use
CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)	Mauna Kea Technologies	-	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
ProFlex MiniO/30 probe	Mauna Kea Technologies	-	-
70 kD FITC-labeled dextran	Sigma-Aldrich	46945	-
ImageCell software	Mauna Kea Technologies	-	-
Calibration Kit	Mauna Kea Technologies	-	-
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco Life Tecchnologies	41965-039
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Penicillin/streptomycin/nystatin solution	Biological Industries	03-032-1B