Hızlı büyüyen Tümör üreten hücreleri tarafından salgılanan faktörler tarafından işe alınmış İzleme İşlevsellik ve vaskülatürüne morfolojisi

Özet

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Özet

farelere subkutan olarak Matrigel fiş deney pro- ve anti-anjiyojenik faktörlerin in vivo değerlendirilmesi için tercih edilen bir yöntemdir. Bu yöntemde, arzu edilen faktörler, deri altına enjeksiyon sonrası, kanser ortamını taklit eden bir ortam oluşturmak üzere katılaşmaktadır soğuk sıvı ECM mimik jel içine yerleştirilir. Bu matris, endotel hücreleri ve damar nedenle oluşumu gibi konakçı hücreler, bir şekilde nüfuz etmesini sağlamaktadır.

Bu yazıda, belirli bir etken (örneğin, bFGF ve VEGF) veya ajana karşı, kanser hücreleri tarafindan salgılanan faktörlerle havuzunun anjiyojenik potansiyelini göstermektedir için kullanılabilir yeni bir modifiye edilmiş Matrigel fiş deneyi önermektir. ECM-mimik jel içeren fiş-hızlı büyüyen tümör üreten glioblastoma hücrelerinin CM salgılanan faktörlerin bir havuzlu ev sahibi (yani, fare) tanıtmak için kullanılır. Biz daha önce anjiyojenik potansiyeli geniş bir karşılaştırma tarif varU 87 mg ana hücrelerde neden olduğu anjiyojenez gösteren U 87 mg insan glioblastoma ve bu sistem modeli olan atıl türetilmiş klon. CM 48 saat kuluçkadan sonra hücre hattı ya da bir birleşik doku kültürü plakalarından toplanan ortamı filtre edilerek hazırlanır. Dolayısıyla, bu hücrelerin kendileri olmadan hücreler tarafından salgılanan tek faktörler içerir. İki görüntüleme yöntemlerinin kombinasyonu burada açıklandığı fişleri içinde yeni oluşan kan damarlarının doğru, gerçek zamanlı ölçüde, morfoloji karakterizasyonu ve işlevsellik için, kontrastlı ultrason görüntüleme ve Intravital fibered-konfokal endomikroskopi mikrokabarcıkları.

Giriş

Matrigel fiş anjiyojenez tahlil, ilk önce Kibbey ve arkadaşları tarafından tarif edilmiştir. Bu peptid SIKVAV (Ser-lle-Lys-Val-Ala-Val) ¹ ile anjiyojenez uyarılmasını elde etmek için kullanılmıştır 1992 yılında. Başka in vivo anjiyojenez deneylerinin aksine, fare korneal anjiyojenez veya tavuk koriallantoik zar deneylerinde olduğu gibi, bu deney ² gerçekleştirmek için nispeten kolaydır. enjekte ECM mimik jel hücreleri, pro-anjiyojenik veya bir anti-anjiyojenik bileşikler ve / veya faktörler içerebilir. Bir anti-anjiyojenik bileşiğinin etkinliğini değerlendirerek, fiş normal vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) 'in bir karışımını ihtiva eder ve anti-anjiyojenik bir madde, doğrudan fiş ya da sistemik olarak ³ içine tatbik ^{edilebilir, 4.}

Birkaç dakika içinde katılaşır nerede ECM-mimik jel deri altına enjekte edilir. Ortaya çıkan fiş kan damarı işe değerlendirilmesi typicall olduğunuY flöresin izotiyosiyanat enjeksiyonu (FITC), aşağıdaki flüoresan sinyal ölçümü ile, tıkacın içinde hemoglobin düzeyi ölçülerek yapılan ^endotel özel markörler için histoloji kısımlarının immün ya da sıralama floresan-aktive edilmiş hücre (FACS) ^2,5 ile, dekstran -etiketli ^6. Ancak, bu değerlendirme sadece uç nokta analizi sağlar ve kan damarlarının işlevleri ve morfolojisi hakkında bilgi yoksun. Kan içeriği damar büyüklüğü ve kan durgun su ölçüde etkilenir Ek olarak, plazma hacmi ölçümleri ya da hemoglobin düzeyleri ile ya da bir gösterge olarak dekstran-FITC ile, yanıltıcı olabilir. Işe damar gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisi ⁷ ile karakterizedir Bu özellikle önemlidir.

Biz burada iki tamamlayıcı görüntüleme yöntemleri birleştirerek işe kan damarlarının görüntülenmesi için yeni, daha hassas, yöntem öneriyoruz. Higkan damarı yoğunluğu hakkında değil, aynı zamanda kendi morfolojisi ve işlevselliği değil sadece bilgi verebilir Intravital lifli-konfokal endomikroskopi ile birlikte h-çözünürlüklü mikrokabarcıklar kontrast geliştirilmiş ultrason (US). Ayrıca, bu analiz, böylece anjiyojenez kinetik izlenmesine olanak veren çeşitli zaman noktalarında gerçekleştirilebilir. ABD vasküler bölmeye ^8-11 münhasıran kalır mikrokabarcıkların intravenöz (iv) enjeksiyonu takiben kan damarları görüntüleme için yüksek uzaysal çözünürlüğü sahip bir yaygın kullanılan görüntüleme yöntemidir. Mikrokabarcıklar bir ABD darbesi ile heyecanlı ve böylece iyi bir kontrast madde olarak hizmet zaman güçlü bir ekojenik sinyal üretmek gaz dolu mikrokabarcıklar vardır. Fiş 3D görüntüler mikro kabarcıklar imha aşağıdaki ABD görüntüleme sistemi yazılımı kullanılarak elde edilir. Ortaya çıkan görüntüler mikro-kabarcıkların öncesi ve sonrası imha görüntü karelerinden oluşan ve renk video yoğunluğundaki farkı yansıtır. Bu yerleştirilmiştirGörüntüler otomatik olarak yazılım tarafından görüntülenir. Sonuç olarak, fiş içinde fonksiyonel damarların yüzde belirlenebilir. Konfokal endomikroskopi lifli Yüksek çözünürlüklü kan damarları morfoloji raporlanması ile tamamlayıcı görüntüleme yöntemi olarak hizmet vermektedir. Bu minimal invaziv yöntemde, görüntüler FITC konjuge dekstran ¹² iv uygulamasını takiben elde edilir. floresan polimer kana boyayan ve böylece kan damarları morfoloji ve kan akışı için bir 'kontrast madde' olarak hizmet vermektedir. Enjekte polimer 70 KDa bir boyutta olduğu tümör damar sistemi içinde bulunan Dahası, sadece sızan damarları geçebilir. Bu, kan damarlarının dışında FITC etiketli dekstran yüksek bir arka plan ile sonuçlanacaktır. Sonuç olarak, lifli konfokal endomikroskopi kör uçlar ile, tümör neovasculature- büyütülmüş, sızan, son derece karışık damarları EPR etkisi tipik özelliklerini görselleştirmek için kullanılabilmektedir.

Bu sistem modeli descri edildiU-87 MG insan glioblastoma ve uykuda klon ¹³ anjiyojenik potansiyeli karşılaştırıldığında yatak. Fişler içinde damarlanması üç hafta ECM-mimik jel aşılama sonrası değerlendirildi. Bu gösterildi bundan CM içeren fişler içinde vaskülarizasyon U-87 MG uyuyan tümör üreten hücrelerden CM içeren fişler içinde damarlanma ile karşılaştırıldığında tümör üreten hücreler önemli ölçüde sayı, yoğunluk ve işlevsellik bakımından artmıştır hızlı büyüyen. Bu nedenle, yazarlar CM izole sonucuna mümkün U 87 mg hızlı büyüyen tümör hücreleri üreten atıl tümör üreten hücrelerden CM kıyasla pro-anjiyojenik faktörler arasında yüksek düzeyde ihtiva etmektedir. Bu faktörler, (son olarak endotelyal hücrelerin tüp şekilli yapıların oluşumunu, yani, proliferasyon, çimlenme, göç ve) pozitif anjiyojenik kaskadın tüm adımları etkileyerek fonksiyonel kan damarlarının oluşumunu teşvik eder.

Protokol

NOT: Tüm hayvan prosedürleri onaylanmış ve Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Tel Aviv Üniversitesi Sackler Okulu (IACUC) standartlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Klima Medya Hazırlık

1. Bir hacim içinde 10 cm'lik bir kültür plakasına Tohum, 2 x 10 ⁶ U 87 mg hücreler 8 mi Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin / nistatin çözeltisi ile desteklenmiş (DMEM).
2. 37 ° C'de inkübe hücreleri C °; 48 saat tam konfluense elde edilinceye kadar% 5 CO _2.
3. 10 ml'lik bir şırınga kullanarak, 15 ml'lik bir tüp içine 0.45 um'lik bir filtre ile plaka tüm orta çekilme ve filtre edin.
4. Hücreler plakayı yıkayarak olmadan, 1 ml tripsin çözeltisi (% 0.25) ekleyin ve inkübe edilir.
5. Tüm hücreler müstakil zaman,% 10 FBS ile takviye edilmiş en az 5 ml DMEM kullanılarak tripsin inaktive etmek üzere ve bir hücre sayımı preform.
> Bir hemositometre ya da diğer hücre-sayım aygıtı kullanılarak hücrelerin sayısını ve kullanılan sayım yöntemine göre hücre sayısını hesaplayın.
NOT: Bu CM konsantrasyonunu normale için daha sonra kullanılacaktır.
6. Cam yuvarlak dipli bir şişeye CM aktarın ve yüksek vakum döner buharlaştırıcı ile konsantre edilmiştir. İstenirse sürecini hızlandırmak için, 37 ° C banyo sıcaklığı artar. CM macun-benzeri bir yapı elde kadar devam edin.
7. 400 ul tuzlu su içinde her kültür plaka CM süspanse. Birden fazla plaka kullanılırken, eşdeğer hacimde kullanılır. Örneğin, 2 kültür levhaları, 800 ul kullanın. 4 fare için her levha kullanın.
8. Farklı hücre hatları veya tedavileri karşılaştırmak amacıyla, adım 1.6 alınan hücre oranına göre ses seviyesini ayarlayın. Bir tabak 1.5x daha fazla hücre içeriyorsa, örneğin, önceden var olan 400 ul tuz çözeltisi 200 ul ilave edin. Bu düzeltilmiş CM olacak

Fareler içine başlığı "> 2. ECM-mimik Jel Tak Aşılama

1. Farelere ECM-mimik jel aşılayarak önce aşağıdaki malzemeleri hazırlayın:
   1. Büyüme faktörleri (buz üzerinde 4 ° C de, deney bir gün önce, bir gece boyunca çözülme) fenol içermeyen ECM mimik jel azaltmıştır.
   2. Elektrikli tıraş makinesi.
   3. Fareler uyutmak için ketamin ve ksilazin.
   4. Buz soğuk 1.000 ul steril ipuçları.
   5. Buz soğuk 1 ml şırınga ve 27 G iğne.
2. Her fare için CM arındırılmış 80 ul içeren 1.5 ml'lik Eppendorf tüp hazırlayın ve buz üzerinde tutmak.
3. Her bir tüpe, 600 ul buz gibi soğuk büyüme faktörlerinin buz üzerinde 4 ° C'de gece boyunca çözülmüş azaltılmış fenol içermeyen ECM mimik jel ekleyin. ECM mimik Jel 4 ° C'de sıvı olan ve vücut sıcaklığında katılaşan; katılaşan ECM-mimik jel önlemek için, buz gibi soğuk 1.000 ul ipuçlarını kullanın. Dikkatle kabarcıklar oluşturan olmadan tüpleri karıştırın ve buz üzerinde tutmak.
4. 6 haftalık B uyutmakKetamin (100 mg / kg) ve ksilazin (12 mg / kg) ile ALB / c farelerinde indüklenmiştir. Önce deney başlamadan kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, yani göre uygun anestezi onaylayın. Artık bir firma ayak tutam yanıt zaman hayvanlar anestezi onların doğru uçağı ulaştı.
5. Farelerin karın bölgesi Tıraş ve cerrahi fırçalayın / alkol kullanarak dezenfekte.
6. Eppendorf tüp subkutan içeriğini enjekte etmek soğuk 1 ml şırınga ve bir 27 G iğne kullanın. Kabarcık oluşmasmı önlemek üzere çok yavaş enjeksiyon yapın. Tüm ses uygulanır sonra katılaşma oluşuncaya kadar, birkaç dakika için iğne çıkarma yok.

Ultrason kullanma 3. Değerlendirme ECM-mimik Jel Tak damarlanma

NOT: protokol bu bölümü ultrason görüntüleme sistemi, veya yetkili teknisyen yardımı yapan önceki bilgi gerektirir.

1. Başlamadan önce, f varmalzemeleri ve aletleri hazır ollowing:
   1. Elektrikli tıraş makinesi.
   2. Tüy Dökücü Krem.
   3. Fareler uyutmak için ketamin ve ksilazin.
   4. Microbubbles olmayan hedefli.
   5. Aktivasyon cihazı.
   6. 55 MHz 708 prob ve 3D edinme mikromanipülatör dahil olmak üzere ABD görüntüleme sistemi.
2. Fişler aşılamadan sonrası üç hafta içinde vaskülarizasyonunu ölçün:
   Not: A-87 MG-tabanlı bir hayvan modelinde, 3 hafta görüntüleme için ideal bir zaman noktasını temsil bulunmuştur. Farklı ayarlar altında, fişlerin aşılamayı takip eden birkaç gün başlayan vaskülarizasyon kinetik kalibre.
   1. Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (ug / kg 12 mg) kullanılarak fareler anestezi. Önce deney başlamadan kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, yani göre uygun anestezi onaylayın. Artık bir firma ayak tutam yanıt zaman hayvanlar anestezi onların doğru uçağı ulaştı.
   2. Tıraşfarelerin karın bölgesi ve tüy dökücü krem ​​ile tedavi.
   3. Mikro-manipülatör sahnede supinely fareler Fix.
   4. 1 ml şırınga içeren tuzlu su ve 30 G iğne kullanarak, kuyruk ven içine iğne yerleştirin sıkıca iğne düzeltmek ve şırınga gevşetin.
   5. Kontrast 3D modu görüntü elde etme oturumu için ayarlama:
      1. Basın "3D" 3D Motor sahne başlatmak ve istenen tarama alanının ortasında dönüştürücüyü yerleştirmek için.
      2. Basın "3D" ve giriş tarama mesafe ve adım boyutu, daha sonra "Scan" tuşuna basın.
      3. Tüm fiş görüntülenen 3D görüntü verileri tarandı emin olun. Değilse, tüm fiş tarama ve tekrar adım 3.5.2 görünür, böylece dönüştürücüyü ayarlayın.
      4. Basın "Kontrast" ve zaman kazancı tazminat itin (TGC) Görüntüyü koyulaştırmak için sola kontrol eder.
   6. Desi bir şişe bir mikser kullanılarak mikro-kabarcıkları etkinleştirme45 saniye için mikro-kabarcıkların aktivasyonu için gnated.
   7. 1 ml 50 ul serum fizyolojik ile kabarcıkların 50 ul şırınga içinde karıştırın.
   8. Aktive mikrokabarcıkların içeren bir şırınga ile tuzlu içeren gevşek şırınga değiştirin. 3D edinimi motoru kullanarak, bir kararlı duruma ulaşması ve ardından fiş 3D kontrastlı sine döngü elde etmek baloncuklar için birkaç saniye bekleyin, farelerin kuyruk damar içine enjekte seyreltilmiş mikrokabarcıkları:
      1. Basın "3D" ve 3D kontrastlı görüntüler elde ve daha sonra görüntü verilerini kaydetmek için "Cine deposu" basın "Scan" seçeneğini seçin.
      2. Basın "3D" ve tıklayın mikrokabarcıkları imha etmek "3D yok".
      3. Basın "3D" Tekrar ve daha sonra, bir post-imha sine döngü elde "Cine Mağaza" basın "Scan" seçeneğini seçin.
   9. Görüntü çerçeveleri öncesi bindirme ve mikrokabarcıkların sonrası imha oluşturun:
      1. In &# 8220; Referans Ayarları "Referans oluştur" Ekranın sol tarafındaki tıklayın ".
      2. Basın "Çalışma Yönetimi" kazanılmış öncesi imha sine döngü açmak için.
      3. Daha sonra "3D içine Load" tıklayın, yeşil kontrast bindirme oluşturmak için "Süreç Cine" tıklayın.
   10. Fişler içinde kan hacmi için ortaya çıkan 3D görüntü ölçmek amacıyla ABD görüntüleme yazılımı kullanın:
       1. Basın "Tarama / Freeze" ve ardından "Mod ayarları" tuşuna basın.
       2. "Volume" tıklayın ve "Paralel" seçeneğini seçin.
       3. Konturları bir dizi segmentlere hedef doku 3D birimi oluşturun.
       4. Segmentasyonu tamamlamak için "Finish" tıklayınız.
          NOT: kontrast madde hacmi ekranın sol alt tarafında görüntülenir.
   11. Prosedürün sonunda, uzak bir sıcak, temiz, kuru, sessiz bir ortamda fareler yerleştirindiğer hayvanlar. Kemirgen 12-14 santim uzakta yerleştirilmiş bir piyasadan temin cerrahi ısıtma pedi ya da akkor lamba (50-75 watt) kullanarak sıcaklık sağlayın. Dik duruş korumak ve normal yürüme kadar sürekli fareler izleyin.

Fibered Konfokal endomikroskopi Kullanılması 4. Değerlendirme ECM-mimik Jel Tak damarları Morfoloji

NOT: protokolün bu kısmı hemen ardından ABD görüntüleme yapılır ve lifli konfokal endomikroskopi görüntüleme sistemi, veya yetkili teknisyen yardımı yapan önceki bilgi gerektirir.

1. Başlamadan önce, aşağıdaki malzemeler ve aletler hazır bulundurun:
   1. Forseps, makas ve emilebilir dikiş iplikleri gibi Cerrahi aletler.
   2. FITC ile konjüge edilmiş dekstran (70 Kda).
   3. Kalibrasyon çözeltiler (üç tüp, her biri hidrojen peroksit, su ya da floresan çözeltisi).
   4. görüntüleme sistemi veÜreticiye göre, kan damarlarının görüntüleme için uygun prob.
2. Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (ug / kg 12 mg) kullanılarak fareler anestezi.
3. , Kuyruk damarından, 10 mg / ml FITC-işaretli dekstran 200 ul iv uygulayın.
4. Cerrahi bodur / alkol kullanarak karın bölgesi dezenfekte ve fiş yaklaşık 1 cm küçük bir kesi uygulanır.
5. Sağlam fiş tutarken yavaşça tıkacın üstüne yerleştirilmesini endomikroskopi sonda yerleştirin.
6. Toplama:
   1. Prob fiş üzerinde ayarlandıktan sonra, basın ayak pedalını kullanarak "lazer başlat". floresan ekranda gösterilir edilmelidir.
   2. Ekranda 'Record' tuşuna basarak veya ayak pedalı ile 'Seç' tarafından (30 sn kadar) kısa film Edinme.
   3. Filmler arasında, bir tüp içeren su ucu yerleştirerek prob yıkayın.
   4. Bittiğinde, sonda kaldırmak ve bir pamuk uçlu ucu temizleyin.
7. Ortalama A.Ş. analiz etmekSSEL çapı:
   1. Damar algılama modülü penceresini açmak için üst paneldeki "mikrodamarlar algıla" ikonuna tıklayın.
   2. "Tercihler" tıklayın ve "ilgi İstatistiğin" ve "Ekran" modunda "Ekran histogram barlarda" in "damar çapı ortalama" işaretleyin.
   3. Tıklayın Seçilen ölçümleri görüntülemek için "Algılama".
8. Kan damarlarının bitişik alanlarda floresan sinyal yoğunluğunu analiz için:
   1. Sol panelde "daire yatırım getirisi oluştur" üzerine tıklayın ve ilgi alanındaki bir daire oluşturun.
   2. Bu bölgeye ilişkin değerlerini hesaplamak için "ROI içinde Compute histogramı" tıklayın.

Farelerin 5. Post-prosedürel Tedavi

1. Her görüntüleme prosedürü sonunda, diğer hayvanlardan uzakta sıcak, temiz, kuru, sessiz bir ortamda fareler yerleştirin. Ticari-a kullanarak sıcaklık sağlayınullanılabilir cerrahi ısıtma yastığı veya akkor lamba (50-75 W), kemirgen uzak içinde 12-14 yerleştirilir. Dik duruş korumak ve normal yürüme kadar sürekli fareler izleyin.
2. Ek zaman noktalarında fişler 'damarlanma daha fazla analiz için, aşağıdaki kurtarma koşulları geçerlidir:
   1. Emilebilir sütürler kullanılarak küçük bir kesi sütür.
   2. Deri altından gibi buprenorfin (1 mg / kg) olarak farenin ağrı kesiciler ve tek tek kafeslere geri döner.
   3. Daha fazla analjezik tedavi gereklidir ve olup olmadığını belirlemek için tüm hayvanları gözlemlemek izlemek ve sıkıntı değerlendirmek için günlük yeniden değerlendirmek.
3. Deneyin son noktada, sonra servikal dislokasyon yapılmıştır, ilk uygulama izofloran ile fare, euthanize.
4. Ek görüntüleme ilk görüntüleme adımları izleyerek haftalarda yapılacak ise, tüm işlemler mümkün olduğunca steril tutulmalıdır. Bir cerrahi cilt fırçalama yapılmalıdır, steril waTer ve steril pamuk ip uçları endomikroskopi probu temizlemek için kullanılmalıdır ve prob steril su kullanılarak her bir hayvan arasında dezenfekte edilmelidir.

Sonuçlar

Hızla büyüyen anjiyojenik tümör üreten hücre çizgisi U-87 MG, geniş anjiojenezis'de sonuçları CM ile ECM-mimik jel fişlerini implanting. Bu damar yoğun iki tamamlayıcı görüntüleme yöntemleri kullanılarak araştırılmalıdır edilebilir.

Microbubbles kontrastlı ABD görüntüleme U-87 MG CM yüklü fişler, uyuyan tümör üreten hücrelerden CM içeren fişler içinde saptanamayan kan akımına karşı (Şekil 1) içinde yoğun kan akışını göst...

Tartışmalar

Tamamlayıcı görüntüleme yöntemleri birleştiren farklı anjiyogenez bileşenlerinin damar yoğunluk, fonksiyonellik ve morfolojisi hakkında bilgi iktisap izin verir. ECM-mimik jel fişler üzerinde yükleme CM fişi içine işe ve damar dışına olan endotel hücreleri gibi, diğer hücre popülasyonlarının ayrılan bir tümör mikro, üretir.

Paralel, performans olarak, kontrastlı ABD görüntüleme ve lifli konfokal endomikroskopi görüntüleme mikrokabarcıkları, biz kanser h...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotary Vacuum Evaporator	-	-	-
Growth-factors reduced phenol-free Matrigel	BD Bioscience	FAL356231	Thaw overnight, at 4 °C on ice
Depilatory cream	-	-	-
Vevo2100 US imaging system	VisualSonics Inc.	-	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
55 MHz 708 probe	VisualSonics Inc.	-	-
Vevo2100 imaging software	VisualSonics Inc.	-	-
VialMix	DEFINITY Imaging	VMIX	-
DEFINITY microbubbles	DEFINITY Imaging	DE4	Activate for 45 sec using VialMix before use
CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)	Mauna Kea Technologies	-	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
ProFlex MiniO/30 probe	Mauna Kea Technologies	-	-
70 kD FITC-labeled dextran	Sigma-Aldrich	46945	-
ImageCell software	Mauna Kea Technologies	-	-
Calibration Kit	Mauna Kea Technologies	-	-
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco Life Tecchnologies	41965-039
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Penicillin/streptomycin/nystatin solution	Biological Industries	03-032-1B