Funzionalità di monitoraggio e di Morfologia Vasculature Reclutato da fattori secreti dalle cellule a crescita rapida, la generazione di tumore

Riepilogo

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Abstract

Il sottocutanea spina dosaggio matrigel nei topi è un metodo di scelta per la valutazione in vivo di fattori pro e anti-angiogenici. In questo metodo, i fattori desiderati vengono introdotti freddo gel liquido ECM-mimico che, dopo l'iniezione sottocutanea, solidifica per formare un ambiente simulando l'ambiente cancro. Questa matrice permette la penetrazione di cellule ospiti, come le cellule endoteliali, e di conseguenza, la formazione di vasi.

Qui proponiamo un nuovo saggio spina matrigel modificata, che può essere sfruttata per illustrare il potenziale angiogenico di un pool di fattori secreti dalle cellule tumorali, al contrario di un fattore specifico (ad esempio, bFGF e VEGF) o all'agente. La spina contenente gel ECM-mimico viene utilizzato per introdurre l'host (cioè, mouse) con un pool di fattori secreti al CM di cellule di glioblastoma-tumorali generando in rapida crescita. Abbiamo precedentemente descritto un ampio confronto del potenziale angiogenicaU-87 MG glioblastoma umano e la sua dormiente derivato clone, in questo modello di sistema, mostrando angiogenesi indotta nelle cellule parentali MG U-87. Il CM è preparato filtrando mezzi raccolti da piastre di coltura tissutale confluente di entrambe le linee di cellule seguenti 48 ore di incubazione. Quindi, esso contiene solo fattori secreti dalle cellule, senza le cellule stesse. Descritto qui è la combinazione di due modalità di imaging, microbolle mdc ecografia e intravitale endomicroscopy fibered-confocale, per un accurato, in tempo reale, la caratterizzazione della misura, la morfologia e la funzionalità dei vasi sanguigni di nuova formazione all'interno delle spine.

Introduzione

Il saggio angiogenesi spina matrigel è stato descritto da Kibbey et al., Nel 1992, dove è stato utilizzato per valutare la stimolazione dell'angiogenesi dal SIKVAV peptide (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) ^1. A differenza di altri test angiogenesi in vivo, come l'angiogenesi corneale mouse o pulcino saggi di membrana corio-allantoidea, questo saggio è relativamente facile da eseguire ^2. Il gel ECM-mimico iniettato può contenere cellule, pro-angiogenico o un composti e / o fattori anti-angiogenici. Nel valutare l'attività di un composto anti-angiogenico, il tappo contiene normalmente una miscela di vascolare fattore di crescita endoteliale (VEGF) e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), e la sostanza anti-angiogenico può essere somministrata direttamente nella spina o sistemica ^{3, 4.}

Il gel ECM-mimico viene iniettato per via sottocutanea in cui si solidifica in pochi minuti. Valutazione del vaso sanguigno assunzioni nella spina risultante è typically effettuato misurando i livelli di emoglobina all'interno del plug, mediante misurazione segnale di fluorescenza dopo l'iniezione di isotiocianato di fluorescina (FITC) -labeled destrano, mediante immunocolorazione di sezioni di istologia di marcatori specifici endoteliali o da cellule fluorescenza attivate (FACS) ^{2,5, 6.} Tuttavia, questa valutazione permette solo analisi end-point e manca informazioni sulla funzionalità e morfologia dei vasi sanguigni. Inoltre, misurazioni di volume plasmatico, sia per livelli di emoglobina o utilizzando destrano-FITC come indicatore, può essere fuorviante dal contenuto sangue è influenzata dalle dimensioni dei vasi sanguigni e la portata delle piscine stagnanti di sangue. Questo è particolarmente importante quando la vascolarizzazione assunto è caratterizzato dalla permeabilità migliorata e ritenzione (EPR) Effetto ^7.

Noi qui proponiamo un nuovo, più preciso, il metodo per la visualizzazione dei vasi sanguigni reclutati dalla combinazione di due modalità di imaging complementari. Higmicrobolle h risoluzione mdc ecografia (US) in combinazione con intravitale fibrato-confocale endomicroscopy in grado di fornire informazioni non solo su sangue densità dei vasi, ma anche sulla loro morfologia e funzionalità. Inoltre, questa analisi può essere eseguita in diversi intervalli di tempo per permettere così il controllo della cinetica di angiogenesi. Stati Uniti sono un diffuso modalità di imaging che possiede alta risoluzione spaziale per i vasi sanguigni immagini seguenti per via endovenosa (ev) iniezione di microbolle che rimangono esclusivamente nel compartimento vascolare ^8-11. Le microbolle sono microbolle contenenti gas che producono un forte segnale ecogena quando eccitato con un impulso degli Stati Uniti e quindi servire come un buon mezzo di contrasto. Immagini 3D della spina sono acquisiti tramite il software di sistema di imaging US seguente microbolle distruzione. Le immagini risultanti sono composti da fotogrammi dell'immagine di pre e post-distruzione delle microbolle e riflettono la differenza di intensità di video a colori. Questi sovrappostoimmagini vengono visualizzate automaticamente dal software. Di conseguenza, la percentuale di vasi funzionali all'interno della spina può essere quantificato. Alta risoluzione fibrata endomicroscopy confocale serve come modalità di imaging complementare riferendo sui vasi sanguigni morfologia. In questo metodo minimamente invasiva, le immagini vengono acquisite in seguito alla somministrazione endovenosa di destrano FITC-coniugato ^12. Il polimero tinture fluorescenti nel flusso sanguigno e quindi serve come un 'agente di contrasto' per i vasi sanguigni morfologia e il flusso di sangue. Inoltre, poiché il polimero iniettato è ad una dimensione di 70 KDa, può attraversare solo navi perde come si trova nel sistema vascolare del tumore. Ciò comporterà alta sfondo dal destrano marcato con FITC fuori dei vasi sanguigni. Di conseguenza, fibrata endomicroscopy confocale può essere utilizzato per visualizzare le caratteristiche tipiche dell'effetto EPR in tumore neovasculature- allargata, che perde, le navi altamente aggrovigliati, con estremità smussata.

Questo modello di sistema è stato descriletto nel confronto tra il potenziale angiogenico di U-87 MG glioblastoma umano e la sua clone dormiente ^13. Vascolarizzazione nei tappi è stata valutata tre settimane inviare ECM-mimico gel inoculazione. È stato dimostrato che la vascolarizzazione all'interno spine contenenti CM da U-87 MG rapida crescita delle cellule tumorali generando era significativamente aumentata in termini di numero, densità e funzionalità, rispetto ai tappi vascolarizzazione contenenti CM dalle cellule tumorali generare dormienti. Pertanto, gli autori sono stati in grado di concludere che CM isolato da U-87 MG rapida crescita delle cellule tumorali generando contiene livelli più elevati di fattori pro-angiogenici, rispetto al CM dalle cellule tumorali generando dormienti. Questi fattori stimolano la formazione di vasi sanguigni funzionali influenzando positivamente tutte le fasi della cascata angiogenica (cioè, la proliferazione, germinazione, migrazione e infine, formazione di strutture tubolari di cellule endoteliali).

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure di animali sono stati approvati ed eseguiti nel rispetto delle norme di Tel Aviv University Sackler School of Medicine Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Carta Preparazione condizionata

1. Seed 2 x 10 ⁶ U-87 cellule MG in una piastra di coltura 10 cm d'un volume di 8 ml mezzo modificato Eagle di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di soluzione Pencillin / streptomicina / nistatina.
2. Incubare le cellule a 37 ° C; 5% di CO ₂ fino a raggiungere la piena confluenza in 48 ore.
3. Usando una siringa da 10 ml, prelevare tutta medio dalla piastra e filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron in un tubo da 15 ml.
4. Senza lavare il piatto cellule, aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina (0,25%) e incubare.
5. Quando tutte le cellule si staccano, disattivare la tripsina utilizzando almeno 5 ml DMEM supplementato con 10% FBS e preforme una conta cellulare.
> Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o altro dispositivo cellulare conteggio e calcolare il numero di cellule secondo il metodo di conteggio utilizzato.
NOTA: Sarà usato in seguito al fine di normalizzare la concentrazione CM.
6. Trasferire il CM in un pallone a fondo rotondo vetro e concentrato sotto vuoto spinto evaporatore rotante. Per accelerare il processo, aumentare la temperatura del bagno a 37 ° C, se desiderato. Continuare fino a quando il CM raggiunge una consistenza pastosa.
7. Risospendere il CM da ciascuna piastra di coltura in 400 ml di soluzione salina. Quando si utilizza più di una piastra, utilizzare volume equivalente. Ad esempio, per 2 piastre di coltura, usare 800 ml. Usare ogni piatto per 4 topi.
8. Per confrontare linee cellulari o trattamenti diversi, regolare il volume in base al rapporto cellulare ricevuto al passo 1.6. Ad esempio, se una piastra contiene 1.5x più celle, aggiungere 200 ml di soluzione salina per 400 microlitri pre-esistenti. Questo sarà il regolare CM

title "> 2. ECM-mimico Gel Plug inoculazione in topi

1. Prima di inoculare il gel ECM-mimico in topi, preparare i seguenti materiali:
   1. Crescita fattori ridotti gel ECM-mimico senza fenolo (scongelare una notte, un giorno prima dell'esperimento, a 4 ° C in ghiaccio).
   2. Rasoio elettrico.
   3. Ketamina e xilazina per anestetizzare i topi.
   4. Ice-freddo 1.000 punte microlitri sterili.
   5. Ice-freddo siringa da 1 ml e 27 aghi G.
2. Preparare per ogni mouse una provetta da 1,5 ml Eppendorf contenente 80 microlitri regolati CM e tenere in ghiaccio.
3. Per ogni tubo, aggiungere 600 microlitri di crescita fattori ghiacciate ridotto ECM-mimico gel senza fenolo che è stato scongelato notte a 4 ° C, sul ghiaccio. Il gel ECM-mimico è liquido a 4 ° C e solidifica a temperatura corporea; al fine di impedire il gel ECM-mimico solidificazione, utilizzare 1.000 punte microlitri ghiacciate. Mescolare accuratamente tubi senza formazione di bolle e tenere in ghiaccio.
4. Anestetizzare 6 settimane di età BALB topi / c con ketamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). Confermare l'anestesia corretta in base alla cura degli animali e del comitato istituzionale uso, vale a dire prima di iniziare l'esperimento. Gli animali hanno raggiunto il loro corretto piano di anestesia quando non rispondono più ad una presa punta ferma.
5. Radere la zona addominale dei topi e disinfettare con una chirurgica scrub / alcool.
6. Utilizzare un freddo siringa da 1 ml e un ago 27 G per iniettare il contenuto della provetta sottocutanea Eppendorf. Effettuare l'iniezione molto lentamente per evitare la formazione di bolle. Una volta che tutto il volume viene somministrato, non estrarre l'ago per alcuni minuti, finché non si verifica solidificazione.

3. Valutazione di ECM-mimico Gel Plug vascolarizzazione con ultrasuoni

NOTA: Questa parte del protocollo richiede precedente conoscenza del funzionamento di un sistema di imaging ad ultrasuoni, o l'assistenza di un tecnico autorizzato.

1. Prima di iniziare, avere la fmateriali e strumenti pronti opo:
   1. Rasoio elettrico.
   2. Crema depilatoria.
   3. Ketamina e xilazina per anestetizzare i topi.
   4. Microbolle non mirati.
   5. Dispositivo di attivazione.
   6. Sistema di imaging US compresa una sonda di 708 MHz e 55 un micromanipolatore acquisizione 3D.
2. Misurare vascolarizzazione entro i tappi tre settimane dall'inoculazione:
   NOTA: Nella base di MG-modello animale U-87, tre settimane è stato trovato a rappresentare il punto di tempo ideale per l'imaging. In diverse impostazioni, calibrare cinetiche vascolarizzazione a partire da un paio di giorni dopo l'inoculazione di spine.
   1. Anestetizzare topi utilizzando ketamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). Confermare l'anestesia corretta in base alla cura degli animali e del comitato istituzionale uso, vale a dire prima di iniziare l'esperimento. Gli animali hanno raggiunto il loro corretto piano di anestesia quando non rispondono più ad una presa punta ferma.
   2. Shave ilzona addominale dei topi e trattare con crema depilatoria.
   3. Fissare i topi supinamente sul palco del micro-manipolatore.
   4. Utilizzando una soluzione fisiologica contenente 1 siringa ml e un ago da 30 G, posizionare l'ago dentro la vena della coda, fissare saldamente l'ago e allentare la siringa.
   5. Impostare per la sessione di contrasto 3D in modalità di acquisizione delle immagini:
      1. Premere "3D" per inizializzare la fase del motore 3D e posizionare il trasduttore nel mezzo dell'area di scansione desiderata.
      2. Premere il tasto "3D" e inserire la distanza e passo formato di scansione, quindi premere "Scan".
      3. Assicurarsi che l'intero connettore è stato scansionato nei dati di immagine 3D visualizzati. In caso contrario, regolare il trasduttore in modo che l'intera spina è visibile nella scansione e ripetere il punto 3.5.2.
      4. Premere "Contrasto" e spingere la compensazione del guadagno di tempo (TGC) controlla a sinistra per scurire l'immagine.
   6. Attivare le microbolle con un mixer flaconcino che è designated per l'attivazione di microbolle per 45 sec.
   7. Mescolare in una siringa da 1 ml 50 ml di microbolle con 50 microlitri soluzione salina.
   8. Sostituire la siringa allentata salina contenente con una siringa contenente microbolle attivati. Iniettare le microbolle diluito nella vena della coda di topi, attendere qualche secondo per le bolle di raggiungere uno stato di equilibrio, e quindi acquisire 3D con mdc cine ciclo del tappo, utilizzando il motore di acquisizione 3D:
      1. Premere il tasto "3D" e selezionare "Scan" per acquisire immagini di contrasto-enhanced 3D e quindi premere "Cine Store" per salvare i dati di immagine.
      2. Premere il tasto "3D" e fare clic su "Destroy 3D" per distruggere le microbolle.
      3. Premere "3D" di nuovo e selezionare "Scan" per acquisire un ciclo cine post-distruzione, quindi premere "Cine Store".
   9. Generare la sovrapposizione cornici delle immagini pre e post-distruzione di microbolle:
      1. Nel &# 8220; Impostazioni di riferimento "sul lato sinistro dello schermo fare clic su" Create Reference ".
      2. Premere "Studio Management" per aprire il cine loop pre-distruzione acquisita.
      3. Fare clic su "Processo Cine" per generare la sovrapposizione contrasto verde, quindi fare clic su "Carica Into 3D".
   10. Utilizzare il software di imaging Stati Uniti, al fine di quantificare il conseguente immagine 3D per il volume del sangue all'interno dei tasselli:
       1. Premere il tasto "Scan / Freeze" e poi premere "impostazioni della modalità".
       2. Fare clic su "Volume" e selezionare "parallelo".
       3. Creare un volume 3D del tessuto bersaglio segmentando una serie di contorni.
       4. Fare clic su "Fine" per completare la segmentazione.
          NOTA: Il volume del mezzo di contrasto viene visualizzato sul lato inferiore sinistro dello schermo.
   11. Al termine della procedura, posizionare topi in un ambiente pulito, ambiente caldo, e asciutto tranquilla lontano dalaltri animali. Fornire calore con un pad disponibile in commercio chirurgica riscaldamento o una lampada ad incandescenza (50-75 watt), collocato 12-14 centimetri di distanza da roditore. Monitorare topi continuamente fino mantenere la postura eretta e camminare normalmente.

4. Valutazione della ECM-mimico Gel Plug Vasculature Morfologia Utilizzando fibrata confocale endomicroscopy

NOTA: questa parte del protocollo viene eseguita subito dopo l'imaging US e richiede precedente conoscenza del funzionamento del sistema di imaging fibered endomicroscopy confocale, o l'assistenza di un tecnico autorizzato.

1. Prima di iniziare, i seguenti materiali e strumenti pronti:
   1. Strumenti di chirurgia, come pinze, forbici e filati cucirini assorbibili.
   2. Destrano FITC-coniugato (70 KDa).
   3. Soluzioni di taratura (tre tubi contenenti ciascuno di perossido di idrogeno, acqua o soluzione fluorescente).
   4. Il sistema di imaging esonda adatto per l'imaging dei vasi sanguigni secondo produttore.
2. Anestetizzare topi utilizzando ketamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg).
3. Somministrare iv, attraverso la vena della coda, 200 ml di 10 mg / ml destrano marcato con FITC.
4. Disinfettare la zona addominale con una chirurgica scrub / alcool e applicare una piccola incisione di circa 1 cm dal connettore.
5. Posizionare la sonda endomicroscopy sopra della spina delicatamente mantenendo intatta la spina.
6. Acquisizione:
   1. Una volta che la sonda si trova sul tappo, premere "Start laser" usando il pedale. La fluorescenza deve essere visualizzata sulla schermata.
   2. Acquisire cortometraggi (fino a 30 sec) premendo 'Record' sullo schermo o 'Seleziona' usando il pedale.
   3. Tra i film, lavare la sonda posizionando la punta in una provetta contenente acqua.
   4. Al termine, rimuovere la sonda e pulire la punta con una punta di cotone.
7. Per analizzare media veDiametro ssel:
   1. Fare clic sull'icona "Rileva microvasi" nel pannello superiore per aprire la finestra del modulo rilevamento delle navi.
   2. Fare clic su "Preferenze" e segnare "Mean diametro del vaso" in "Statistica di interesse" e "barre degli istogrammi di visualizzazione" in "modalità di visualizzazione".
   3. Fare clic su "Rileva" per visualizzare le misure selezionate.
8. Per analizzare l'intensità del segnale fluorescente aree adiacenti ai vasi sanguigni:
   1. Clicca su "Crea cerchio ROI" nel pannello di sinistra e creare un cerchio nella zona di interesse.
   2. Fare clic su "istogramma Compute entro ROI" per calcolare i valori relativi a questa regione.

Trattamento 5. post-procedurale di Mice

1. Al termine di ogni procedura di imaging, mettere i topi in un ambiente pulito, ambiente caldo, e asciutto tranquilla, lontano da altri animali. Fornire calore con un in commercio di untermoforo chirurgica alberghi o una lampada ad incandescenza (50-75 W), collocati in 12-14 lontano da roditori. Monitorare topi continuamente fino mantenere la postura eretta e camminare normalmente.
2. Per ulteriori analisi di vascolarizzazione spine 'in momenti addizionali, si applicano le seguenti condizioni di recupero:
   1. Suturare la piccola incisione con punti di sutura riassorbibili.
   2. Dare analgesia topi come buprenorfina (1 mg / kg) per via sottocutanea, e tornare gabbie individuali.
   3. Osservare tutti gli animali per determinare se un ulteriore trattamento analgesico è necessario e rivalutare tutti i giorni per monitorare e valutare per angoscia.
3. Al punto finale dell'esperimento, eutanasia topi applicando dapprima isoflurano, seguita da dislocazione cervicale.
4. Se l'imaging aggiuntivo verrà eseguita nelle settimane successive i passi di imaging iniziali, tutte le procedure devono essere il più sterile possibile. Uno scrub chirurgico pelle deve essere eseguita, wa sterilesuggerimenti ter e cotone sterili dovrebbero essere utilizzati per pulire la sonda endomicroscopy, e la sonda dovrebbe essere disinfettati tra ciascun animale con acqua sterile.

Risultati

Impiantare spine gel ECM-mimico con CM dalla rapida crescita linea di cellule tumorali-angiogenica generazione U-87 MG, si traduce in una vasta angiogenesi. Questo sistema vascolare può essere ampiamente esplorato usando due metodi di imaging complementari.

Le microbolle di contrasto potenziato di imaging US rivela vasta reclutamento di vasi sanguigni funzionali nella spina illustrando vasta flusso di sangue all'interno U-87 MG CM spine caricati, a differenza rilevabile flusso di sangue...

Discussione

Combinando metodi di imaging complementari consente l'acquisizione di informazioni su microvasi densità, funzionalità e morfologia diversi componenti angiogenesi. Caricare CM su spine gel ECM-mimico genera un microambiente tumorale, che è separata da altre popolazioni cellulari, come cellule endoteliali, che vengono assunti e stravaso nella spina.

Eseguendo, in parallelo, microbolle mdc US imaging e fibrata immagini endomicroscopy confocale, possiamo concludere che un pool di fattori ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotary Vacuum Evaporator	-	-	-
Growth-factors reduced phenol-free Matrigel	BD Bioscience	FAL356231	Thaw overnight, at 4 °C on ice
Depilatory cream	-	-	-
Vevo2100 US imaging system	VisualSonics Inc.	-	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
55 MHz 708 probe	VisualSonics Inc.	-	-
Vevo2100 imaging software	VisualSonics Inc.	-	-
VialMix	DEFINITY Imaging	VMIX	-
DEFINITY microbubbles	DEFINITY Imaging	DE4	Activate for 45 sec using VialMix before use
CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)	Mauna Kea Technologies	-	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
ProFlex MiniO/30 probe	Mauna Kea Technologies	-	-
70 kD FITC-labeled dextran	Sigma-Aldrich	46945	-
ImageCell software	Mauna Kea Technologies	-	-
Calibration Kit	Mauna Kea Technologies	-	-
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco Life Tecchnologies	41965-039
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Penicillin/streptomycin/nystatin solution	Biological Industries	03-032-1B