Monitoramento Funcionalidade e Morfologia da vasculatura Recrutado por fatores secretados por geradores de Células Tumorais de crescimento rápido

Resumo

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.). 

Resumo

O ensaio de tampão de Matrigel subcutânea em ratinhos é um método de escolha para a avaliação in vivo dos factores de pro- e anti-angiogénicos. Neste método, os factores desejados são introduzidos em gel de ECM que imitam a frio de líquido que, após a injecção subcutânea, solidifica para formar um ambiente que imita o meio cancro. Esta matriz permite a penetração das células hospedeiras, tais como células endoteliais, e portanto, a formação de vasculatura.

Aqui propomos um novo ensaio de tampão de Matrigel modificado, que pode ser explorada para ilustrar o potencial angiogénico de um conjunto de factores segregados pelas células cancerosas, por oposição a um factor específico (por exemplo, o bFGF e VEGF) ou agente. A ficha contendo gel ECM-mímica é utilizado para introduzir o host (ou seja, mouse) com um pool de fatores secretados para a CM de células de glioblastoma geradoras de tumor de crescimento rápido. Descrevemos previamente uma extensa comparação do potencial angiogénicoU-87 MG de glioblastoma humano e o seu clone de dormente-derivada, neste sistema modelo, que mostra a angiogénese induzida em células U-87 MG parentais. O CM é preparado pela filtragem media recolhidos a partir de placas de cultura de tecido confluente de qualquer linha celular seguintes 48 horas de incubação. Assim, ele contém apenas factores segregados pelas células, sem as próprias células. Aqui descrita é a combinação de duas modalidades de imagiologia, microbolhas de imagiologia de ultra-sons com contraste e intravital endomicroscopy desfibrado-confocal, para, um em tempo real caracterização precisa da extensão, a morfologia e funcionalidade dos vasos sanguíneos recentemente formados dentro das buchas.

Introdução

O ensaio de angiogénese bujão matrigel foi descrita pela primeira vez por Kibbey et al., Em 1992, em que foi utilizado para avaliar a estimulação de angiogénese pelo SIKVAV péptido (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) ^1. Em contraste com outros ensaios in vivo da angiogénese, como o rato da angiogénese da córnea ou de bico ensaios corioalantóicas de membrana, este ensaio é relativamente fácil de realizar ^2. O gel de ECM-mímica injectada pode conter células, pró-angiogénico ou um compostos e / ou factores anti-angiogénicos. Ao avaliar a actividade de um composto anti-angiogénico, o plug normalmente contém uma mistura de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF), e a substância anti-angiogénica pode ser administrada directamente na ficha ou sistemicamente ^{3, 4.}

O gel ECM-mímica é injetado por via subcutânea, onde ela se solidifica em poucos minutos. Avaliação do recrutamento dos vasos sanguíneos no tampão resultante é typically realizada por medição dos níveis de hemoglobina dentro do bujão, através da medição do sinal de fluorescência após a injecção de isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com dextrano, por imunocoloração dos cortes histológicos para marcadores específicos de endoteliais ou por células activadas por fluorescência (FACS) ^{2,5, 6.} No entanto, essa avaliação só permite a análise de ponto final e não tem informações sobre a funcionalidade e morfologia dos vasos sanguíneos. Além disso, as medições de volume de plasma, ou por níveis de hemoglobina ou utilizando dextrano-FITC como um indicador, uma vez que pode ser enganadora teor de sangue é afectada pelo tamanho dos vasos sanguíneos e a extensão de poças de sangue. Isto é especialmente importante quando a vasculatura recrutados é caracterizada pela permeabilidade aumentada e retenção (EPR) efeito ^7.

Nós aqui propor um novo, mais preciso, método de visualização dos vasos sanguíneos recrutados pela combinação de duas modalidades de imagem complementares. Higmicrobolhas h resolução com contraste ultra-som (US), combinados com intravital fibred-confocal endomicroscopy podem fornecer informações não só sobre a densidade dos vasos sanguíneos, mas também na sua morfologia e funcionalidade. Além disso, esta análise pode ser realizada em vários pontos de tempo, permitindo assim a monitorização da cinética da angiogénese. EU é uma modalidade de imagiologia largamente usada, que possui uma elevada resolução espacial para imagiologia de vasos sanguíneos, após administração intravenosa (iv) de injecção de microbolhas que permanecem exclusivamente no compartimento vascular ^8-11. As microbolhas são microbolhas cheias de gás que produzem um sinal ecogénico forte quando excitado com um impulso dos Estados Unidos e, portanto, servir como um bom agente de contraste. Imagens 3D do plugue são adquiridos usando o software sistema de imagem dos EUA após a destruição microbolhas. As imagens resultantes são compostos a partir de quadros de imagem de pré e pós-destruição das microbolhas e reflecte a diferença em intensidade da cor no vídeo. Estes overlayedas imagens são exibidas automaticamente pelo software. Por conseguinte, a percentagem de vasos funcionais dentro do bujão pode ser quantificada. Alta resolução fibered endomicroscopy confocal serve como uma modalidade de imagem complementares através de relatórios sobre a morfologia dos vasos sanguíneos. Neste método minimamente invasivo, as imagens são adquiridas após a administração iv de dextrano conjugado com FITC ^12. O polímero corantes fluorescentes na corrente sanguínea e, portanto, serve como um "agente de contraste" para os vasos sanguíneos morfologia e fluxo sanguíneo. Além disso, uma vez que o polímero é injectado a uma dimensão de 70 kDa, que pode somente cruzar vasos gotejantes como encontrado na vasculatura tumoral. Isto irá resultar em fundo elevado do dextrano marcado com FITC fora dos vasos sanguíneos. Consequentemente, endomicroscopy confocal fibered pode ser usado para visualizar características típicas do efeito EPR em tumor neovasculature- ampliados, de evacuação, os navios altamente emaranhados, com extremidades cegas.

Este modelo de sistema foi descricama na comparação do potencial angiogénico de U-87 MG de glioblastoma humano e o seu clone ¹³ dormente. Vascularização dentro dos tampões foram avaliados três semanas após a inoculação de gel de ECM-mímica. Foi mostrado que a vascularização dentro tampões contendo CM a partir de U-87 MG de crescimento rápido de células geradoras de tumores foi significativamente aumentada em termos de número, densidade e funcionalidade, quando comparada com a vascularização no interior tampões contendo CM a partir das células geradoras de tumores latentes. Assim, os autores foram capazes de concluir que CM isolado a partir de U-87 MG rápido crescimento células geradoras de tumor contém níveis mais elevados de fatores pró-angiogênicos, em comparação com o CM a partir de células geradoras tumorais inativas. Estes factores de estimular a formação de vasos sanguíneos funcionais que afectam positivamente por todos os passos da cascata angiogénica (ou seja, proliferação, brotamento, migração e finalmente, formação de estruturas tubulares de células endoteliais).

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram aprovados e realizados em conformidade com as normas de Tel Aviv University Sackler School of Medicine Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

1. Preparação de meio condicionado

1. Semente de 2 x 10 ⁶ U-87 células MG em uma placa de cultura de 10 centímetros em um volume de 8 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS) e solução de penicilina / estreptomicina / nistatina 1%.
2. Incubar as células a 37 ° C; 5% de CO ₂ até alcançar a confluência completa em 48 horas.
3. Usando uma seringa de 10 ml, retirar todo o meio da placa e filtrar através de um filtro de 0,45 um para um tubo de 15 ml.
4. Sem lavagem da placa de células, adicionar 1 ml de solução de tripsina (0,25%) e incuba-se.
5. Quando todas as células são separadas, inactivar a tripsina usando pelo menos 5 ml de DMEM suplementado com FBS a 10% e uma contagem de células pré-molde.
> Contar o número de células utilizando um hemocitómetro ou outro dispositivo de contagem de células e calcular o número de células de acordo com o método de contagem utilizado.
NOTA: Ele vai ser usado mais tarde, a fim de normalizar a concentração CM.
6. Transferir o CM a um balão de fundo redondo de vidro e concentra-se sob alto vácuo evaporador rotativo. A fim de acelerar o processo, aumentar a temperatura do banho para 37 ° C, se desejado. Continue até que o CM atinge uma textura pastosa.
7. Ressuspender o CM a partir de cada placa de cultura de 400 ul de solução salina. Ao usar mais de uma placa, use volume equivalente. Por exemplo, para duas placas de cultura, 800 ul usar. Usar cada placa para quatro ratinhos.
8. A fim de comparar as linhas celulares diferentes tratamentos ou, ajustar o volume de acordo com a proporção de células recebidas no passo 1.6. Por exemplo, se uma placa de células contém mais 1,5x, adicionar 200 ul de solução salina aos 400 ul de pré-existentes. Este será o CM ajustado

title "> 2. ECM-mímica Gel plug inoculação em camundongo

1. Antes de inocular o gel ECM-mímica em ratos, preparar os seguintes materiais:
   1. -Factores de crescimento reduzida de gel de ECM-mímica livre de fenol (descongelar durante a noite, um dia antes da experiência, a 4 ° C em gelo).
   2. Barbeador elétrico.
   3. A cetamina e xilazina em ordem para anestesiar os ratos.
   4. Ice-frio 1.000 dicas ul estéreis.
   5. Ice-frio seringa de 1 ml e 27 agulhas G.
2. Prepare-se para cada rato de um tubo de 1,5 ml Eppendorf contendo 80 ul ajustados CM e manter em gelo.
3. Para cada tubo, adicionar 600 ul de crescimento-factores geladas reduzida gel de ECM-mímica livre de fenol que foi descongelada durante a noite a 4 ° C, em gelo. O gel de ECM-mímica é líquido em 4 ° C e solidifica a temperatura corporal; a fim de evitar que o gel de ECM-mímica de solidificação, usar 1000 dicas ul geladas. Misture cuidadosamente tubos sem formar bolhas e manter em gelo.
4. Anestesiar 6 semanas de idade BRatinhos ALB / c usando cetamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). Confirme anestesia adequada de acordo com o atendimento institucional animais e comissão uso, ou seja, antes do início do experimento. Os animais têm atingido o seu bom plano de anestesia quando eles não respondem mais a uma pitada dedo do pé firme.
5. Raspar a área abdominal dos ratos e desinfetar usando uma paramentação / álcool.
6. Usar uma solução fria de 1 ml e uma agulha de seringa de 27 G para injectar o conteúdo do tubo Eppendorf subcutaneamente. Realizar a injecção muito lentamente para evitar a formação de bolhas. Uma vez que todo o volume é administrado, não ejetar a agulha durante vários minutos, até que a solidificação ocorre.

3. Avaliação da ECM-mímica Gel plug vascularização com ultra-som

NOTA: Esta parte do protocolo exige conhecimento prévio do funcionamento de um sistema de imagens de ultra-som, ou a assistência de um técnico autorizado.

1. Antes de começar, tem a fmateriais e instrumentos imediata epois:
   1. Barbeador elétrico.
   2. Creme depilatório.
   3. A cetamina e xilazina em ordem para anestesiar os ratos.
   4. Microbolhas não-alvo.
   5. Dispositivo de ativação.
   6. Sistema de imagem dos EUA, incluindo um 55 MHz 708 sonda e uma micromanipulator aquisição 3D.
2. Medir vascularização dentro das velas de três semanas após a inoculação:
   NOTA: No modelo animal U-87 à base de MG, três semanas foi encontrado para representar o ponto de tempo ideal para a imagem latente. Sob diferentes configurações, calibre cinética vascularização a partir de alguns dias após a inoculação de plugs.
   1. Anestesiar ratos usando cetamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). Confirme anestesia adequada de acordo com o atendimento institucional animais e comissão uso, ou seja, antes do início do experimento. Os animais têm atingido o seu bom plano de anestesia quando eles não respondem mais a uma pitada dedo do pé firme.
   2. Raspar aárea abdominal dos ratos e tratar com creme depilatório.
   3. Fixar os ratinhos passivamente na fase do micro-manipulador.
   4. Usando uma agulha de 30 a G 1 ml seringa contendo soro fisiológico e, colocar a agulha no interior da veia da cauda, ​​fixar firmemente a agulha e solte a seringa.
   5. Configurar para a sessão de contraste modo 3D de aquisição de imagem:
      1. Pressione "3D" para iniciar a fase do motor 3D e posicionar o transdutor no meio da zona de varrimento desejada.
      2. Pressione o botão "3D" e insira a distância e passo tamanho da digitalização, clique no botão "Scan".
      3. Certifique-se de que toda a ficha foi feita a varredura nos dados de imagem em 3D exibidos. Se não, ajuste o transdutor de modo que toda a ficha é visível na digitalização e repita o passo 3.5.2.
      4. Pressione "Contraste" e empurre a compensação de ganho de tempo (TGC) controles para a esquerda para escurecer a imagem.
   6. Ative as microbolhas usando um mixer frasco que é designated para a activação de microbolhas durante 45 seg.
   7. Misturar em uma seringa de 1 mL 50 uL de microbolhas com 50 ul de solução salina.
   8. Substituir a seringa afrouxada contendo solução salina com uma seringa contendo microbolhas activados. Injectar as microbolhas diluído na veia da cauda dos camundongos, aguarde alguns segundos para que as bolhas de atingir um estado de equilíbrio, e, em seguida, adquirir laço cine 3D com contraste do plugue, usando o motor de aquisição em 3D:
      1. Pressione o botão "3D" e selecione "Scan" para adquirir imagens de realce 3D e, em seguida, pressione "Cine Store" para salvar os dados de imagem.
      2. Pressione o botão "3D" e clique em "Destruir 3D" para destruir as microbolhas.
      3. Pressione o botão "3D" novamente e selecione "Scan" para adquirir um loop de cine pós-destruição, em seguida, pressione "Cine Store".
   9. Gerar a sobreposição de quadros de imagem pré e pós-destruição das microbolhas:
      1. No &# 8220; Configurações de referência "no lado esquerdo da tela, clique em" Criar de Referência ".
      2. Pressione "Gestão de Estudo" para abrir o ciclo cine pré-destruição adquirido.
      3. Clique em "Cine Processo" para gerar a sobreposição contraste verde, em seguida, clique em "carregar em 3D".
   10. Use o software de imagem dos EUA, a fim de quantificar a imagem 3D, resultando em volume de sangue dentro dos plugues:
       1. Pressione "Scan / Freeze" e pressione "Configurações de modo".
       2. Clique em "Volume" e selecione "paralelo".
       3. Criar um volume 3D do tecido alvo através da segmentação de uma série de contornos.
       4. Clique em "Finish" para concluir a segmentação.
          NOTA: O volume do agente de contraste será exibido no lado inferior esquerdo da tela.
   11. No final do procedimento, coloque camundongos em um ambiente acolhedor, limpo, seco e tranquila, longe deoutros animais. Fornecer o calor usando uma almofada disponível comercialmente cirúrgico aquecimento ou uma lâmpada incandescente (50-75 watt), colocado 12-14 centímetros de distância do roedor. Monitorar ratos continuamente até manter a postura ereta e andando normalmente.

4. Avaliação de ECM-mímica Gel plug Vasculature Morfologia Usando Fibered confocal Endomicroscopy

NOTA: esta parte do protocolo é realizada imediatamente após imaging US e que exige conhecimento prévio de operar o sistema de imagem endomicroscopy confocal desfibrado, ou a assistência de um técnico autorizado.

1. Antes de começar, tem os seguintes materiais e instrumentos prontos:
   1. Equipamentos para a cirurgia, como pinças, tesouras e linhas de costura absorvíveis.
   2. Dextrano FITC-conjugada (70 KDa).
   3. Soluções de calibração (três tubos, cada um contendo peróxido de hidrogênio, água ou solução fluorescente).
   4. O sistema de imagem e umasonda adequada para geração de imagens de vasos sanguíneos acordo com o fabricante.
2. Anestesiar ratos usando cetamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg).
3. Administrar iv, através da veia da cauda, ​​a 200 ul de 10 mg / mL de dextrano marcado com FITC.
4. Desinfectar a área abdominal usando uma paramentação / álcool e aplique uma pequena incisão de aproximadamente 1 cm da ficha.
5. Coloque a sonda endomicroscopy no topo do tampão suavemente, mantendo o bujão intacta.
6. Aquisição:
   1. Uma vez que a sonda está definido na ficha, pressione "Iniciar a laser", usando o pedal. A fluorescência deve ser mostrado na tela.
   2. Adquirir filmes curtos (até 30 segundos) pressionando 'Record' no ecrã ou 'Select' usando o pedal.
   3. Entre os filmes, lavar a sonda colocando a ponta em um tubo contendo água.
   4. Quando terminar, retire a sonda e limpe a ponta com uma ponta de algodão.
7. Para analisar média vediâmetro SSEL:
   1. Clique no ícone "Detectar microvasos" no painel superior para abrir a janela do módulo de detecção de navios.
   2. Clique em "Preferências" e marcar "o diâmetro dos vasos Mean" na "estatística de interesse" e "Mostrar barras do histograma" no "Modo de exibição".
   3. Clique em "Detectar" para exibir as medições selecionadas.
8. Para analisar a intensidade do sinal fluorescente em áreas adjacentes aos vasos sanguíneos:
   1. Clique em "Criar círculo ROI" no painel esquerdo e criar um círculo na área de interesse.
   2. Clique em "histograma Compute dentro ROI" para calcular os valores relativos a esta região.

5. O tratamento pós-procedimento de Ratos

1. No final de cada procedimento de imagem, coloque camundongos em um ambiente acolhedor, limpo, seco e tranquila, longe de outros animais. Fornecer o calor usando um comercialmente-available almofada de aquecimento cirúrgica ou uma lâmpada incandescente (50-75 W), colocado em 12-14 longe de roedor. Monitorar ratos continuamente até manter a postura ereta e andando normalmente.
2. Para uma análise mais aprofundada da vascularização "plugs em pontos de tempo adicional, aplicam-se as seguintes condições de recuperação:
   1. Suturar a incisão pequena com fios absorvíveis.
   2. Proporcionar analgesia ratos, tais como buprenorfina (1 mg / kg), por via subcutânea, e de regresso para gaiolas individuais.
   3. Respeite todos os animais para determinar se a continuação do tratamento analgésico é necessário e re-avaliar diariamente para monitorar e avaliar para a aflição.
3. No ponto final da experiência, os ratinhos eutanásia por primeiro aplicar isoflurano, seguido por deslocação cervical.
4. Se imagens adicionais serão realizadas nas semanas seguintes os passos iniciais de imagem, todos os procedimentos devem ser mantidos tão estéril quanto possível. A paramentação pele deve ser realizada, wa estériltro e algodão estéril pontas devem ser utilizados para limpar a sonda endomicroscopy, e a sonda deve ser desinfectado entre cada animal utilizando água estéril.

Resultados

Implantar plugs gel ECM-mímica com CM de rápido crescimento linha de células geradoras de tumor angiogênico U-87 MG, resulta em grande angiogênese. Este vasculatura pode ser amplamente explorado utilizando dois métodos de imagem complementares.

Microbubbles imaging US contrastado revela grande recrutamento de vasos sanguíneos funcionais no plugue, ilustrando grande fluxo de sangue dentro de U-87 MG CM plugs carregados, em oposição ao fluxo de sangue indetectável dentro fichas conte...

Discussão

Combinando métodos de imagens complementares permite a obtenção de informações sobre os diferentes componentes da angiogênese 'microvasos densidade, funcionalidade e morfologia. Carregando CM em tampões de gel ECM-mímica gera um microambiente tumoral, que está separado de outras populações de células, como as células endoteliais, que são recrutados e extravasar para a ficha.

Ao realizar, em paralelo, microbolhas de imagem dos EUA com contraste e fibered imaging endomicrosco...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rotary Vacuum Evaporator	-	-	-
Growth-factors reduced phenol-free Matrigel	BD Bioscience	FAL356231	Thaw overnight, at 4 °C on ice
Depilatory cream	-	-	-
Vevo2100 US imaging system	VisualSonics Inc.	-	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
55 MHz 708 probe	VisualSonics Inc.	-	-
Vevo2100 imaging software	VisualSonics Inc.	-	-
VialMix	DEFINITY Imaging	VMIX	-
DEFINITY microbubbles	DEFINITY Imaging	DE4	Activate for 45 sec using VialMix before use
CellVizio (Fibered confocal endomicroscope)	Mauna Kea Technologies	-	Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician
ProFlex MiniO/30 probe	Mauna Kea Technologies	-	-
70 kD FITC-labeled dextran	Sigma-Aldrich	46945	-
ImageCell software	Mauna Kea Technologies	-	-
Calibration Kit	Mauna Kea Technologies	-	-
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco Life Tecchnologies	41965-039
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Penicillin/streptomycin/nystatin solution	Biological Industries	03-032-1B