Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo

Resumen

Medición del coeficiente de permeabilidad al agua osmótica (P _f) de las células puede ayudar a entender los mecanismos de regulación de las acuaporinas (AQPs). Determinación _f P en protoplastos de células vegetales esféricas presentados aquí implica protoplastos aislamiento y análisis numérico de su tasa inicial de cambio de volumen como resultado de un desafío osmótica durante la perfusión baño constante.

Resumen

El estudio de los mecanismos de regulación AQP es crucial para la comprensión de las relaciones de agua, tanto en el celular y el conjunto de los niveles de la planta. Se presenta aquí un método sencillo y muy eficaz para la determinación del coeficiente de permeabilidad osmótica de agua (P _f) en protoplastos de plantas, aplicable en principio también a otras células esféricas tales como oocitos de rana. El primer paso del ensayo es el aislamiento de protoplastos a partir del tejido vegetal de interés por digestión enzimática en una cámara con una solución isotónica adecuada. El segundo paso consiste en un ensayo de desafío osmótica: protoplastos inmovilizados en la parte inferior de la cámara están sometidos a una partida de perfusión constante con una solución isotónica y seguido por una solución hipotónica. La hinchazón celular es el vídeo grabado. En el tercer paso, las imágenes se procesan en línea para producir cambios de volumen, y el curso temporal de los cambios de volumen se correlaciona con la evolución en el tiempo del cambio en osmoladad del medio de perfusión cámara, usando un procedimiento de ajuste de curvas por escrito en Matlab (el 'PfFit'), para producir P _f.

Introducción

La absorción de agua y el flujo a través de las membranas celulares es un requisito fundamental para la existencia de plantas, tanto en el celular y el conjunto de los niveles de la planta. A nivel celular, las acuaporinas (AQPs) juegan un papel clave en la regulación del coeficiente de permeabilidad al agua osmótica (P _f) de la membrana celular ^1-3.

Hasta la fecha, varios métodos han sido empleados en la medición de la P _f endógena de protoplastos de diferentes órganos de la planta (es decir, raíces, mesófilo, endodermis, etc., Revisado por Chaumont et al. ^4). Uno de los enfoques para medir P _f es exponer los protoplastos a un desafío osmótica y para monitorear la tasa inicial de su cambio de volumen (es decir., La pendiente de la fase lineal inicial de la variación de volumen). Dos métodos diferentes se han descrito anteriormente sobre la base de este enfoque, tanto basados ​​en un intercambio instantáneo de soluciones. La primera de ellas consiste en immobilizing la de protoplastos con una micropipeta de succión y cambiar el flujo de la solución ⁵ y el segundo de transferir la de protoplastos a partir de una solución a otra utilizando una micropipeta ^6. Estos métodos de transferencia de aspiración micropipeta y micropipeta, que permiten la adquisición de imágenes en el comienzo mismo del intercambio solución rápida (para capturar la fase lineal inicial de cambio de volumen), probablemente involucre a un estrés físico de protoplastos y requieren equipo especializado y micromanipulación experto.

El método aquí descrito minimiza la perturbación a las células, no implica ningún micromanipulación y permite la derivación de P _f cuando el baño de perfusión no es instantánea.

Después de la digestión enzimática, los protoplastos, sumergidas en una solución isotónica, se inmovilizan en la parte inferior cubreobjetos de vidrio de un plexiglás (también conocido como Lucite o plexiglás) por cámara de interacción de carga. Luego, durante un baño de perfusión constante,la solución isotónica es arrastrada por una solución hipotónica generar un desafío hipoosmótica a los protoplastos. La hinchazón de la protoplastos es de vídeo grabada y luego, mediante la combinación de la información sobre el curso temporal de la perfusión de baño y el curso temporal de la inflamación celular, la P _f está determinada por el procesamiento de imágenes y los procedimientos de ajuste de curvas.

Las ventajas de este método son que el experimento es muy eficiente, es decir, es posible supervisar unas pocas células simultáneamente en un único ensayo, y que no requiere equipos especiales o particulares habilidades de micromanipulación. Varias aplicaciones para este método son posibles. Por ejemplo, la determinación de la P _f nativa de una variedad de células de diferentes tejidos y plantas, tales como mesófilo y el paquete células de la vaina de la hoja de Arabidopsis ^7, el maíz mesófilo de la hoja o células de la corteza de la raíz ^8-10 o suspensión células cultivadas ^11,12. En additien adelante, es posible determinar P _f de las células animales tales como células esféricas ¹¹ ovocitos. Otro ejemplo involucra la evaluación de la actividad AQP por la expresión transitoria de su gen en los protoplastos (o cualesquiera otros genes que puedan afectarles; por ejemplo, genes de quinasas) y determinación de su contribución a P _f; por ejemplo, la expresión de tomate AQP SlTIP2; 2 de Arabidopsis en protoplastos de mesófilo de transformación PEG y la determinación de la SlTIP2; P 2 relacionada con _f ^13. Finalmente, el examen del efecto sobre P _f de diferentes moléculas / sustancias (fármacos, hormonas, etc) que se añade a las soluciones también se puede examinar, por ejemplo, del bloqueador de AQP HgCl ₂ ^7.

El siguiente protocolo describe el aislamiento de protoplastos de células y determinación de su P _f Arabidopsis mesófilo.

Protocolo

1 Preparación de Soluciones

1. Preparar isotónico (600 mOsm) y hipotónica (500 mOsm) soluciones que contienen 10 mM de KCl, 1 mM CaCl _2, y 8 M 2 (N-morfolina) -ethanesulphonic ácido (MES), pH 5,7 y ajustar la osmolaridad con las cantidades apropiadas de D-sorbitol: 540 mM para la isotónica y 440 mM de la solución hipotónica. Verificar la osmolaridad de la solución (a menos de 3% del valor objetivo) usando un osmómetro.
2. Preparar una pasta seca de "mezcla enzimática 'que contiene las siguientes enzimas: 0,55 g de celulasa, pectoliasa 0,1 g, 0,33 g de polivinilpirrolidona K 30, 0,33 g de BSA (véase la Tabla 1 a continuación), mezclar el polvo seco por vórtice, hacer alícuotas de 5,7 mg y almacenar a -20 ° C.

2 Aislamiento de protoplastos de Arabidopsis mesófilo

1. Preparar una placa de Petri (10 cm) con aproximadamente 6 gotas (aprox. 30 l cada una) de solución isotónica.
2. Pelar las abaxial epidermis (inferior) de la hoja de Arabidopsis, cut la hoja pelada en cuadrados de unos 4 x 4 mm ^2, a continuación, colocar los cuadrados de la solución isotónica cae con el lado abaxial expuesto abajo, tocando la solución.
3. Disolver 5,7 mg de la mezcla de enzimas en 165 l solución isotónica (3,3% w / w) en un tubo de 1.5 ml, mezclar suavemente con la pipeta por un minuto más o menos hasta que se disuelva, y colocar varias gotas similares de la solución enzimática en el mismo Petri plato.
4. Transfiera los trozos de hojas en la solución enzimática gotas, cierre el sellado de la tapa de la placa con una ronda de parafilm y se incuba durante 20 min, flotando el plato en un baño de agua a 28 ° C.
5. Añadir varias gotas más de la solución isotónica al plato (2 gotas por cada enzima gota solución). Transferencia de cada pieza de la hoja a una nueva gota solución isotónica, entonces, de forma secuencial, a una segunda gota (para lavar la solución enzimática de distancia). Levante la pieza por el borde con unas pinzas, agitar en la segunda caída (como una bolsa de té) para liberar los protoplastos.Recoger las gotas con los protoplastos (usando una punta de pipeta 100 l recortada) en un tubo de 1,5 ml.

3. La hipotónica Desafío Ensayo: Hinchazón Cell Arabidopsis mesófilo

1. Preparar el sistema de perfusión (Figura 1A) rellenando una columna con la solución isotónica y otra columna con la solución hipotónica. Abrir la válvula, dejar que un flujo de solución (la primera hipotónica, entonces el isotónica) para llenar el tubo de todo el camino hasta el colector de entrada (Figura 1B). Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas, y luego cerrar la válvula.
2. Sellar un cubreobjetos, utilizando grasa de silicona (Tabla 1), para hacer un fondo para la cámara dentro de la diapositiva de plexiglás (Figura 1B; véase también los esquemas de la cámara en la Figura 1C). Para hacer que el fondo de la cámara (la que mira hacia arriba superficie expuesta de la cubreobjetos dentro del anillo de grasa) "pegajosa" para protoplastos, el escudocon sulfato de soporte de carga positiva-protamina (1% en agua, Tabla 1) o poli-L-lisina (0,1% en agua; Tabla 1). Extienda esta 'pegamento' sobre el cubreobjetos usando una punta de pipeta, espere 1 - 2 min, enjuagar 3 - 4 veces con la solución isotónica y agitar lejos la solución restante.
3. Llene la cámara de arriba con la solución isotónica. A continuación, añadir una gota de solución de protoplastos que contienen a la cámara, usando una punta de pipeta recortado y espere 3 - 4 min durante los protoplastos se asienten. Cubra la cámara con una cubierta transparente (figuras 1D, 1E) tocar la superficie de la solución (evitar atrapar burbujas de aire por debajo).
4. Coloque la corredera (con cuidado!) En una mesa de microscopio invertido, conectarlo al sistema de perfusión y la bomba (para protegerlos contra las burbujas de aire en el tubo!) Y encienda el flujo de la solución isotónica para la perfusión constante a 1 ml / min (tasas más rápidas se puede utilizar, hasta 4 ml / min).
5. Para la grabaciónlos cambios de volumen, se utiliza un microscopio invertido, con un objetivo de 20X y con una cámara de vídeo CCD conectada a un ordenador PC. Utilice el plugin 'CMU 1394 Camera Driver' del software ImageJ (ver la Tabla de materiales específicos para las direcciones de descarga de estas dos piezas de software) para grabar una película de vídeo de 60 segundos de protoplastos inmóviles seleccionados (presumiblemente, los atrapados en el fondo) a una velocidad de 1 image / seg (1 Hz). Inicie la grabación con un lavado de 15 segundos de la solución isotónica (esto constituye la línea de base), cambiar a la solución hipotónica durante 45 segundos (para completar un total de 60 segundos desde el inicio de la perfusión). Guardar la película en formato TIF. NOTA: Elija un campo de visión con tantas células como sea posible, el cumplimiento de los siguientes criterios: forma esférica y con un contorno celular bien enfocado en su mayor perímetro (Figura 2A).

4. Análisis de la variación del volumen celular de uso de ImageJ

NOTA: Para analizar laserie de imágenes de una célula de la hinchazón, use el 'Explorador de imágenes' y 'plugins Protoplasto Analyzer' en el software ImageJ (escrito por Xavier Draye) ^14. A partir de los protoplastos elegidos en su primer punto de tiempo, el plug-in 'de protoplastos Analizador' detectará automáticamente los bordes protoplastos (contornos) y calcular la evolución temporal de sus áreas durante el experimento (los plugins están disponibles con el programa de análisis PfFit, a continuación) .

1. Iniciar ImageJ. Para abrir la película, haga clic en "Archivo" en el panel de ImageJ, a continuación, de forma consecutiva en los menús desplegables medida que se desarrollan: "Importar" y luego "Explorador de imágenes". Resalte la película elegida, a continuación, haga clic en él, a continuación, haga clic izquierdo sobre 'Protoplasto Analizador'. Navegar a través de la película (mediante un control deslizante en la imagen inferior protoplasto) para identificar protoplastos que permanecen prácticamente inmóviles durante el experimento - éstos serán analizados. De vuelta en la primera image, con el ratón, dibuje círculos (recogidos de las herramientas de dibujo ImageJ) alrededor de los protoplastos seleccionados (Figura 2B), a continuación, haga clic en "Aceptar" en la tabla "parámetros de detección" que aparecían.
2. Para iniciar el algoritmo de detección de protoplastos, haga clic en 'local' en el panel superior de la imagen de protoplastos, a continuación, "Proceso" en el menú desplegable. Examine los círculos verdes alrededor de los protoplastos seleccionados (Figura 2 C) a lo largo de la película. Guarde el 'resultado' en un archivo de Excel. Salir ImageJ. NOTA: En caso de que aparezca un punto rojo (para indicar un mal ajuste de contorno - por lo general debido a un contraste de imagen pobre), vuelva a ejecutar con diferentes parámetros.
3. Para separar las líneas pertenecientes a cada celda (que - si se analizaron simultáneamente dos o más células - se entrelazan, porque el análisis se realiza fotograma a fotograma), en Excel, ordenar los datos guardados por la columna del número de células ("objeto" ).
4. Para determine el factor de conversión de píxel a m para obtener el valor real de P _f, snap una imagen de un gobernante micrómetro mediante el mismo objetivo 20X microscopio. Arrastre una línea (extraído desde las herramientas de dibujo ImageJ) a lo largo de la imagen regla y leer el número de píxeles equivalente a la longitud de la regla en la parte inferior del panel principal ImageJ. Convertir los valores del área de píxeles arbitrarias en el archivo de Excel en m ^2. Guarde el curso zonas de tiempo (para cada celda por separado) como un archivo de texto (dos columnas de números solamente). NOTA: Este será un insumo para el programa 'PfFit' volumen ajustado.

5. Modelado de la Tasa de Cambio osmolaridad en la Sala Experimental Usando ImageJ y la _f Fit Matlab Programa P

1. Añadir 2 mg cianol xileno (Tabla 1, a continuación) a 100 ml de la solución isotónica (para producir el "Indicador de tinte ').
2. Prepare el sistema de perfusión (como en 3.1) con el indicador de Dye y la h no teñidossolución ypotonic.
3. Sellar una hoja de cubierta con grasa de silicona a la parte inferior de la cámara de plexiglás, a continuación, rellene suavemente la cámara con el Indicador de Dye, cúbralo con una hoja de cubierta (al igual que con los protoplastos antes) y colocarlo en la platina del microscopio.
4. Conecte la cámara al sistema de perfusión y la bomba, y encienda el flujo Indicador de tinte para una perfusión constante en l ml / min.
5. Grabar una película de 60 segundos a una velocidad de 1 Hz. Inicie la grabación con 15 segundos de Indicador Dye, cambiar a la solución hipotónica durante 45 segundos. Dejar de filmar. Lave con el Indicador de tinte (por lo menos durante 30 segundos), a continuación, iniciar una nueva película. Repetir unas 5 - 6 veces y guardar todas las películas
6. Utilice el software ImageJ para analizar las imágenes de vídeo de la transmitancia Indicador de tinte para obtener un transcurso de tiempo promedio de la transmitancia de cambio.
   1. Iniciar ImageJ, haga clic en "Archivo" y, a continuación, 'Open', y navegar por la película. Para cada película, dibujar un 10 píxeles de ancho vertical,rectángulo en cualquier parte de la imagen 1 ^st de la película. Haga clic en "Imagen" en el panel principal ImageJ, a continuación, haga clic en "Recortar" en el menú desplegable.
   2. Para alinear los 60 cuadros (de la película 60 segundos) en una fila, haga clic de nuevo 'Imagen', a continuación, en forma consecutiva en los menús desplegables medida que se desarrollan: "Pilas" y "Haz Montage '(columnas 60, filas 1). Dibuje un 1 píxel alta rectángulo horizontal en cualquier lugar a lo largo de toda la fila de imágenes y haga clic en "Analizar" en el panel principal ImageJ, a continuación, haga clic en el perfil de parcela 'en el menú desplegable. NOTA: A 'Parcela de Montage "ventana aparecerá (no se muestra), y una lista de datos de transmitancia se pueden abrir desde el menú. Cada imagen de la película está representado en esta lista por 10 valores de transmitancia originarios de su amplio rectángulo de 10 píxeles y en consecuencia la "base de tiempos" (el número secuencial de la imagen) es 10 veces más.
   3. Copie las listas del dat transmitanciaa (una lista por película) a un archivo de Excel. La media de los cursos de tiempo de transmitancia obtenidos de las varias películas de los rubores Indicador Dye. Generar una base de tiempo real, multiplicando el número secuencial de la imagen en un 0,1. Guarde el curso del tiempo promedio (dos columnas) a un archivo de texto. NOTA: Antes de promedio, si se desea, trazar los cursos de tiempo individuales, de rechazar cualquier irregularidad. Asegúrese de que la película incluye al menos 5 final sec de la transmitancia en estado estacionario del indicador Dye.
7. Inicie el programa de ajuste P _f Fit Matlab (el panel 'Indicador Fit', Figura 3) para calcular los distintos parámetros de la evolución temporal de la osmolaridad. NOTA: en base a las concentraciones iniciales y finales conocidos de la solución en el baño, el curso temporal del cambio de concentración osmótica de la solución se calcula a partir de la evolución en el tiempo de concentración (calculado, a su vez, a partir de la transmitancia Indicador de tinte), suponiendo que sigue la misma dinámica que laconcentración de colorante. P _f Fit es un programa disponible para su uso de forma gratuita. El 'PfFit_Installer_web.exe' se puede descargar desde: P _f Guía de compatibilidad usuario con explicaciones detalladas y definiciones es accesible a través de Jove como un archivo suplementario, lo que ayuda a familiarizar al usuario con el programa Fit P _f.
8. En el panel 'Indicador Fit', importar los datos de la evolución en el tiempo promedio de la transmitancia Indicador Tinte ('archivo de datos Indicador', Figura 3A) e introducir manualmente los parámetros del experimento actuales y las estimaciones iniciales de los parámetros 'width' y ' t_half 'que describe la evolución temporal de la concentración del tinte indicador (Figura 3B. Haga clic en "Ejecutar" para ver las parcelas de la evolución temporal de la concentración del tinte indicador (datos reales y en forma, la figura 4A), y de la calculada baño de modelado () osmolaridad (Figura 4B). NOTA: agood ajuste a los datos es esencial (una recomendación: comenzar con los valores que se muestran en la Figura 3).

6. Determinación del P _f utilizando el programa de ajuste de P _f Fit Matlab

NOTA: Además de los supuestos básicos en relación con el comportamiento de un protoplasto como un verdadero y perfecto osmómetro ^11, la determinación de P _f se basa en la presunción de que P _f puede cambiar con el tiempo, que esta dinámica de P _f subyace el tiempo curso del cambio de volumen de células y que tres parámetros son suficientes para describirlo: P _fi (el valor inicial de P _f), Pendiente _Pf (la tasa del cambio lineal de P _f) y de retardo (el periodo desde el inicio de la bañera cambio de la osmolaridad hasta el inicio del cambio de volumen celular). Diferentes modelos pueden ser probados, incluyendo diferentes combinaciones de estos parámetros y sus valores, incluyendo los valores nulos ^11. P _{f Fit busca la mejor combinación de estos parámetros para producir - mediante cálculo - la reproducción más fiel del transcurso de tiempo experimental del cambio de volumen de la celda ^11, calculado, a su vez, de la serie importada de las áreas de células de contorno (véase También la 'P f Guía de compatibilidad usuario Suplementario).}

1. Cámbiese al panel 'Volumen Fit' (Figura 5). Elija para importar el archivo de áreas de datos (el archivo de texto con el transcurso del tiempo de las "áreas" de los protoplastos analizados, la figura 5A). Elija 'Última Indicador de montaje' como fuente de parámetro (Figura 5B; ver la 'P _f Guía de ajuste del usuario de alternativas). NOTA: Estos parámetros (Figura 5D) sirven entonces para regenerar el cambio osmótico en el baño para los volúmenes procedimiento de ajuste.
2. En el panel de 'Volumen Fit' (Figura 5C), inicializar (rellenar las conjeturas iniciales para los parámetros _F) P: P _f, Pendiente _Pf y Delay (una recomendación: comenzar con 1, 1, y 30, respectivamente), eligió el modelo 'Clase' (una recomendación: comenzar con la Segunda y la marca 'cheques' para los tres parámetros que se instalen). Haga clic en "Ejecutar", y luego calcular visualmente la cifra provisional (Figura 5E) y ajustar el parámetro de retardo y la longitud del registro, si es necesario.
3. Examine la gráfica resultados (Figura 6) para evaluar la calidad apta y registrar el error en forma. Cambie los parámetros de inicialización de algunas Dobla cada una, y re-'Run '. NOTA: No se desanime cuando el programa se atora - simplemente reinicie el programa!
4. Repita este procedimiento varias veces, a partir de diferentes combinaciones de parámetros de inicialización, el objetivo para el valor más bajo del error de ajuste.
5. Copiar la lista de los resultados de ajuste directamente desde la pantalla, o encontrarlos en tél PfFit-generó archivo '_FIT_Vol_Results.txt'.

Resultados

Con el fin de determinar el P _f y comparar la actividad de diferentes AQPs, se utilizan protoplastos de mesófilo de la hoja de Arabidopsis. Se encontró que estos protoplastos a tener bajos basal (fondo) los niveles de P _f ⁷ y pueden servir como un sistema funcional-expresión para permitir mediciones P _f reproducibles.

Se aislaron protoplastos de una hoja madura de una planta Arabidopsis 6 semanas de edad y tres genes construye con genes de Arabi...

Discusión

Descrito aquí es un procedimiento sencillo y muy eficaz para medir la P _f de protoplastos de plantas aisladas, aplicable en principio también a otras células esféricas, por ejemplo., Oocitos de rana ^11. Este método se basa en la medición de la P _f en respuesta a un desafío osmótica de la célula. En contraste con los otros métodos basados ​​en este enfoque, sin embargo, el cambio de soluciones, es decir, de la osmolaridad, no es instantánea, pero gradual, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl	Chem-Impex International	01247-1	http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade
CaCl2	Merck	11718006	http://www.merck.com Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)	Sigma	15152002	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
D-Sorbitol	Sigma	18032003	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
Cellulase	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS002603	http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase	Karlan,               Phonix, AZ, USA	8006	http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)	Sigma	81420	http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418-5G	http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate	Sigma	P4380	http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920	http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol	Sigma	X4126	http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy	Merck	107921	https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100/TS100F	http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump	BIO-RAD	EP-1 Econo Pump	http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera	Scion Corporation	CFW-1308M	http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ	Carnegie Mellon		http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit	BIO-RAD	731-9006	http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold	DirectMed		http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns)	Welford	IF-BR-001	http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing	TYGON	R-3603	http://www.usplastic.com
Plexiglass slide etc.	Perspectiv		http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'.
3M packaging Scotch tape 1'', clear	Viking Industrial, UK	VKMONO25	http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK