Измерение осмотического водопроницаемость Коэффициент (P<sub&gt; F</sub&gt;) Из сферических ячеек: изолированные протопласты растений в качестве примера

Резюме

Измерение осмотического коэффициента водопроницаемости (P _F) клеток может помочь понять механизмы регулирования аквапоринов (AQPs). Р определение _F в сферических протопластов клеток растений, представленных здесь, включает в себя изоляцию протопластов и численный анализ их начальной скорости изменения объема в результате осмотического вызов во время постоянной ванны перфузии.

Аннотация

Изучение механизмов регулирования Aqp имеет решающее значение для понимания водных отношений в оба сотовой и целых уровней растений. Представленные здесь является простым и очень эффективным способом для определения осмотического коэффициента проницаемости воды (Р _F) в протопластов растений, в принципе применимо и к другим сферических клеток, таких как лягушки ооцитов. На первом этапе анализа является выделение протопластов из растительной ткани интереса ферментативным расщеплением в камеру с соответствующим изотонического раствора. Второй этап состоит из осмотической вызов теста: протопласты иммобилизованные на дне камеры представляются постоянной перфузии, начиная с изотоническим раствором, а затем гипотонического раствора. Ячейка опухоль видеозаписи. На третьем этапе, изображения обрабатываются сообщение с получением изменения объема, и временной ход изменения объема коррелирует с течением времени изменения osmolaпасности камеры перфузии среды, используя кривую процедуру подгонки написанный на Matlab ('PfFit'), чтобы получить _Рр.

Введение

Поглощение воды и поток через клеточные мембраны является фундаментальным требованием для существования растений на клеточном и целых уровней растений. На клеточном уровне, аквапорины (AQPs) играют ключевую роль в регуляции осмотического коэффициента проницаемости воды (Р _е) клеточной мембраны ^1-3.

На сегодняшний день, несколько методов были использованы при измерении эндогенного _Рр протопластовой из разных органов растений (т.е. корни, мезофилл, эндодерме, и т.д.., Отзывы на Шомон и др. ^4). Один из подходов для измерения _Рр является разоблачить протопластов в осмотического вызов и контролировать начальную скорость изменения объема (т.е.., Наклон начале линейной фазы изменения объема). Два различных метода были описаны ранее на основе этого подхода, как на основе мгновенного обмена решений. Первый состоит из immobilizчисле протопласта с всасывающим микропипетки и переключение поток раствора ⁵ и вторую передачи протопласта из одного раствора в другой с помощью микропипетки ^6. Эти всасывающие микропипетка и микропипетка методы передача, которые позволяют захвата изображений в самом начале быстрого обмена раствора (захватить раннее линейную фазу изменения объема), вероятно, будут связаны физический стресс к протопластов и требуют специального оборудования и экспертных микроманипуляция.

Метод, описанный здесь минимизирует помехи для клеток, не влечет за микроманипуляция и позволяет вывод P _F, когда ванна перфузии не мгновенно.

После ферментативного расщепления, протопласты, погруженные в изотоническом растворе, иммобилизуют на покровное стекло нижней части пластика (иначе Lucite или плексигласа) камеры путем взаимодействия заряда. Затем, в ходе постоянным ванны перфузии,изотонический раствор смывается с помощью гипотонического раствора, генерирующего гипоосмотическими вызов протопластов. Отек протопласта является видеозаписи, а затем, путем объединения информации о времени ход ванны перфузии и времени ход клеточного отека, P _F определяется обработки изображений и аппроксимации кривой процедур.

Преимущества этого метода является то, что этот эксперимент не очень эффективным, т.е. можно контролировать несколько клеток одновременно в одном анализе, и что он не требует специального оборудования или особых навыков микроманипуляция. Несколько приложений для этого метода возможны. Например, определение родной P _F разнообразных клетках из различных тканей и растений, таких как мезофилла и обкладки сосудисто-клеток из Arabidopsis листа ^7, кукурузный мезофилла листа или корневых клетках коры ^8-10 или суспензионных культурах клеток ^11,12. В дополнительна, можно определить P _F сферических клеток животных, таких как клетки ооцитов ^11. Другой пример включает экспертизу AQP деятельности по временной экспрессии их генов в протопластов (или любых других генов, которые могут повлиять на них, например: гены киназ) и определение их вклада в P _F; Например, экспрессия томатного AQP SlTIP2, 2 Arabidopsis в мезофильных протопластов путем трансформации ПЭГ и определения SlTIP2, 2, связанных с P _F ^13. Наконец, исследование влияния на P _F различных молекул / веществ (наркотики, гормонов и т.д.) добавлен в растворах также могут быть рассмотрены, например в AQP блокатора HgCl ₂ ^7.

Следующий протокол описывает выделение протопластов Arabidopsis мезофильных клетках и определение их P _F.

протокол

1 Получение Решения

1. Подготовьте изотонический (600 мОсм) и гипотонический (500 мОсм) растворы, содержащие 10 мМ KCl, 1 мМ CaCl _2, и 8 М 2-(N-морфолин) -ethanesulphonic кислоты (MES), рН 5,7 и регулировать осмотическое давление с соответствующими количествами D-сорбит: 540 мм изотонический и 440 мм для гипотонического раствора. Убедитесь, осмолярность раствора (в пределах 3% от заданного значения), используя осмометр.
2. Подготовка сухой запас 'ферментативной смеси ", содержащей следующие ферменты: 0,55 г целлюлазы, 0,1 г pectolyase, 0,33 г поливинилпирролидона К-30, 0,33 г БСА (смотрите таблицу 1 ниже), смешать сухой порошок с помощью вихря, чтобы 5,7 мг аликвоты и хранить при температуре -20 ° C.

2 Выделение Arabidopsis мезофильных протопластов

1. Приготовьте чашку Петри (10 см) с примерно 6 капель (примерно. 30 мкл каждая) изотонический раствор.
2. Пил абаксиальной (ниже) Arabidopsis эпидермиса листа, сут очищенный лист на квадраты примерно 4 х 4 мм ^2, а затем поместить квадраты на изотоническом растворе падает с открытой абаксиальной стороной вниз, касаясь решения.
3. Растворите 5,7 мг ферментной смеси в 165 мкл изотонический раствор (3,3% м / м) в 1,5 мл пробирку, осторожно перемешать с помощью пипетки в течение минуты или так до полного растворения, и поместите несколько подобных капель ферментативной решения в том же Петри блюдо.
4. Передача этих кусочков листа на ферментативного раствора капель, закрыть тарелку уплотнительную крышку с одного раунда парафином и инкубируют в течение 20 мин, плавающие блюдо в водяной бане до 28 ° С.
5. Добавить еще несколько капель изотонического раствора к блюду (2 капли на каждый фермента капли раствора). Передача каждый кусок листа к новому капли изотонического раствора, а затем, последовательно, на второй капли (мыть ферментативной решение км). Поднимите кусок за края с помощью щипцов, встряхните его во втором капли (например, чай в пакетиках), чтобы освободить протопластов.Соберите капли с протопластов (с использованием усекается пипетки 100 мкл) в 1,5 мл пробирку.

3 Гипотоническая Вызов Анализ: Сотовый Отек Arabidopsis Мезофилл

1. Подготовьте перфузии системы (Рисунок 1А), заполнив одну колонку с изотонический раствор и другую колонку с гипотонического раствора. Откройте клапан, пусть некоторое потока раствора (первая гипотоническая, то изотонический) для заполнения трубки весь путь до впускного коллектора (Рисунок 1В). Убедитесь, что нет не осталось воздуха, а затем закрыть клапан.
2. Печать покровное, используя силиконовую смазку (таблица 1), чтобы сделать дно для камеры в пределах плексигласа слайде (Рисунок 1В; см также схемные решения камере в фиг.1С). Чтобы сделать прострел низом (восходящий обращенную открытую поверхность покровного стекла в смазки кольца) "липкий" для протопластах, пальто этос положительным зарядом подшипника протаминсульфата (1% в воде, в таблице 1) или поли-L-лизин (0,1% в воде, в таблице 1). Выкладываю этот 'клей' над покровного стекла с помощью пипетки, подождите 1 - 2 мин, промыть 3 - 4 раза с изотонический раствор и встряхните далеко оставшийся раствор.
3. Заполните камеру еще с изотонический раствор. Затем добавьте каплю протопластов, содержащих решение камере, используя обрезаны пипетки и ждать 3 - 4 мин для протопласты урегулировать. Накройте камеру с прозрачной крышкой (Цифры 1D, 1E) касается поверхности раствора (во избежание захвата воздушных пузырьков под).
4. Поместите слайд (мягко!) На перевернутом столе микроскопа, подключите его к системе перфузии и насосом (защищая от пузырьков воздуха в трубке!) И включите изотонический потока раствора для постоянной перфузии в 1 мл / мин (более быстрыми темпами может быть использован, до 4 мл / мин).
5. Для записиГромкость меняется, инвертированный микроскоп используется, с целью 20X и с CCD видеокамеры, подключенной к ПК. Используйте 'КМУ 1394 Camera Driver' плагин программного обеспечения ImageJ (смотри таблицу конкретных материалов для загрузки адреса этих двух программных частей), чтобы записать 60 сек видео фильм выбранных неподвижных протопластов (предположительно, те, застрял на дно) в размере 1 кадр / сек (1 Гц). Начните запись с 15 сек стирки в изотонический раствор (это являются базовыми), переключитесь на гипотонического раствора в течение 45 с (для завершения всего 60 сек от начала перфузии). Сохраните фильм в формате TIF. ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите поле зрения с таким количеством клеток, как это возможно, соответствует следующим критериям: сферическую форму и с целенаправленной контура клеток по их величине периметра (рисунок 2А).

4 Анализ сотового Volume изменение через ImageJ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализаСерия изображений набухания клетки, используйте 'Image Explorer' и плагины "протопластов анализатора 'в программном обеспечении ImageJ (письменного Ксавье Draye) ^14. Начиная с выбранными протопластов на их первом момент времени, плагин в 'протопластов Analyzer' автоматически обнаружит протопласты края (контуры) и рассчитать временной ход своих областях в ходе эксперимента (плагины доступны с программой анализа PfFit, ниже) .

1. Начните ImageJ. Чтобы открыть фильм, нажмите "Файл" на панели ImageJ, то, последовательно на выпадающих меню, как они разворачиваются: "Импорт" затем "Проводник изображения '. Выделите выбранный фильм, а затем щелкните правой кнопкой мыши на нем, то щелкните левой кнопкой мыши на "протопластов Analyzer". Просмотрите фильма (с помощью ползунка в протопластов изображения дна), чтобы определить протопластов, которые остаются в значительной степени неподвижна во время эксперимента - они будут проанализированы. Вернуться в начало IMAGE, с помощью мыши, рисовать круги (определена из инструментов ImageJ рисования) вокруг выбранных протопластов (Рисунок 2B), затем нажмите «OK» в таблице «параметры обнаружения", которые появились.
2. Для запуска алгоритма обнаружения протопластов, нажмите 'Часовой' на протопластов изображения верхней панели, то "процесс" в выпадающем меню. Изучите зеленые круги вокруг выбранных протопластов (Рисунок 2C) на протяжении всего фильма. Сохраните 'Результат' в файле Excel. Выйти ImageJ. ПРИМЕЧАНИЕ: В случае появляется красная точка (указать плохой контура Fit - обычно за счет плохого контраста изображения), повторно с различными параметрами.
3. Для разделения линии, принадлежащие каждой ячейки (которая - если два или более клетки анализировали одновременно - будет переплетаются, потому что анализ делается кадр за кадром), в Excel, отсортировать сохраненные данные по колонке числа клеток ('объекта' ).
4. Для Determine коэффициент преобразования пиксель в мкм для получения реальной стоимости P _F, оснастки образ микрометра правителя через тот же 20X объектива микроскопа. Перетащите линию (определена из инструментов ImageJ рисования) вдоль линейки изображения и читать числа пикселей, эквивалентную длине линейки в нижней части главной панели ImageJ. Преобразование произвольные значения площади пикселя в файле Excel в мкм ^2. Сохраните области временной ход (для каждой ячейки в отдельности) в виде текстового файла (две колонки только из цифр). ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет вход программе громкости облегающие 'PfFit'.

5 Моделирование Оценить осмолярности изменении в экспериментальной камере, используя ImageJ и _ф Fit Matlab Программа P

1. Добавить 2 мг ксилолцианола (Таблица 1, ниже) к 100 мл изотонического раствора (для получения 'индикаторный краситель').
2. Подготовьте перфузии системы (как в 3.1) с индикаторный краситель и, не окрашенных чypotonic решение.
3. Печать покровное используя силиконовую смазку на дне камеры пластика, затем аккуратно заполнить камеру с индикаторный краситель, накройте его покровным (как с протопластов до) и поместите его на столик микроскопа.
4. Подключите камеру к системе перфузии и насосом, и включите потока индикаторный краситель для постоянной перфузии в л мл / мин.
5. Запись 60 сек фильм в размере 1 Гц. Начните запись с 15 сек от индикаторный краситель, переключиться на гипотонического раствора в течение 45 сек. Стоп съемок. Промывать индикаторный краситель (по крайней мере, в течение 30 сек), затем начать новый фильм. Повторите около 5 - 6 раз и сохранить все фильмы
6. С помощью программного обеспечения ImageJ анализировать видеоизображение от пропускания индикаторный краситель, чтобы получить усредненный временной ход изменяющейся прозрачностью.
   1. Начните ImageJ, нажмите "Файл", затем, «Открыть», и перейдите к фильму. Для каждого фильма, рисовать в 10 пиксель по вертикалипрямоугольник в любом месте на ^1-м изображением фильма. Нажмите 'Image' на главной панели ImageJ, затем нажмите кнопку 'Crop' в выпадающем меню.
   2. Для выравнивания 60 кадров (на 60 сек фильма) в один ряд, нажмите еще раз 'Image', а затем нажмите последовательно в выпадающих меню, как они разворачиваются: 'Штабеля »и« Сделать Montage »(колонки 60, строки 1). Нарисуйте 1 пиксель высокий горизонтальный прямоугольник в любом месте вдоль всей строки изображений и нажмите 'Анализ' на главной панели ImageJ, затем нажмите кнопку 'участок профиля' в выпадающем меню. ПРИМЕЧАНИЕ: 'Земельный Montage' окно появится (не показано), а также список данных пропускания может быть открыт из его меню. Каждое изображение фильма представлена ​​в этом списке на 10 значений пропускания, происходящих в его 10 пикселя широкого прямоугольника и, следовательно, "временной базы" (образ порядковый номер) в 10 раз больше.
   3. Скопируйте списки из пропускания DAT(один список за кино) в файл Excel. Среднее значение на курсы времени пропускания, полученные из нескольких фильмов на приливы индикаторный краситель. Создайте в режиме реального времени базы путем умножения изображения порядковый номер по 0,1. Сохранить усредненный временной ход (две колонки) в текстовый файл. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед усреднения, при желании, построить отдельные программы обучения, чтобы отвергать любые неровности. Убедитесь, что фильм содержит по меньшей мере 5 окончательное сек стационарных пропускания индикаторный краситель.
7. Запустите Matlab фитинг программа P _F Fit (панели индикаторная Fit ', рисунок 3) для вычисления различных параметров времени осмолярность конечно. ПРИМЕЧАНИЕ: на основе известных начальных и конечных концентрациях раствора в ванне, время курс меняющейся осмотического концентрации раствора рассчитывается по времени концентрация конечно (рассчитывается, в свою очередь, от пропускания индикаторный краситель), предполагая его следует тем же динамику, что иконцентрация красителя. P _е Fit это программа доступна для использования бесплатно. 'PfFit_Installer_web.exe' можно скачать с: P _ф руководстве Fit пользователя "с подробными объяснениями и определений доступен через Юпитера в качестве дополнительного файла, который помогает ознакомить пользователя с P _ф Fit программы.
8. В панели "Indicator Fit ', импортировать данные из среднего времени ходе индикаторный краситель пропускания (' Индикатор файла данных ', 3А) и вставить вручную текущие параметры эксперимента и начальные предположения параметров" ширина "и" t_half 'описания временной ход концентрации индикаторный краситель (фиг.3Б. Нажмите' Run 'для просмотра графики временных курсах концентрации индикаторный краситель (реальные данные и нужным, рис 4а), и моделируемой (расчетный) ванны осмолярность (4В) ПРИМЕЧАНИЕ:. AGООД подходят к данным является существенным (рекомендация: начать с значений, показанных на рисунке 3).

6 Определение _Рр, используя Matlab Место Program P _F Fit

ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к основным предположениям в отношении поведения протопласта как истинной и совершенной осмометра ^11, определение P _F опирается на предположении, что P _F может меняться со временем, что это динамика P _F лежит в основе время Конечно изменения объема ячейки и что три параметра достаточно, чтобы описать его: P _Fi (начальное значение P _F), Slope _ПФ (скорость линейного изменения P _F) и Delay (период от начала ванне изменение осмолярности до начала смены сотовой ячейки объема). Различные модели могут быть проверены, в том числе различных комбинаций этих параметров и их значений, включая значения нулевых ^11. P е Fit поиск наилучшего сочетания этих параметров, получая - по расчету - самый точного воспроизведения экспериментальной времени ходе изменения объема ячейки ^11, рассчитанного, в свою очередь, от импортной серии клеток-контурных областей (см Также Справочная 'P _F Руководство Fit пользователя).

1. Переключитесь на "Volume Fit" панели (рисунок 5). Выберите для импорта файл данных районах (текстовый файл с временной ходе «зон», анализируемых протопластов, рис 5А). Выберите 'Последний показатель Место' в качестве источника параметра (Рисунок 5Б; увидеть 'Р _F Руководство Fit пользователя альтернатив). ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры (Рисунок 5D) затем используется для регенерации изменение осмотического агента в ванне для объемов, установленных процедуру.
2. В 'Объем Fit "панели (Рисунок 5C), инициализации (заполнить начальных догадок для) в P параметров _F: P _F, Slope _пФ и задержки (рекомендация: начать с 1, 1 и 30, соответственно), выбрал модель 'класса' (рекомендация: начать с II и марки для установки 'проверяет' для всех трех параметров). Нажмите 'Run', то глазное яблоко промежуточный показатель (Рисунок 5E) и отрегулировать параметр задержки и длину записи, если это необходимо.
3. Изучите график результатов (рисунок 6) оценить подходят качество и запишите подходят ошибку. Изменение инициализации параметров некоторые складывают друг и повторно'Run '. ПРИМЕЧАНИЕ: Не расстраивайтесь, когда программа застревает - просто перезапустить программу!
4. Повторите эту процедуру несколько раз, начиная с различными комбинациями параметров инициализации, стремясь к самой низкой стоимости подходят ошибки.
5. Скопируйте список пригодных результатов непосредственно с экрана, или найти их в тон PfFit генерируемые файл '_FIT_Vol_Results.txt'.

Результаты

Для того, чтобы определить _Рр и сравнить деятельность разных AQPs, мезофильные протопласты от Arabidopsis листа используются. Эти протопласты были обнаружены низкие базальные (фон) уровни P _F ⁷ и может служить в качестве системы функционально-выражения для того, чтобы воспроиз...

Обсуждение

Описанный здесь является простым и очень эффективная процедура для измерения _Рр изолированных протопластов растений, применимые в принципе и к другим сферических ячеек, например., Лягушка ооцитов ^11. Этот метод основан на измерении _Рр в ответ на осмотическое вызо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl	Chem-Impex International	01247-1	http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade
CaCl2	Merck	11718006	http://www.merck.com Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)	Sigma	15152002	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
D-Sorbitol	Sigma	18032003	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
Cellulase	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS002603	http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase	Karlan,               Phonix, AZ, USA	8006	http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)	Sigma	81420	http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418-5G	http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate	Sigma	P4380	http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920	http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol	Sigma	X4126	http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy	Merck	107921	https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100/TS100F	http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump	BIO-RAD	EP-1 Econo Pump	http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera	Scion Corporation	CFW-1308M	http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ	Carnegie Mellon		http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit	BIO-RAD	731-9006	http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold	DirectMed		http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns)	Welford	IF-BR-001	http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing	TYGON	R-3603	http://www.usplastic.com
Plexiglass slide etc.	Perspectiv		http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'.
3M packaging Scotch tape 1'', clear	Viking Industrial, UK	VKMONO25	http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK