Misurare il osmotica dell&#39;acqua Permeabilità Coefficiente (P<sub&gt; F</sub&gt;) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

Riepilogo

Misurare il coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P _f) delle cellule può aiutare a capire i meccanismi di regolazione delle acquaporine (AQPs). P determinazione _F in protoplasti di cellule vegetali sferiche qui presentati coinvolge protoplasti isolamento e l'analisi numerica dei loro tasso iniziale di variazione di volume a seguito di una sfida osmotico costante durante il bagno di perfusione.

Abstract

Studiare AQP meccanismi di regolazione è fondamentale per la comprensione delle relazioni idriche sia a livello cellulare e tutto il livello dell'impianto. Presentato qui è un metodo semplice e molto efficace per la determinazione del coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P _f) in protoplasti vegetali, applicabile in linea di principio anche ad altre cellule sferiche come oociti di rana. Il primo passo del saggio è l'isolamento di protoplasti dal tessuto vegetale di interesse mediante digestione enzimatica in una camera con una soluzione isotonica adeguata. La seconda fase consiste in un saggio sfida osmotica: protoplasti immobilizzati sul fondo della camera vengono sottoposti ad una partenza perfusione costante con una soluzione isotonica e seguiti da una soluzione ipotonica. Il gonfiore cella è il video registrato. Nella terza fase, le immagini vengono elaborate in linea per produrre variazioni di volume, e l'andamento temporale delle variazioni di volume è correlato con l'andamento temporale della variazione di osmolarezza del mezzo perfusione camera, utilizzando una curva di raccordo procedura scritta in Matlab (il 'PfFit'), per produrre P _f.

Introduzione

L'assorbimento di acqua e il flusso attraverso le membrane cellulari è un requisito fondamentale per l'esistenza dell'impianto sia a cellulare e tutto il livello dell'impianto. A livello cellulare, acquaporine (AQPs) giocano un ruolo chiave nella regolazione del coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P _f) della membrana cellulare ^1-3.

Ad oggi, diversi metodi sono stati utilizzati per misurare il endogena P _f di protoplasti da diversi organi vegetali (ad esempio radici, mesofillo, endodermis, ecc., Recensito da Chaumont et al. ^4). Uno degli approcci per misurare P _f è quello di esporre i protoplasti di una sfida osmotico e di monitorare il tasso iniziale del suo cambiamento di volume (ad esempio., La pendenza della prima fase lineare della variazione di volume). Due metodi differenti sono stati precedentemente descritti sulla base di questo approccio, entrambi basati su uno scambio istantaneo di soluzioni. Il primo consiste immobilizzione del protoplasti con una micropipetta di aspirazione e commutare il flusso della soluzione ⁵ e la seconda di trasferimento del protoplasti da una soluzione all'altra utilizzando una micropipetta ^6. Questi aspirazione micropipetta e micropipetta metodi di trasferimento, che permettono l'acquisizione di immagini proprio all'inizio dello scambio soluzione veloce (per catturare la prima fase lineare della variazione di volume), probabilmente comportare uno stress fisico per protoplasti e richiedono attrezzature specializzate e micromanipolazione esperto.

Il metodo qui descritto riduce al minimo il disturbo alle cellule, comporta nessun micromanipolazione e permette la derivazione di P _f quando la perfusione bagno non è istantanea.

Dopo la digestione enzimatica, i protoplasti, immersi in una soluzione isotonica, sono immobilizzati sul fondo coprioggetto di vetro di un Plexiglass (aka Lucite o perspex) da camera di interazione carica. Poi, durante un bagno perfusione costante,la soluzione isotonica viene lavato via da una soluzione ipotonica generando una sfida ipoosmotico ai protoplasti. Il rigonfiamento del protoplasti è video registrato e quindi, combinando le informazioni sul decorso della perfusione vasca e l'andamento temporale del gonfiore cella, il P _f è determinata dalla elaborazione di immagini e procedure di montaggio curva.

I vantaggi di questo metodo sono che l'esperimento è molto efficiente, cioè è possibile monitorare alcune cellule simultaneamente in un singolo test, e che non richiede particolari attrezzature o particolari competenze micromanipolazione. Diverse applicazioni di questo metodo sono possibili. Ad esempio, la determinazione del nativo P _f di una varietà di cellule di diversi tessuti e piante, come mesofillo e raggruppare le cellule della guaina di Arabidopsis foglia ^7, mais mesofillo foglia o radice cellule della corteccia ^8-10 o di sospensione di cellule in coltura ^11,12. In additisu, è possibile determinare P _f di cellule animali sferiche come le cellule ovociti ^11. Un altro esempio riguarda l'esame delle attività di AQP da espressione transitoria della loro gene nei protoplasti (o qualsiasi altri geni che possono influire li, ad esempio, i geni di chinasi) e la determinazione del loro contributo alla P _f; per esempio, l'espressione di pomodoro AQP SlTIP2; 2 in Arabidopsis mesofillo protoplasti di PEG trasformazione e determinazione la SlTIP2; P 2-correlati _F ^13. Infine, l'esame degli effetti sulla P _f di diverse molecole / sostanze (farmaci, ormoni, ecc) ha aggiunto alle soluzioni possono anche essere esaminato, per esempio del bloccante AQP HgCl ₂ ^7.

Il seguente protocollo descrive l'isolamento di protoplasti di cellule e la determinazione del loro P _f Arabidopsis mesofillo.

Protocollo

1 preparazione di soluzioni

1. Preparare isotonica (600 mOsm) e ipotonica (500 mOsm) soluzioni contenenti KCl 10 mM, 1 mM CaCl _2, e 8 M 2 (N-morfolina) Acido -ethanesulphonic (MES), pH 5.7 e regolare osmolarità con gli importi adeguati di D-sorbitolo: 540 mm per l'isotonico e 440 mm per la soluzione ipotonica. Verificare l'osmolarità della soluzione (entro il 3% del valore nominale) utilizzando un osmometro.
2. Preparare uno stock secco di 'mix enzimatico' contenente i seguenti enzimi: 0,55 g cellulasi, 0,1 g pectolyase, 0,33 g di polivinilpirrolidone K 30, 0,33 g di BSA (vedi tabella 1 qui di seguito), mescolare la polvere secca da vortice, fare 5,7 mg aliquote e conservare a -20 ° C.

2 Isolamento di protoplasti di Arabidopsis mesofillo

1. Preparare una capsula di Petri (10 cm) con circa 6 gocce (circa. 30 ml ciascuna) di soluzione isotonica.
2. Sbucciare le abaxial epidermide (inferiore) foglia di Arabidopsis, cut la foglia pelati in quadrati di circa 4 x 4 mm ^2, quindi posizionare i quadrati sulla soluzione isotonica scende con il lato abaxial esposto verso il basso, toccando la soluzione.
3. Sciogliere 5,7 mg del mix enzima in 165 microlitri soluzione isotonica (3,3% w / w) in una provetta da 1,5 ml, mescolare delicatamente pipettando per un minuto o giù di lì fino alla dissoluzione, e mettere alcune gocce simili della soluzione enzimatica nello stesso Petri piatto.
4. Trasferire i pezzi di foglia sulla soluzione enzimatica gocce, chiudere il piatto di tenuta del coperchio con un giro di parafilm ed incubare per 20 minuti, il piatto che galleggia in un bagnomaria regolato a 28 ° C.
5. Aggiungere qualche più gocce della soluzione isotonica al piatto (2 gocce per ogni goccia di soluzione enzimatica). Trasferire ogni pezzo foglia di una nuova goccia soluzione isotonica, poi, in sequenza, ad una seconda goccia (per lavare la soluzione enzimatica via). Sollevare il pezzo per il bordo usando pinze, agita nella seconda discesa (come una bustina di tè) per rilasciare i protoplasti.Raccogliere le gocce con i protoplasti (utilizzando una pipetta 100 microlitri tagliati fuori) in una provetta da 1,5 ml.

3 Il ipotonico sfida saggio: Gonfiore cellulare Arabidopsis mesofillo

1. Preparare il sistema di perfusione (Figura 1A) riempiendo una colonna con la soluzione isotonica e un'altra colonna con la soluzione ipotonica. Aprire la valvola, far entrare un po flusso della soluzione (prima il ipotonico, quindi il isotonica) per riempire il tubo fino in fondo al collettore di aspirazione (Figura 1B). Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria intrappolate, e quindi chiudere la valvola.
2. Sigillare il coprioggetto, utilizzando grasso al silicone (Tabella 1), per fare un fondo per la camera all'interno della diapositiva plexiglass (Figura 1B, vedi anche gli schemi della camera in Figura 1C). Per rendere il fondo della camera (la superficie rivolta verso l'alto esposta del coprioggetto all'interno dell'anello di grasso) "sticky" per protoplasti, cappottocon carica positiva-cuscinetto protamina solfato (1% in acqua; Tabella 1) o poli-L-lisina (0,1% in acqua; Tabella 1). Stendere questo 'collante' sopra il coprioggetto utilizzando un puntale, attendere per 1 - 2 minuti, sciacquare 3 - 4 volte con la soluzione isotonica e scuotere via la soluzione rimanente.
3. Riempire la camera con la soluzione isotonica. Poi, aggiungere una goccia di protoplasti contenenti soluzione alla camera, usando un puntale tagliato fuori e aspettare 3-4 minuti per i protoplasti di stabilirsi. Coprire la camera con un coperchio trasparente (Figure 1D, 1E) di toccare la superficie soluzione (evitare di intrappolare bolle d'aria sotto).
4. Posizionare il vetrino (con delicatezza!) Su un tavolo microscopio invertito, collegarlo al sistema di perfusione e la pompa (la guardia contro le bolle d'aria nel tubo!) E accendere il flusso della soluzione isotonica per perfusione costante a 1 ml / min (le tariffe più veloci può essere usato fino a 4 ml / min).
5. Per la registrazionevariazioni di volume, è usato un microscopio invertito, con un obiettivo 20X e con una videocamera CCD collegata ad un computer PC. Utilizzare il plugin 'CMU 1394 Camera Driver' del software ImageJ (vedere la tabella di materiali specifici per gli indirizzi di download di questi due pezzi di software) per registrare un filmato video di 60 secondi di protoplasti immobili selezionati (presumibilmente, quelle attaccata al fondo) ad una velocità di 1 immagine / sec (1 Hz). Avviare la registrazione con 15 sec lavaggio della soluzione isotonica (ciò costituisce la linea di base), passare alla soluzione ipotonica per 45 secondi (per completare un totale di 60 secondi dall'inizio della perfusione). Salvare il filmato in formato TIF. NOTA: Scegliere un campo di vista con il maggior numero possibile di cellule, che soddisfano i seguenti criteri: forma sferica e con un contorno di cellule ben focalizzato il loro più grande perimetro (Figura 2A).

4 Analisi della variazione di volume delle cellule Utilizzo ImageJ

NOTA: Per analizzare ilserie di immagini di un rigonfiamento cellulare, utilizzare il 'Image Explorer' e plugins 'Protoplast Analyzer' nel software ImageJ (scritto da Xavier Draye) ^14. Partendo con i protoplasti scelti al loro primo punto temporale, il plug-in 'Protoplast Analyzer' in grado di rilevare automaticamente i protoplasti bordi (contorni) e calcolare l'andamento temporale delle loro aree durante l'esperimento (i plugin sono disponibili con il programma di analisi PfFit, qui di seguito) .

1. Inizia ImageJ. Per aprire il filmato, fare clic su 'File' del pannello ImageJ, poi, consecutivamente sul menu a discesa mentre si svolgono: 'Import' poi 'Image Explorer'. Evidenziare il filmato prescelto, quindi fare clic destro su di esso, poi a sinistra, clicca su 'Protoplast Analyzer'. Percorso attraverso il filmato (con un cursore in protoplasti immagine in basso) per identificare i protoplasti che rimangono in gran parte immobile durante l'esperimento - questi saranno analizzati. Ritornare alla prima image, utilizzando il mouse, disegnare cerchi (raccolti dagli strumenti di disegno ImageJ) intorno alle protoplasti selezionati (Figura 2B), quindi fare clic su 'OK' nella tabella dei "parametri di rilevazione" che è apparso.
2. Per avviare l'algoritmo di rilevamento di protoplasti, fare clic su 'locale' sul pannello superiore dell'immagine protoplasti, poi 'Processo' nel menu a discesa. Esaminare i cerchi verdi intorno alle protoplasti selezionati (Figura 2C) in tutto il film. Salvare il 'risultato' in un file Excel. Esci ImageJ. NOTA: Nel caso in cui appare un punto rosso (per indicare un cattivo contorno fit - di solito a causa di un contrasto povero), eseguire di nuovo con parametri diversi.
3. Per separare le linee appartenenti a ciascuna cella (che - se due o più cellule sono state analizzate simultaneamente - si intrecciano, perché l'analisi viene fatta fotogramma per fotogramma), in Excel, ordinare i dati salvati in base alla colonna numero di cellule ('oggetto' ).
4. Per determine il fattore di conversione pixel-per-micron per ottenere il valore reale di P _f, scatto l'immagine di un sovrano micrometro tramite lo stesso obiettivo 20X microscopio. Trascinare una linea (prelevati da strumenti di disegno ImageJ) lungo l'immagine righello e leggere il numero di pixel pari alla lunghezza righello nella parte inferiore del pannello principale ImageJ. Convertire i valori arbitrari zona dei pixel nel file Excel in micron ^2. Salvare il corso zone tempo (per ogni cella separatamente) come file di testo (due colonne di numeri unici). NOTA: Questo sarà un input per il programma 'PfFit' volumi di montaggio.

5. Modellazione del Tasso di osmolarità Variazione nella camera sperimentale Uso ImageJ e la _f Fit Matlab programma P

1. Aggiungere 2 mg xilene cyanol (Tabella 1, in basso) a 100 ml di soluzione isotonica (per produrre il 'colorante indicatore').
2. Preparare il sistema di perfusione (come in 3.1) con il colorante indicatore e la h non tintosoluzione ypotonic.
3. Sigillare il vetrino con grasso al silicone sul fondo della camera di plexiglass, quindi riempire delicatamente la camera con il colorante indicatore, coprire con un coprioggetto (come con i protoplasti prima) e posizionarlo sul palco microscopio.
4. Collegare la camera al sistema di perfusione e la pompa, e accendere il flusso di colorante indicatore di perfusione costante a l ml / min.
5. Registrare un filmato di 60 secondi alla velocità di 1 Hz. Avviare la registrazione con 15 sec di colorante indicatore, passare alla soluzione ipotonica per 45 sec. Smettere di riprese. Lavare con l'indicatore Dye (almeno per 30 secondi), quindi avviare un nuovo film. Ripetere circa 5 - 6 volte e salvare tutti i film
6. Utilizzare il software ImageJ per analizzare le immagini video della trasmittanza colorante indicatore di ottenere un andamento temporale media del cambiamento trasmittanza.
   1. Inizia ImageJ, fare clic su 'File', poi, 'Apri', e cercare il film. Per ogni film, disegnare un ampio 10 pixel verticalirettangolo ovunque l'immagine 1 ^° del film su. Fare clic su 'Immagine' sul pannello principale ImageJ, quindi fare clic su 'Crop' nel menu a discesa.
   2. Per allineare i 60 fotogrammi (del filmato 60 sec) in una riga, fare clic di nuovo 'Immagine', quindi fare clic su consecutivamente nei menu a discesa mentre si svolgono: 'Stacks' e 'Fare Montage' (colonne, righe 60 1). Disegnare un rettangolo orizzontale alta 1 pixel ovunque lungo tutta la fila di immagini e cliccare su 'Analizza' nel pannello principale ImageJ, quindi fare clic su 'profilo grafico' nel menu a discesa. NOTA: A 'Trama di Montage' finestra apparirà (non mostrato), e un elenco dei dati di trasmittanza possono essere aperti dal menu. Ogni immagine del film è rappresentato in questa lista di 10 valori di trasmittanza originari del suo rettangolo largo 10 pixel e di conseguenza la "base dei tempi" (il numero sequenziale dell'immagine) è 10 volte più a lungo.
   3. Copiare le liste del dat trasmittanzauna (una lista per ogni film) in un file Excel. Calcolare la media dei corsi a tempo trasmittanza ottenuti dai diversi film delle vampate di colorante indicatore. Generare una base reale tempo moltiplicando il numero sequenziale dell'immagine di 0,1. Salvare il periodo di tempo mediato (due colonne) in un file di testo. NOTA: Prima di media, se lo si desidera, tracciare i corsi individuali di tempo, di rifiutare eventuali irregolarità. Assicurarsi che il film include almeno 5 sec finale dello stato stazionario trasmittanza dell'indicatore Dye.
7. Avviare il raccordo Fit Matlab programma P _f (pannello 'indicatore Fit', figura 3) per calcolare i vari parametri del corso tempo osmolarità. NOTA: sulla base delle note concentrazioni iniziali e finali della soluzione nella vasca da bagno, l'andamento temporale del cambiamento di concentrazione osmotica della soluzione viene calcolata l'andamento temporale di concentrazione (calcolato, a sua volta, dalla trasmittanza colorante indicatore), supponendo che segue le stesse dinamiche come ilconcentrazione di colorante. P _f Fit è un programma disponibile per l'uso a titolo gratuito. Il 'PfFit_Installer_web.exe' può essere scaricato da: P _f Guida per l'utente Fit 'con spiegazioni e definizioni precise è accessibile tramite Giove come un file supplementare, che aiuta a familiarizzare l'utente con il programma P _F Fit.
8. Nel pannello 'indicatore Fit', importare i dati del corso tempo medio di trasmittanza Indicatore Dye ('file di dati Indicator', figura 3A) e inserire manualmente i parametri dell'esperimento attuali e le ipotesi iniziali dei parametri 'width' e ' t_half 'che descrive l'andamento temporale della concentrazione di colorante indicatore (Figura 3B. Fare clic su' Esegui 'per visualizzare le trame dei andamento nel tempo della concentrazione colorante indicatore (dati reali e in forma, figura 4a), e del modellato (calcolato) Bagno osmolarità (Figura 4B). NOTA: agood adatta ai dati è essenziale (una raccomandazione: iniziare con i valori riportati nella figura 3).

6 Determinazione del P _F utilizzando il Fitting programma Matlab P _f Fit

NOTA: Oltre alle ipotesi di base per quanto riguarda il comportamento di un protoplasti come un vero e perfetto osmometro ^11, la determinazione di P _f basa sulla presunzione che P _f può cambiare con il tempo, che questa dinamica di P _f sottende il tempo corso della variazione di volume delle cellule e che i tre parametri sufficienti per descriverlo: P _fi (il valore iniziale di P _f), Slope _Pf (il tasso di variazione lineare di P _f) e Delay (il periodo compreso tra l'inizio del bagno cambiamento osmolarità fino all'inizio della variazione di volume delle cellule). Diversi modelli possono essere testati, tra cui diverse combinazioni di questi parametri e dei loro valori, inclusi i valori nulli ^11. P _{f Fit cerca la migliore combinazione di questi parametri per produrre - mediante calcolo - la riproduzione più fedele l'andamento temporale sperimentale della variazione di volume cella ^11, calcolato, a sua volta, dalla serie importato di aree cellula-profilo (vedi anche il Supplemental 'P f Guida Fit utente').}

1. Passare alla 'Fit Volume' del pannello (Figura 5). Scegliere per l'importazione del file di dati aree (il file di testo con l'andamento temporale delle "aree" dei protoplasti analizzati, Figura 5A). Scegliere 'Ultimo Indicatore Fitting' come fonte parametro (Figura 5B, vedere la 'P _f Guida per l'utente Fit' di alternative). NOTA: Questi parametri (Figura 5D) vengono poi utilizzate per rigenerare il cambiamento osmoticum nella vasca da bagno per i volumi procedura di montaggio.
2. Nel 'Volume Fit' pannello (Figura 5C), inizializzare (compilare le ipotesi iniziali per i parametri _F) P: P _{f, Pf} e Delay Slope (una raccomandazione: iniziare con 1, 1, e 30, rispettivamente), ha scelto il modello di 'classe' (una raccomandazione: iniziare con II e marchio 'verifica' per tutti e tre i parametri da montare). Fare clic su 'Esegui', poi bulbo oculare la figura intermedia (Figura 5E) e regolare il parametro Delay e la lunghezza del record, se necessario.
3. Esaminate il grafico dei risultati (figura 6) per valutare la qualità vestibilità e registrare l'errore di misura. Modificare i parametri di inizializzazione pochi piegare ogni, e ri-'Run '. Nota: Non scoraggiatevi quando il programma si blocca - basta riavviare il programma!
4. Ripetere questa procedura diverse volte, partendo da diverse combinazioni di parametri di inizializzazione, puntando il valore minimo dell'errore in forma.
5. Copiare l'elenco dei risultati in forma direttamente dallo schermo, o trovare in tegli PfFit-generato il file '_FIT_Vol_Results.txt'.

Risultati

Per determinare la P _f e confrontare l'attività di diversi AQPs, vengono utilizzati protoplasti da mesofillo foglia Arabidopsis. Questi protoplasti sono stati trovati ad avere bassi basale (sfondo) livelli P _f ⁷ e può servire come un sistema funzionale espressione per consentire riproducibili misurazioni P _f.

Protoplasti da una foglia maturo da un 6 settimane di età Arabidopsis pianta sono stati isolati e tre gene costruisce con i geni AQP d...

Discussione

Descritto qui è una procedura semplice e molto efficace per misurare la P _f di isolati protoplasti vegetali, applicabile in linea di principio anche ad altre cellule sferiche, ad es., Oociti di rana ^11. Questo metodo si basa sulla misura della P _f in risposta ad una sfida osmotica alla cella. A differenza di altri metodi basati su questo approccio, tuttavia, la variazione di soluzioni, cioè, della osmolarità, non è istantanea ma graduale, durante un bagno perfusione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl	Chem-Impex International	01247-1	http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade
CaCl2	Merck	11718006	http://www.merck.com Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)	Sigma	15152002	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
D-Sorbitol	Sigma	18032003	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
Cellulase	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS002603	http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase	Karlan,               Phonix, AZ, USA	8006	http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)	Sigma	81420	http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418-5G	http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate	Sigma	P4380	http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920	http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol	Sigma	X4126	http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy	Merck	107921	https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100/TS100F	http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump	BIO-RAD	EP-1 Econo Pump	http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera	Scion Corporation	CFW-1308M	http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ	Carnegie Mellon		http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit	BIO-RAD	731-9006	http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold	DirectMed		http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns)	Welford	IF-BR-001	http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing	TYGON	R-3603	http://www.usplastic.com
Plexiglass slide etc.	Perspectiv		http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'.
3M packaging Scotch tape 1'', clear	Viking Industrial, UK	VKMONO25	http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK