La mesure de la perméabilité à l&#39;eau Coefficient osmotique (P<sub&gt; F</sub&gt;) Des cellules sphériques: protoplastes de plantes isolées comme un exemple

Résumé

La mesure du coefficient de perméabilité à l'eau osmotique (P _f) de cellules peut aider à comprendre les mécanismes de régulation de aquaporines (AQP). P _f détermination dans des protoplastes de cellules végétales sphériques présentées ici implique l'isolement de protoplastes et l'analyse numérique de leur taux initial de changement de volume à la suite d'une faute de osmotique au cours de la perfusion de bain constant.

Résumé

L'étude des mécanismes de régulation PAQ est cruciale pour la compréhension des relations de l'eau, tant au niveau de la plante entière et cellulaire. Présenté ici est une méthode simple et très efficace pour la détermination du coefficient de perméabilité à l'eau osmosée (P _f) dans des protoplastes végétaux, en principe applicable aussi à d'autres cellules sphériques telles que les ovocytes de grenouille. La première étape de l'analyse est l'isolement de protoplastes à partir du tissu de la plante d'intérêt par digestion enzymatique dans une chambre avec une solution isotonique appropriée. La deuxième étape consiste en un test de provocation osmotique: protoplastes immobilisés sur le fond de la chambre sont soumises à une perfusion constante de départ avec une solution isotonique et suivis par une solution hypotonique. Le gonflement de la cellule est une vidéo enregistrée. Dans la troisième étape, les images sont traitées hors ligne pour donner des changements de volume, et l'évolution dans le temps des changements de volume sont corrélées avec l'évolution temporelle de la variation de la osmolarité de la chambre à fluide de perfusion, en utilisant une procédure d'ajustement de courbe écrit dans Matlab (la PfFit '), pour obtenir P _f.

Introduction

L'absorption d'eau et le débit à travers les membranes cellulaires est une exigence fondamentale pour l'existence de l'usine à la fois au niveau de la plante entière et cellulaire. Au niveau cellulaire, les aquaporines (AQP) jouent un rôle clé dans la régulation du coefficient de perméabilité à l'eau osmotique (P _f) de la membrane de la cellule ^1-3.

A ce jour, plusieurs procédés ont été utilisés pour mesurer la _f P endogène de protoplastes à partir de différents organes de la plante (par exemple les racines, le mésophylle, endoderme, etc., Examiné par Chaumont et al. ^4). L'une des approches pour mesurer P _f est d'exposer les protoplastes à un défi osmotique et à contrôler la vitesse initiale de sa variation de volume (c.-à-., La pente de la phase précoce, linéaire de la variation de volume). Deux méthodes différentes ont été décrites précédemment sur la base de cette approche, tous les deux basés sur un échange instantané de solutions. La première consiste à immobilizment le protoplaste avec une micropipette d'aspiration et le passage du flux de la solution ⁵ et la deuxième consistant à transférer l'un protoplaste d'une solution à l'autre à l'aide d'une micropipette ^6. Ces méthodes de transfert micropipette d'aspiration et de micropipette, qui permettent l'acquisition d'images au début de l'échange de solution rapide (pour capturer la phase linéaire début de changement de volume), impliquera probablement un stress physique de protoplastes et nécessitent un équipement spécialisé et micromanipulation expert.

Le procédé décrit ici minimise la perturbation des cellules, comporte aucun micromanipulation et permet la dérivation de P _f lorsque la perfusion de bain n'est pas instantanée.

Après la digestion enzymatique, les protoplastes, immergées dans une solution isotonique, sont immobilisés sur le fond de la lamelle couvre-objet en verre une Plexiglas (aka Lucite ou plexiglas) chambre par interaction de charges. Puis, au cours d'une perfusion constante de bain,la solution isotonique est rincée par la solution hypotonique générer un défi hypoosmotique aux protoplastes. Le gonflement du protoplaste est une vidéo enregistrée et ensuite, en combinant les informations sur le déroulement dans le temps de la perfusion de bain et le déroulement dans le temps de gonflement de la cellule, le P _f est déterminée par traitement d'image et des procédures d'ajustement de courbe.

Les avantages de cette méthode sont que l'expérience est très efficace, c'est à dire qu'il est possible de suivre quelques cellules simultanément dans un seul essai, et qu'il ne nécessite pas d'équipement spécial ou des compétences particulières de micromanipulation. Plusieurs applications de cette méthode sont possibles. Par exemple, la détermination de P _f natif d'une variété de cellules provenant de différents tissus et des plantes, tels que mésophylle et regrouper les cellules de la gaine de feuille ⁷ Arabidopsis, maïs mésophylle des feuilles ou des cellules du cortex des racines ^8-10 ou les cellules cultivées en suspension ^11,12. En additisur, il est possible de déterminer P _f de cellules animales telles que des cellules sphériques d'ovocytes ^11. Un autre exemple concerne l'examen de l'activité PAQ par l'expression transitoire de leur gène dans les protoplastes (ou d'autres gènes susceptibles de les toucher; par exemple, les gènes de kinases) et la détermination de leur contribution à P _f; par exemple, l'expression de tomate AQP SlTIP2; 2 dans les protoplastes d'Arabidopsis de PEG par transformation et la détermination SlTIP2; deux liés P _f ^13. Enfin, l'examen de l'effet sur ​​P _f de différentes molécules / substances (médicaments, hormones, etc) ajouté à des solutions peuvent également être examinée, par exemple du bloqueur PAQ _HgCl2 ^7.

Le protocole suivant décrit l'isolement de protoplastes des cellules et la détermination de leur P _f Arabidopsis de.

Protocole

1 Préparation de solutions

1. Préparer isotonique (600 mOsm) et hypotonique (500 mOsm) des solutions contenant 10 mM de KCl, _CaCl2 1 mM, et 8 M 2 (N-morpholine) d'acide -ethanesulphonic (MES), pH 5,7 et ajuster l'osmolarité avec les quantités appropriées d' D-sorbitol: 540 mm pour les isotonique et 440 mM pour la solution hypotonique. Vérifier l'osmolarité de la solution (à moins de 3% de la valeur cible) à l'aide d'un osmomètre.
2. Préparer une pâte sèche de «mélange enzymatique» contenant les enzymes suivantes: 0,55 g cellulases, 0,1 g pectolyase, 0,33 g de polyvinylpyrrolidone K 30, 0,33 g de BSA (voir le tableau 1 ci-dessous), mélanger la poudre sèche par vortex, faire 5,7 mg aliquotes et stocker à -20 ° C.

2 Arabidopsis L'isolement de protoplastes de mésophylle

1. Préparer une boîte de Pétri (10 cm) avec environ 6 gouttes (env. 30 ul chacun) de solution isotonique.
2. Peler les abaxiales Les épiderme (inférieure) de feuilles d'Arabidopsis, cut la feuille pelée en carrés d'environ 4 x 4 mm ^2, puis placez les carrés sur la solution isotonique gouttes avec le côté abaxiale exposé vers le bas, touchant la solution.
3. Dissoudre 5,7 mg du mélange d'enzymes dans 165 ul solution isotonique (3,3% p / p) dans un tube de 1,5 ml, mélanger doucement par pipetage pour une minute ou jusqu'à dissolution, et placer quelques gouttes semblables de la solution enzymatique dans le même Petri plat.
4. Transférer les morceaux de feuilles sur la solution enzymatique gouttes, fermer le plat d'étanchéité du couvercle avec un tour de parafilm et incuber pendant 20 min, flottant le plat dans un bain-marie réglé à 28 ° C.
5. Ajouter quelques gouttes d'une solution isotonique de l'antenne (2 gouttes par chaque goutte de solution enzymatique). Transfert de chaque morceau de feuille à une nouvelle goutte de solution isotonique, puis, successivement, à une seconde goutte (pour laver la solution enzymatique loin). Soulevez la pièce par son bord en utilisant une pince, serrer dans la deuxième chute (comme un sachet de thé) pour libérer les protoplastes.Recueillir les gouttes avec les protoplastes (à l'aide d'une pipette 100 ul rognée) dans un tube de 1,5 ml.

3 L'hypotonie Défi test: gonflement cellulaire Arabidopsis Mésophylle

1. Préparer le système de perfusion (figure 1A) en remplissant une colonne avec la solution isotonique et une autre colonne avec la solution hypotonique. Ouvrir la vanne, et encore un certain écoulement de la solution (la première hypotonique, puis la isotonique) pour remplir le tube tout en bas de la tubulure d'admission (figure 1B). Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air, puis fermer la vanne.
2. Sceller une lamelle, avec de la graisse de silicone (tableau 1), pour faire un fond pour la chambre dans la diapositive en plexiglas (figure 1B, voir aussi les schémas de la chambre à la figure 1C). Pour rendre le fond de la chambre (la surface vers le haut face exposée de la lamelle dans la couronne de graisse) "collante" pour protoplastes, enduireavec le sulfate de protamine-portant une charge positive (à 1% dans l'eau, tableau 1) ou la poly-L-lysine (0,1% dans l'eau; tableau 1). Fais tourner ce «colle» sur la lamelle à l'aide d'une pipette, attendre 1 - 2 min, rincer 3 - 4 fois avec la solution isotonique et secouer loin la solution restante.
3. Remplir la chambre avec la solution isotonique. Ensuite, ajoutez une goutte de protoplastes contenant une solution à la chambre, à l'aide d'une pipette coupée et attendre 3 - 4 min pour les protoplastes se déposer. Couvrir la chambre avec un couvercle transparent (figures 1D, 1E) de toucher la surface de la solution (éviter la formation de bulles sous).
4. Placer la lame (doucement!) Sur une table de microscope inversé, connectez-le au système de perfusion et la pompe (se prémunir contre des bulles d'air dans le tube!) Et tourner sur le flux de solution isotonique pour perfusion constante à 1 ml / min (vitesses plus rapides peut être utilisé, à 4 ml / min).
5. Pour l'enregistrementles variations de volume, un microscope inversé est utilisé, avec un objectif 20X et avec une caméra vidéo CCD reliée à un ordinateur de type PC. Utilisez la CMU 1394 Camera Driver "plug-in du logiciel ImageJ (voir la Table des Matières spécifiques pour les adresses de téléchargement de ces deux morceaux de logiciels) pour enregistrer une vidéo film de 60 secondes de protoplastes immobiles sélectionnés (sans doute, ceux qui sont coincés au fond) à une vitesse de 1 image / seconde (1 Hz). Lancer l'enregistrement avec un lavage à 15 sec de la solution isotonique (ce qui constitue la ligne de base), l'interrupteur de la solution hypotonique pendant 45 s (pour compléter un total de 60 s à partir du début de la perfusion). Enregistrer le film en format TIF. REMARQUE: Choisissez un champ de vision avec autant de cellules que possible, répondant aux critères suivants: sphériques en forme et avec un contour de cellule bien ciblée à leur plus grand périmètre (figure 2A).

4. analyse de l'évolution cellulaire de volume à l'aide ImageJ

REMARQUE: Pour analyser l'série d'images d'un gonflement cellulaire, utilisez le 'Image Explorer »et plugins' Protoplast Analyzer» dans le logiciel ImageJ (écrit par Xavier Draye) ^14. En commençant par les protoplastes choisis à leur premier point de temps, le plugin le 'Protoplast Analyzer »détecte automatiquement les protoplastes bords (contours) et de calculer le cours du temps de leurs domaines au cours de l'expérience (les plugins sont disponibles avec le programme d'analyse PfFit, ci-dessous) .

1. Lancer ImageJ. Pour ouvrir le film, cliquez sur «Fichier» sur le panneau ImageJ, puis, successivement sur les menus déroulants tels qu'ils se déroulent: «Importer», puis «de Image Explorer. Mettez en surbrillance le film choisi, puis faites un clic droit dessus, puis clic gauche sur "Protoplast Analyzer». Parcourez le film (à l'aide d'un curseur à l'image du bas de protoplastes) d'identifier les protoplastes qui restent en grande partie immobiles pendant l'expérience - ils seront analysés. Retour sur la première image, à l'aide de la souris, tracer des cercles (cueillies dans les outils de dessin de ImageJ) autour des protoplastes sélectionnés (figure 2B), puis cliquez sur «OK» dans le tableau des "paramètres de détection» qui sont apparus.
2. Pour lancer l'algorithme de détection de protoplastes, cliquez sur «Local» sur le panneau supérieur de l'image de protoplastes, puis «processus» dans le menu déroulant. Examiner les cercles verts autour des protoplastes sélectionnés (figure 2C) tout au long du film. Enregistrez le «Résultats» dans un fichier Excel. Quitter ImageJ. NOTE: Dans le cas où un point rouge apparaît (pour indiquer une mauvaise contour en forme - le plus souvent en raison d'un contraste d'image médiocre), relancez avec des paramètres différents.
3. Pour séparer les lignes appartenant à chaque cellule (qui - si deux ou plusieurs cellules ont été analysées simultanément - sera liée, parce que l'analyse se fait image par image), dans Excel, trier les données enregistrées par la colonne du nombre de cellules ('objet' ).
4. Pour DeTermine le facteur de conversion pixel-à-um pour obtenir la valeur réelle de P _f, casser l'image d'un dirigeant du micromètre par le même objectif 20X de microscope. Faites glisser une ligne (cueillis dans les outils de dessin de ImageJ) le long de l'image de la règle et de lire le nombre de pixels équivalente à la longueur de la règle dans le bas du panneau principal ImageJ. Convertir les valeurs de la zone pixel arbitraires dans le fichier Excel dans um ^2. Enregistrer le cours zones de temps (pour chaque cellule séparément) sous forme de fichier texte (deux colonnes de chiffres uniquement). NOTE: Ce sera une contribution au programme de volume ajusté 'PfFit.

5 Modélisation du taux de osmolarité changement dans la Chambre expérimentale utilisant ImageJ et le programme Matlab P _f Fit

1. Ajouter 2 mg xylene cyanol (tableau 1, ci-dessous) à 100 ml de la solution isotonique (pour produire le «colorant indicateur).
2. Préparer le système de perfusion (comme en 3.1) avec le colorant indicateur et le non-teinte hsolution ypotonic.
3. Sceller une lamelle avec de la graisse de silicium au fond de la chambre en plexiglas, puis versez doucement la chambre avec le colorant indicateur, couvrir avec une lamelle (comme avec les protoplastes avant) et le placer sur la platine du microscope.
4. Connectez la chambre au système de perfusion et de la pompe, et tourner sur le flux colorant indicateur pour une perfusion constante à l ml / min.
5. Enregistrer un film de 60 secondes à la fréquence de 1 Hz. Lancer l'enregistrement avec 15 sec de colorant indicateur, passer à la solution hypotonique pendant 45 sec. Arrêter de filmer. Rincer avec de l'indicateur Dye (au moins pour 30 sec), puis commencer un nouveau film. Répétez environ 5 - 6 fois et enregistrer tous les films
6. Utiliser le logiciel ImageJ à analyser les images vidéo de la transmittance colorant indicateur d'obtenir une évolution dans le temps de la modification moyenne de la transmittance.
   1. Lancer ImageJ, cliquez sur «Fichier», puis, «Ouvrir», et parcourir pour le film. Pour chaque film, dessiner un 10 pixels de large verticalrectangle n'importe où sur le 1 ^er image du film. Cliquez sur "Image" sur le panneau principal ImageJ, puis cliquez sur «culture» dans le menu déroulant.
   2. Pour aligner les 60 images (du film de 60 secondes) dans une rangée, cliquez à nouveau sur "Image", puis cliquez sur consécutivement dans les menus déroulants tels qu'ils se déroulent: «Stacks» et «Faire Montage" (colonnes 60, lignes 1). Dessinez un 1 pixel de haut rectangle horizontal partout sur toute la rangée d'images et cliquez sur "Analyser" dans le panneau principal ImageJ, puis cliquez sur le profil de complot »dans le menu déroulant. REMARQUE: Un «Terrain de Montage« fenêtre apparaîtra (non représenté), et une liste de données de transmission peuvent être ouverts à partir de son menu. Chaque image du film est représenté dans cette liste de 10 valeurs de transmission provenant de son 10 pixels de large rectangle et par conséquent la "base de temps" (l'image numéro séquentiel) est 10 fois plus longtemps.
   3. Copiez les listes de la dat de transmissionun (une liste par film) vers un fichier Excel. La moyenne des cours de temps de transmittance obtenus à partir des plusieurs films des bouffées de colorant indicateur. Générer une véritable base de temps en multipliant l'image numéro séquentiel de 0,1. Enregistrez le cours du temps en moyenne (deux colonnes) dans un fichier texte. NOTE: Avant la moyenne, si on le souhaite, tracer les cours à temps individuels, de rejeter toute irrégularité. Assurez-vous que le film comprend au moins 5 sec finale de l'état stable de transmission du colorant indicateur.
7. Démarrez le programme Matlab raccord P _f Fit (panneau du «indicateur Fit", Figure 3) pour calculer les différents paramètres de l'évolution dans le temps de l'osmolarité. Remarque: sur la base des concentrations initiales et finales connues de la solution dans le bain, au cours du temps de la concentration osmotique changement de la solution est calculée à partir de l'évolution temporelle de la concentration (calculée en retour à partir de la transmission de l'indicateur de colorant), en supposant qu'il suit la même dynamique que laconcentration de colorant. P _f Fit est un programme disponible pour une utilisation gratuite. Le «PfFit_Installer_web.exe 'peut être téléchargé à partir de: P _f Guide des coupes de l'utilisateur» avec des explications et des définitions détaillées est accessible via Jupiter dans un fichier supplémentaire, ce qui contribue à familiariser l'utilisateur avec le programme Fit P _f.
8. Dans le panneau «indicateur Fit", importer les données de l'évolution dans le temps moyen de la transmission Indicateur Dye («fichier de données Indicateur», figure 3A) et insérer manuellement les paramètres expérimentaux actuels et les estimations initiales de de la largeur 'les paramètres et' t_half "décrivant l'évolution temporelle de la concentration du colorant indicateur (figure 3B. Cliquez sur" Exécuter "pour afficher les courbes des cours à temps de la concentration du colorant indicateur (données réelles et en forme, figure 4A), et de la valeur calculée) bain modélisé ( osmolarité (figure 4B). REMARQUE: agood ajustement aux données est indispensable (recommandation: commencer par les valeurs indiquées dans la figure 3).

6 Détermination de la _f de P en utilisant le programme d'ajustement de Matlab P _f Fit

NOTE: En plus des hypothèses de base en ce qui concerne le comportement d'un protoplaste comme un osmomètre vraie et parfaite ^11, la détermination de P _f repose sur la présomption que P _f peut changer avec le temps, que cette dynamique de P _f sous-tend le temps cours de la variation de volume de la cellule et que les trois paramètres suffisent pour le décrire: P _fi (la valeur initiale de P _f), la pente _Pf (le taux de la variation linéaire de P _f) et de retard (la période allant du début de la baignoire changement de l'osmolarité jusqu'au début de la variation de volume de la cellule). Différents modèles peuvent être testés, y compris différentes combinaisons de ces paramètres et leurs valeurs, y compris les valeurs nulles ^11. P _{f Fit cherche la meilleure combinaison de ces paramètres pour obtenir - par calcul - la reproduction la plus fidèle de l'évolution dans le temps expérimentale de la variation de volume de la cellule ^11, calculé, à son tour, de la série importés de zones cellulaire contour (voir aussi le complémentaire 'P f Guide Fit de l'utilisateur »).}

1. Passez au volet 'Volume Fit' (figure 5). Choisissez pour l'importation du fichier de données sur les aires (le fichier texte avec le cours du temps des «zones» de protoplastes analysés, figure 5A). Choisissez l'option «Dernière indicateur de pose» comme source de paramètres (figure 5B, voir le 'P _f Fit Guide de l'utilisateur »pour des solutions de rechange). REMARQUE: Ces paramètres (figure 5D) est ensuite utilisé pour régénérer le changement osmotique dans le bain pendant les volumes procédure d'ajustement.
2. Dans le panneau «Volume Fit '(figure 5C), initialiser (remplir les estimations initiales pour) les P _f paramètres: P _f, pente _Pf et Delay (recommandation: commencer par 1, 1, et 30, respectivement), a choisi le modèle 'Class' (une recommandation: commencer par II et marque «contrôles» pour les trois paramètres qui doivent être montées). Cliquez sur "Exécuter", puis globe oculaire le chiffre provisoire (Figure 5E) et régler le paramètre Delay et la longueur de l'enregistrement, si nécessaire.
3. Examinez le graphique des résultats (Figure 6) pour évaluer la qualité en forme et enregistrer l'erreur ajustement. Modifiez les paramètres d'initialisation un peu plier chaque, et re-'Run. NOTE: Ne vous découragez pas lorsque le programme est bloqué - juste redémarrer le programme!
4. Répéter cette procédure plusieurs fois, en commençant par différentes combinaisons de paramètres d'initialisation, en vue de la plus faible valeur de l'erreur est nécessaire.
5. Copiez la liste des résultats ajustement directement à partir de l'écran, ou les trouver en til PfFit généré le fichier '_FIT_Vol_Results.txt.

Résultats

Afin de déterminer la P _f et comparer l'activité des différents AQP, les protoplastes du mésophylle des feuilles de Arabidopsis sont utilisés. Ces protoplastes ont été trouvés à avoir de faibles basale (arrière-plan) des niveaux P _f ⁷ et peuvent servir comme un système fonctionnel d'expression pour permettre des mesures P _f reproductibles.

Protoplastes d'une feuille adulte à partir d'une ancienne usine d'Arabidopsis ...

Discussion

Décrit ici est un procédé simple et très efficace pour la mesure de la P _f de protoplastes végétaux isolés, en principe applicable aussi à d'autres cellules sphériques, par exemple., Les ovocytes de grenouille ^11. Cette méthode est basée sur la mesure de la P _f en réponse à un défi osmotique de la cellule. A la différence des autres méthodes basées sur cette approche, cependant, le changement de solutions, à savoir, d'osmolarité, n'est pas...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl	Chem-Impex International	01247-1	http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade
CaCl2	Merck	11718006	http://www.merck.com Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)	Sigma	15152002	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
D-Sorbitol	Sigma	18032003	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
Cellulase	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS002603	http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase	Karlan,               Phonix, AZ, USA	8006	http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)	Sigma	81420	http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418-5G	http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate	Sigma	P4380	http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920	http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol	Sigma	X4126	http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy	Merck	107921	https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100/TS100F	http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump	BIO-RAD	EP-1 Econo Pump	http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera	Scion Corporation	CFW-1308M	http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ	Carnegie Mellon		http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit	BIO-RAD	731-9006	http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold	DirectMed		http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns)	Welford	IF-BR-001	http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing	TYGON	R-3603	http://www.usplastic.com
Plexiglass slide etc.	Perspectiv		http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'.
3M packaging Scotch tape 1'', clear	Viking Industrial, UK	VKMONO25	http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK