Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Özet

Hücrelerin ozmotik su geçirgenliği katsayısı (P _f) Ölçme aquaporins düzenleyici mekanizmaları (AQPs) anlamanıza yardımcı olabilir. Burada yer küresel bitki hücresi protoplastlarının P _ön tespiti protoplast izolasyon ve sürekli Banyo perfüzyonu sırasında bir ozmotik meydan okuma sonucu olan hacim değişim başlangıç ​​hızının sayısal analizini içerir.

Özet

AQP düzenleme mekanizmaları incelenmesi hücresel ve tüm bitki düzeyde hem de su ilişkileri anlamak için önemlidir. Ozmotik su geçirgenlik katsayısı, bitki protoplastlarına (P _f) örneğin kurbağa oositlerine gibi küresel hücrelerin de ilke olarak uygulanabilir belirlenmesi için basit ve çok etkili bir yöntemdir burada sunulmuştur. Deneyin birinci aşaması, uygun bir izotonik çözelti ile bir bölme içine enzimatik sindirme ile ilgi konusu bitki dokusundan protoplastların izolasyondur. İkinci aşama, bir ozmotik meydan deneyi oluşur: bölmenin altındaki hareketsiz protoplastlar hipotonik bir solüsyon ile bir izotonik çözelti ile sürekli bir başlangıç ​​perfüzyon sunulmuş ve izlenmektedir. Hücre şişmesi video kaydedildi. Üçüncü aşamada, görsel birim değişikliklere yol isimli işlenir ve hacim değişikliklerini gösteren zaman süreci osmola değişimin zaman seyri ile ilişkilidiroda perfüzyon ortamının lik P _f vermek üzere, Matlab ('PfFit') yazılmış bir eğri uydurma bir prosedür kullanma.

Giriş

Hücresel zarların arasında su alımı ve akış hücresel ve tüm bitki düzeyde hem de bitki varlığı için temel bir gerekliliktir. Hücresel düzeyde, aquaporinler (AQPs) hücre membranı ^1-3 ozmotik su geçirgenlik katsayısı (P _f) düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır.

Bugüne kadar, çeşitli yöntemler farklı bitki organlardan Protoplastın endojen P _f ölçüm istihdam edilmiştir (yani kökleri, mezofil, endodermis, vb., Chaumont'dan ve ark. ⁴ tarafından incelenmiştir). P _f ölçmek için yaklaşımlardan biri ozmotik bir meydan protoplastlarını maruz ve hacmi değişim başlangıç ​​hızını izlemek için (yani., Hacim değişimi erken doğrusal faz eğimi). İki farklı yöntemleri daha önce çözümlerin bir anlık değişimi bu yaklaşıma dayanarak tarif, hem esas alınmıştır. Birincisi Hareketsizleştirme oluşmaktadırbir emme mikropipet ile protoplast ing ve çözelti akışını ⁵ ve bir mikropipet ⁶ kullanarak bir çözümden protoplast aktarılması ikinci bir anahtarlama. Hızlı çözüm döviz çok başında görüntü toplama izin bu mikropipet emme ve mikropipet aktarılması yöntemleri, büyük olasılıkla protoplastlannda fiziksel stres içeren, (hacim değişim erken doğrusal faz yakalamak için) ve özel ekipman ve uzman Mikromanipülasyondan gerektirir.

Burada tarif edildiği gibi bir yöntem içerir Mikromanipülasyondan ve banyo perfüzyon anlık değilken p _f türetilmesini izin verir hücrelere bozulmasını minimuma indirmesidir.

Enzimatik sindirimden sonra bir izotonik çözelti içinde suya batırılmış olan protoplastlar, yük etkileşimi ile lamel cam bir pleksiglas tabanı (aka Lucite veya pleksiglas) bölmesi üzerinde immobilize edilir. Daha sonra, sabit bir Banyo perfüzyonu esnasında,izotonik çözelti, protoplastlar için hypoosmotic talebin oluşturulması hipotonik bir solüsyon ile uzağa akıtılmaktadır. Protoplastın şişme video çekilir ve daha sonra, banyo perfüzyon bir zaman süreci ve hücre şişmesi zamanla ilgili enformasyonun birleştirilmesiyle, P _f görüntü işleme ve eğri uydurma prosedürleriyle belirlenebilir olmasıdır.

Bu yöntemin avantajı, deney çok etkili olduğunu olan tek bir analizinde aynı anda birkaç hücre kontrol etmek mümkündür, ve özel ekipman veya belirli bir mikro manipülasyon beceri gerektirmez dikkat edilmelidir. Bu yöntem için çeşitli uygulamalar mümkündür. Örneğin, mezofil gibi farklı dokular ve bitkiler, bir hücre çeşitli doğal p _f belirlenmesi ve Arabidopsis yaprağı ^7, mısır yaprak mezofil veya kök korteks hücreler ^8-10 ya da süspansiyonunda kültürlenmiş hücrelerden ^11,12 ikinci kılıf hücreleri ile birlikte gelmektedir. Additi içinde, bir oosit bu hücreler ¹¹ olarak küresel hayvan hücrelerinin P _f belirlemek mümkündür. P _f katkıları ve belirlenmesi; başka bir örnek protoplastlarında (örneğin Kinazlann genler veya herhangi diğer genlerin onları etkileyebilir) kendi geninin geçici ifade ile AQP faaliyet incelenmesini içermektedir; 2 PEG dönüşüm ve kararlılıkla SlTIP2 tarafından Arabidopsis'teki mezofıl protoplastlarında,, örneğin, domates AQP SlTIP2 ifadesi için ¹³ _f P 2-ilişkili. Son olarak, (gibi ilaçlar, hormonlar,) farklı molekül / maddelerin P _f üzerindeki etkisinin incelenmesi de AQP engelleyici HgCl ₂ ⁷ örneğin, incelenebilir çözeltilerine ilave edildi.

Aşağıdaki protokol, Arabidopsis mezofil hücreleri ve bunların p _f belirlenmesi protoplastların izole edilmesini tarif etmektedir.

Protokol

Çözümleri 1. Hazırlık

1. Hazırlama izotonik (600 mOsm) ve hipotonik 10 mM KCI, 1 mM _CaCI2, ve ihtiva eden (500 mOsm) çözeltiler 8 M 2-(N-morfolin) -ethanesulphonic asit (MES), pH 5.7 ve uygun miktarda ozmolaritenin ayarlanması D-sorbitol: izotonik ve hipotonik çözüm için 440 mM 540 mM. Bir osmometre kullanılarak (veya hedef değerinin% 3 olan), solüsyonun osmolaritesini edin.
2. Aşağıdaki enzimleri içeren "enzimatik kaynaşması bir kuru stok hazırlayın: 0.55 g, selülaz 0.1 gr pektoliyazdır 0.33 g polivinilpirolidon K 30, 0.33 gr, BSA (bakınız Tablo 1, aşağıda) vorteksle kuru toz karışımı, 5.7 mg alikotları olun ve -20 ° C'de saklayın.

Arabidopsis Mezofil protoplastlan 2. izolasyonu

1. Yaklaşık 6 damla bir petri kabının (10 cm) hazırlanması (yakl. 30 ul her biri) izotonik çözeltisi.
2. Peel abaxial (alt) Arabidopsis yaprak epidermis, cdaha sonra çözeltinin temas aşağı açıktaki yüzü alt yüzey damla izotonik çözelti üzerine yerleştirin kareleri, yaklaşık 4 x 4 mm ² kareler halinde soyulmuş yaprak ut.
3. , 165 ul, 1.5 ml bir tüp içinde izotonik çözeltisi (ağ / ağ% 3.3) enzim karışımı 5.7 mg çözülür çözülene kadar bir dakika kadar pipetleme yavaşça karıştırın ve aynı Petri enzimatik solüsyonun bir kaç benzer damla yerleştirmek çanak.
4. , 28 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosu içinde çanak yüzen parafilm bir yuvarlak conta kapağı çanak kapatın ve 20 dakika boyunca inkübe damla enzimatik solüsyon üzerine yaprak parçaları aktarın.
5. Çanak izotonik çözeltinin daha birkaç damla (her bir enzim çözeltisi damla başına 2 damla) ekleyin. Yeni bir izotonik çözelti damla Her bir yaprak parçası aktarın, sonra art arda ikinci bir damla (uzakta enzimatik solüsyon yıkamak). , Forseps kullanarak kenarından parça kaldırın o protoplastlarını serbest bırakmak için (bir çay poşeti gibi), ikinci açılan sallayın.1.5 ml tüp içine (bir kırpılır 100 ul pipet kullanarak) protoplastların ile damla toplamak.

3. Hipotonik Mücadelesi Tahlili: Arabidopsis Mezofil Hücre şişmesi

1. Hipotonik çözelti ile izotonik çözeltisi ve bir sütun ile bir sütun doldurarak perfüzyon sistemi (Şekil 1A) hazırlayın. Aşağı emme manifoldu (Şekil 1B) için boruya tüm yol doldurmak için bazı çözüm akışını (ilk hipotonik, daha sonra izotonik), vanayı açalım. Sıkışmış hava kabarcıkları vardır emin olun, ve sonra vanayı kapatın.
2. (, Aynı zamanda Şekil 1C'de bölmenin şema Şekil 1B) pleksiglas slayt içinde odacık için bir alt yapmak için, silikon yağı (Tablo 1) ile, bir lamel Seal. Protoplastlar kat için "yapışkan" (gres halka içinde lamel yukarı bakacak açıkta kalan yüzeyini) odasının altını yapmak için buya da poli-L-lisin (su içinde% 0.1 Tablo 1), pozitif yük taşıyan protamin sülfat (Tablo 1 su içinde% 1). 2 dakika yıkayın 3 - 1 - beklemek, bir pipet kullanarak lamel boyunca bu 'tutkal' Spread 4 kez izotonik solüsyonu ile ve kalan çözümü uzakta sallayın.
3. Izotonik solüsyonu ile odası kadar doldurun. Daha sonra, kırpılıp pipet kullanarak, bölmeye çözeltisi içeren bir protoplast damla ekleyin ve 3 bekleyin - protoplastlar yerleşmek için 4 dak. Şeffaf kapak (Şekil 1D, 1E) ile odasını (altında hava kabarcığı önlemek) çözelti yüzeyine dokunmadan örtün.
4. (Hızlı oranları, bir mikroskop masaya (! Hafifçe) slayt yerleştirin perfüzyon sistemi ve (tüp! Hava kabarcıkları karşı koruma) pompaya bağlamak ve 1 ml / dakika sabit perfüzyon için izotonik çözelti akışına açmak 4 ml / dakika) kadar kullanılabilir.
5. Kayıt içinhacim değişiklikleri, bir inverted mikroskop ile bir 20x objektif ve bir bilgisayar bilgisayara bağlı bir CCD video kamera ile birlikte kullanılır. Seçilen hareketsiz protoplasmalar 60 saniye video film kaydetmek için ImageJ yazılım 'CMU 1394 Camera Driver' eklentisi (bu iki yazılım adet indirme adresleri için özel Malzemelerin Tabloya bakınız) kullanın (muhtemelen, altına sıkışmış olanlar) 1 resim / sn (1 Hz) hızında. Izotonik çözeltinin 15 saniye yıkama ile Kaydı (bu taban çizgisini teşkil) başlatın 45 saniye boyunca hipotonik bir solüsyon geçmek (perfüzyonun başlamasından itibaren toplam 60 saniye tamamlamak için). TIF formatında film kaydedebilirsiniz. Not: yani en büyük çevre uzunluğu (Şekil 2A) ile şekli ve iyi odaklanmış hücre konturuna sahip küresel: aşağıdaki kriterleri yerine mümkün olduğunca çok sayıda hücreleri ile bir görünüm alanı seçin.

ImageJ Kullanarak Hücre Hacmi Değişim 4. Analizi

NOT: analiz etmekBir şişme hücrenin görüntülerin dizi, 'Image Explorer' ve (Xavier DRAYE tarafından yazılmış) ImageJ yazılım ¹⁴ 'Asal Analyzer' eklentileri kullanabilirsiniz. Ilk zaman noktasında seçilmiş protoplastları ile başlayarak, 'protoplast Analyzer' eklentisi otomatik protoplastlar kenarları (kontür) algılar ve (eklentileri altında PfFit analiz programı ile kullanılabilir), deney sırasında alanlarında zaman sürecini hesaplamak .

1. ImageJ başlatın. Onlar açılmak gibi filmi açmak için, açılan menüleri ard arda, sonra, ImageJ panelde 'Dosya' tıklatın: 'Al' ardından 'Image Explorer'. Seçilen filmi vurgulayın, daha sonra üzerine sağ tıklayın, ardından 'Asal Analyzer' üzerine tıklayın bıraktı. Deney sırasında büyük ölçüde hareketsiz kalır protoplastlarını tanımlamak için (protoplast görüntü altındaki kaydırıcıyı kullanarak) film göz atın - bu analiz edilecektir. Geri ilk ima üzerindege, fareyi kullanarak, daha sonra ortaya çıkan 'Algılama parametrelerinin' tablosunda 'Tamam' ı tıklatın, seçili protoplastların (Şekil 2B) etrafında (ImageJ çizim araçları aldım) daireler çizin.
2. Protoplast algılama algoritması başlatmak için, açılır menüden sonra, protoplast görüntü üst panelde 'Süreci' Yerel 'tıklayın. Film boyunca seçilen protoplastlarının (Şekil 2C) etrafında yeşil daireler inceleyin. Bir Excel dosyası 'Sonuç' kaydedin. ImageJ çıkın. NOT: Bir kırmızı nokta belirir durumda (kötü bir kontur uyum göstermek için - genellikle nedeniyle kötü bir görüntü kontrast) farklı parametreler ile yeniden.
3. Her bir hücreye ait satırları ayırmak için (- İki veya daha fazla hücre eş zamanlı analiz edildi - eğer analiz çerçeve çerçeve yapılır, çünkü iç içe olacak), Excel, hücre sayısı sütunu ('nesne' tarafından kaydedilen verileri sıralamak ).
4. DETE içinP _f gerçek değeri elde etmek için piksel-um dönüşüm faktörü rmine aynı 20X mikroskop objektif ile bir mikrometre hükümdarın bir görüntü oturtun. Cetvel görüntüsü boyunca (ImageJ çizim araçları aldım) bir çizgi sürükleyin ve ImageJ Ana panelin altındaki cetvel uzunluğu piksel sayısı eşdeğer okuyun. Um ² içine Excel dosyasındaki keyfi piksel alanı değerleri dönüştürmek. Bir metin dosyası olarak (her hücre için ayrı ayrı) (sayıların iki sütun yalnızca) alanlar zaman ders kaydedin. NOT: Bu birim-uydurma 'PfFit' programına bir giriş olacaktır.

5. ImageJ ve Matlab Programı P _f Fit kullanarak Deneysel Odası'nda Ozmolarite Değişim Oranı Modelleme

1. Izotonik çözeltisi ('endikatörü bir boya' üretmek için) 100 ml iksilen siyanol, 2 mg (Tablo 1, aşağıda) ekleyin.
2. Gösterge Boya ve olmayan boyalı h (3.1 gibi) perfüzyon sistemi hazırlayınypotonic çözeltisi.
3. Bir kayar kapak (daha önce olduğu gibi asal hücreler) ile örtün ve mikroskop sahne üzerine yerleştirin, yavaşça bir işaret boya ile odacığını doldurmak, Pleksiglas odasının tabanına silikon yağı ile bir kapak kayma Seal.
4. Perfüzyon sistemine ve pompa odasına bağlayın ve L. ml / dakika bir sabit perfüzyon için bir işaret boya akışını açın.
5. 1 Hz hızında 60 saniye filmi kaydedin. Gösterge Dye 15 sn Kaydı başlatmak, 45 saniye boyunca hipotonik çözüm geçmek. Filme durdurun. Gösterge Dye (en az 30 saniye boyunca) ile aynı hizada, daha sonra yeni bir film başlar. 6 kez ve tüm filmleri kaydetmek - yaklaşık 5 tekrarlayın
6. Değişen geçirgenliği bir ortalama zaman ders almak için Gösterge Boya geçirgenliği video görüntülerini analiz etmek ImageJ yazılımını kullanın.
   1. ImageJ başlayın, 'Dosya', ardından 'Aç' düğmesine tıklayın ve film için göz atın. Her film için, 10 piksel genişliğinde dikey çizinFilmin ^1. görüntü üzerinde herhangi bir yere dikdörtgen. Sonra açılır menüsünde 'Crop' tıklayın, ImageJ ana panelde 'Image' tıklayın.
   2. 'Montage olun' Yığınlar 've (sütunlar 60, satırlar 1): onlar açılmak gibi yine' Image 'tıklayın, bir satır (60 sn film) 60 kare hizalamak için, ardından açılan menülerde arka arkaya tıklayın. Her yerde görüntülerin bütün satır boyunca 1 piksel yüksekliğinde yatay dikdörtgen çizin ve ImageJ ana panelde 'Analiz' ı tıklatın, sonra açılır menüden 'komplo profili' ı tıklatın. NOT: (gösterilmemiştir) görünecektir pencerede A 'Montage Plot', ve geçirgenlik verileriyle bir liste onun menüden açılabilir. Filmin her görüntü onun 10 piksel genişliğinde dikdörtgen ve dolayısıyla "zaman tabanı" menşeli 10 geçirgenlik değerleri ile bu listede temsil edilir (görüntü ardışık sayı) 10 kat daha uzundur.
   3. Geçirgenliği dat listelerini kopyalayınBir Excel dosyasına (film başına bir liste). Gösterge Boya sürgünlerinin çeşitli filmlerde elde geçirgenliği zamanlı kurslar ortalama. 0.1 ile görüntü sıralı sayısı çarpılarak gerçek zamanlı tabanı oluşturmak. Bir metin dosyasına ortalama zaman ders (iki sütun) kaydedin. NOT: Ortalamanın önce, eğer istenirse, herhangi bir usulsüzlük reddetmek, bireysel zamanlı kurslar arsa. Film Gösterge Dye kararlı durum geçirgenliği en az 5 Final sn de içerir emin olun.
7. Ozmolaritenin zaman dersin çeşitli parametreleri hesaplamak için Matlab uydurma programı P _f Fit ('Gösterge Oturan' paneli, Şekil 3) başlatın. Not: banyosunda çözeltinin bilinen ilk ve son yoğunluklara dayanan, çözeltinin ozmotik değişen konsantrasyon zaman süreci varsayılarak, (Gösterge Boya geçirgenliğinden, sırayla, hesaplanan) konsantrasyon zaman süresi hesaplanır aynı dinamikleri izlerboya konsantrasyonu. P _f Fit ücretsiz olarak kullanabilecekleri bir programdır. P _f Fit programı ile kullanıcıya tanıtmak için yardımcı bir Ek dosyası olarak vallahi erişilebilir detaylı açıklamalar ve tanımlar P _f Fit Kullanım Kılavuzu ':' PfFit_Installer_web.exe 'dan indirebilirsiniz.
8. 'Gösterge Oturan' panelinde, Gösterge Boya geçirgenliği ('Gösterge veri dosyası', Şekil 3A) ortalama süre dersin veri almak ve elle mevcut deney parametreleri ve parametrelerin genişliği 've' ilk tahminler takın t_half Gösterge Boya konsantrasyonunun zamanlı kurslar araziler (gerçek veri ve formda Şekil 4A) görüntülemek için Çalıştır 'Gösterge Boya konsantrasyonu (Şekil 3B zaman sürecini anlatan. Click' ve modellenmiş (hesaplanan) banyo ozmolaritenin (Şekil 4B) NOT:. agVerilere ood uygun esastır (bir öneri: Şekil 3'te gösterilen değerlerle başlatın).

6. Matlab Montaj Program P _f Fit kullanarak P _f Belirlenmesi

NOT: Bir doğru ve mükemmel osmometresi ¹¹ gibi bir Protoplastın davranışı ile ilgili temel varsayımlara ilave olarak, P _f belirlenmesi P _f P _f bu dinamikleri zaman altında yatan neden olduğunu, zamanla değişebileceğini karinesine dayanır hücre hacmi değişim seyri ve bu üç parametre bunu açıklamak için yeterli: P _fi (P _f başlangıç ​​değeri), Eğim _Pf (P _f doğrusal değişim oranı) ve Delay (banyo baştan dönemi Hücre hacminin değişim başlamasından itibaren osmolarite fark). Farklı modeller null değerleri ¹¹ dahil olmak üzere farklı bu parametrelerin kombinasyonları ve bunların değerleri, dahil, test edilebilir. P _{Fit elde etmek için bu parametrelerin en iyi kombinasyonu için arama f - hesaplanmasıyla - hücre hacim değişikliği ^11, hesaplanan deney süresi tabii ki en güvenilir üretimi, sonra da hücre-kontur alanlarında ithal dizisinden (bakınız Ayrıca Ek 'P f Fit Kullanım Kılavuzu').}

1. 'Ses Fit' paneli (Şekil 5) geçin. Ithalat için alanları veri dosyasını (analiz protoplastlarının, Şekil 5A bir 'alanlar' zamanı ders ile metin dosyası) seçin. Parametresi kaynak olarak 'Son Göstergesi Uydurma' seçin (Şekil 5B; alternatifler için 'P _f Fit Kullanım Kılavuzu' bakınız). NOT: Bu parametreler (Şekil 5D) ve sonra prosedür montaj hacimleri için banyo ozmotikum değişim yeniden oluşturmak için kullanılır.
2. 'Ses Fit' paneli (Şekil 5C) olarak, başlatılamadı (için ilk tahminler) P _f parametreleri doldurmak: P _f Eğim _Pf ve Gecikme (bir öneri:, modeli 'Sınıf' Seçti sırasıyla 1, 1, ve 30,) ile başlar (bir öneri: II ve işareti ile başlayın her üç parametre için 'çek') takılacaktır. Daha sonra ara rakam (Şekil 5E) küresi ve gerekirse Gecikme parametre ve kayıt uzunluğunu ayarlamak, 'Run' tıklayın.
3. Uyum kalitesini değerlendirmek ve uygun hatayı kaydetmek için sonuçlar grafiği (Şekil 6) inceleyin. Birkaç her kat başlatılırken parametrelerini değiştirmek ve '-'Run yeniden. NOT: Program takılıyor zaman cesaretini etmeyin - sadece programı yeniden başlatın!
4. Uyum hata en düşük değer amaçlayan, başlatma parametrelerinin farklı kombinasyonları ile başlayan, bu işlemi birkaç kez tekrarlayın.
5. Ekrandan doğrudan uyum sonuçlarının listesini kopyalayın, ya da t onları bulmako _FIT_Vol_Results.txt 'dosyası oluşturulan PfFit.

Sonuçlar

Farklı AQPs aktivitesini P _f belirlenmesi ve karşılaştırılması amacıyla, Arabidopsis yaprağı mezofil protoplastlar kullanılırlar. Bu protoplastlar düşük bazal (temel) p _f seviyeleri ⁷ sahip oldukları bulunmuştur ve yeniden üretilebilir bir p _f ölçümleri etkinleştirmek için bir fonksiyon-ekspresyon sistemi olarak hizmet verebilir.

6 haftalık Arabidopsis olgun bir bitki yapraktan Asal hücreler izole edilmiştir ve üç gen Ar...

Tartışmalar

Burada tarif edilen başka bir küresel hücrelerin de, ilke olarak uygulanabilir izole bitki protoplast P, _K, örn., Kurbağa oositlerine ¹¹ ölçmek için basit ve çok etkili bir yöntemdir. Bu metot, hücredeki bir ozmotik teste karşı tepki olarak P _f ölçülmesi esasına dayanır. Bu yaklaşıma göre, diğer yöntemlerin aksine, bununla birlikte, ozmolarite çözeltilerinin değişimi, yani, bazal hücre hacmi olan izotonik çözeltisi ile başlayarak sürekli ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl	Chem-Impex International	01247-1	http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade
CaCl2	Merck	11718006	http://www.merck.com Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)	Sigma	15152002	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
D-Sorbitol	Sigma	18032003	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
Cellulase	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS002603	http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase	Karlan,               Phonix, AZ, USA	8006	http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)	Sigma	81420	http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418-5G	http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate	Sigma	P4380	http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920	http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol	Sigma	X4126	http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy	Merck	107921	https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100/TS100F	http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump	BIO-RAD	EP-1 Econo Pump	http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera	Scion Corporation	CFW-1308M	http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ	Carnegie Mellon		http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit	BIO-RAD	731-9006	http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold	DirectMed		http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns)	Welford	IF-BR-001	http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing	TYGON	R-3603	http://www.usplastic.com
3M packaging Scotch tape 1'', clear	Viking Industrial, UK	VKMONO25	http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK