Estabilizar hepatocelular Fenotipo Usando superficies sintéticas optimizadas

Resumen

Este artículo se centrará en el desarrollo de superficies de polímero recubierto de largo plazo, la cultura estable de células madre derivadas de hepatocitos humanos.

Resumen

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.

Introducción

Los materiales biológicos han sido ampliamente utilizados en el mantenimiento y diferenciación de células madre pluripotentes ^1. Al tiempo que permite, estos sustratos biológicos a menudo contienen una gran cantidad de componentes no definidos. Matrigel es un sustrato comúnmente utilizado para el cultivo de células madre y la diferenciación. Desafortunadamente, su composición variable influye en la función celular y el fenotipo. Aunque una variedad de matrices biológicas alternativas, más definidos se han utilizado ^2-7, su origen animal o pobre escalabilidad les hace candidatos inadecuados para la fabricación industrial. Por lo tanto, la identificación de alternativas sintéticas, con composición definida y un rendimiento fiable, son objetivos clave en la investigación de células madre.

En un intento de superar las limitaciones de los sustratos de cultivo de células definidos, colaboraciones interdisciplinarios entre la química y la biología han identificado materiales sintéticos con la capacidad de soportar el fenotipo celular. Synthsustratos etic son escalables, rentables, y se pueden fabricar en complejas estructuras 3D, imitando el entorno en vivo. Debido a estas propiedades sustratos sintéticos han sido ampliamente utilizados para apoyar y conducir la diferenciación de muchos tipos de células ^8-10.

Ensayos avanzados y de alto rendimiento han facilitado la rápida detección de los materiales sintéticos, de grandes bibliotecas, y entregado nuevos materiales con propiedades flexibles con amplias aplicaciones en la investigación y el desarrollo ^11-13 biomédica. La utilización de un alto rendimiento, tecnología de tramado polímero micro-array, identificamos rápidamente en un sencillo de poliuretano (PU134), adecuado para el mantenimiento de los hepatocitos derivados de células madre humanas. Este polímero se encontró que era superior a sustratos derivados de animales con respecto a la diferenciación y la función de los hepatocitos ^14-16. Hemos optimizado posteriormente el proceso de condiciones de recubrimiento, la topografía y la esterilización para acceder a efectosen el rendimiento del polímero en la estabilización de función de los hepatocitos y la vida útil. Esto tiene implicaciones significativas en cuanto a la comprensión de los fundamentos de la biología de los hepatocitos para el modelado basado en células y aplicaciones de medicina regenerativa.

La tecnología aquí descrita representa un ejemplo de cómo la superficie de un polímero sintético puede ser optimizado para preservar el fenotipo celular. Creemos que la combinación de esta tecnología con un protocolo de diferenciación de hepatocitos sin suero eficiente tiene el potencial de proporcionar una producción escalable de hepatocitos para su uso en modelado in vitro y la medicina regenerativa.

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Protocolo

1 Síntesis de PHNGAD (Poli [1,6-hexanodiol / neopentil glicol / di (etilenglicol)-ácido adípico -alt] diol)

Esquema 1: Síntesis de PHNAGD Representación esquemática de la síntesis de PHNAGD.. PHNAGD se preparó por la reacción de 1,6-Hexanodiol, dietilenglicol, neoppentyl y ácido adípico. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / neopentil glicol / di (etilenglicol)-ácido adípico -alt] diol.

1. Aplicar un tratamiento térmico a los monómeros de 1,6-hexanodiol, di (etilenglicol) y neopentilglicol a 40 ° C durante 48 horas en un horno de vacío para eliminar el agua residual. Permitir al frío a temperatura ambiente bajo vacío.
2. Añadir 22 mmol de cada monómero y ácido adípico (55 mmol) a un matraz de fondo redondo de dos bocas, equipado con una barra de agitación y conectado a un aparato de Dean-Stark.
3. Coloque todo el conjunto bajo un vacío y calentar suavemente el glassware a 40 ° C durante 6 horas, con el fin de evitar cualquier absorción de humedad durante la adición de la sustancia química en el matraz.
4. Añadir medio de una jeringa, gota a gota, 0,0055 mol del catalizador de titanio (IV) butóxido de potasio.
5. Se agita la mezcla de reacción a 180 ° C, bajo una atmósfera de _N2 durante 24 horas, y recoger el agua residual en la trampa Dean-Stark. Deje que el producto se enfríe a temperatura ambiente.

2 Síntesis de PU134

Esquema 2: Síntesis de PU134 Representación esquemática de la síntesis de poliuretano 134. PU134 se preparó por la reacción de 1,0 equivalentes de un PHNGAD con 2,0 equiv de un 4,4 '-metilenbis (isocianato de fenilo), seguido por la adición de 1,0. equiv de un extensor de cadena de 1,4-butanodiol.

1. Mezclar un equivalente de la PHNGAD poliol (Mn ~ 1800 Da, 3,2 mmol) con dos equivalentes de 4'4-metilenbis (isocianato de fenilo) (6,4 mmol) en N, N-dimetilformamida (12 ml).
2. Se agita la mezcla de reacción a 70 ° C, bajo una atmósfera de _N2.
3. Añadir medio de una jeringa, gota a gota el catalizador de titanio (IV) butóxido de potasio (0,8% en peso).
4. Después de 1 hora, añadir un equivalente del prolongador de cadena de 1,4-butanodiol (3,2 mmol). Aumentar la temperatura a 90 ° C y se agita durante 24 h bajo una atmósfera de _N2.
5. Después de la reacción, recoger el poliuretano por precipitación por adición de éter dietílico (hexano o el agua también podría ser utilizado) gota a gota a la solución de reacción hasta que se produce la precipitación.
6. Centrifugar la solución a 5.300 xg durante 5 min.
7. Decantar el sobrenadante y secar a 40 ° C en un horno de vacío hasta que el disolvente se evapora.
   Nota: Con el fin de garantizar que el producto final de la reacción poseen los parámetros correctos con respecto a la distribución de peso molecular, los principales grupos funcionalesps del polímero, y las temperaturas de fusión y de transición vítrea, diversas técnicas y métodos de análisis se puede utilizar, tal como cromatografía de permeación en gel o espectroscopia FITR.

3 Preparación de Soluciones PU134

1. Pesar 200 mg de PU134 en una botella de vidrio.
2. Diluir PU134 a una concentración final de 2% en una serie de disolventes: cloroformo, una combinación de cloroformo y tolueno en proporción 1: 1, tetrahidrofurano, y la combinación de tetrahidrofurano y diclorometano en proporción 1: 1.
   Nota: La elección del disolvente adecuado varía dependiendo del polímero de usar. Diferentes disolventes poseen diferentes puntos de ebullición que pueden afectar a la solubilización del polímero.
3. Agitar la solución vigorosamente durante 20 min a temperatura ambiente usando un agitador a una velocidad de 200 mot / min, hasta que la solución se vuelve homogénea y se observó ningún precipitado.

4. revestimiento de cristal diapositivas con PU134

1. Coloque un round 15 mm ² cubreobjetos en la recubridora de rotación.
2. Aplique 50 l de la solución PU134 a cada uno usando una pipeta. Ajustar el volumen de la solución PU134 en consecuencia para el tamaño requerido cubreobjetos manteniendo el volumen a la superficie relación proporcional.
3. Haga girar cada cubreobjetos de 7 segundos a 23 x g.
4. Aire cubreobjetos seco a temperatura ambiente durante al menos 24 horas antes de la esterilización.

5. irradiación de Cubreobjetos

1. Gamma-irradiar cubreobjetos recubiertos de polímero mediante la aplicación de una dosis de 10 Grays usando un irradiador de laboratorio durante 12 min.
2. UV irradiar polímero recubierto cubreobjetos usando una 30 W, lámpara de rayos UV durante 16 minutos cada lado.
3. Coloque el cubreobjetos recubierto de polímero en una placa de cultivo tisular adecuado de acuerdo con el tamaño de diapositiva.

6. Microscopía Electrónica de Barrido

1. Oro escudo cubreobjetos polímero mediante pulverización catódica de 200 seg en una atmósfera de 5 x 10 ^-1 milibares de presión.
2. Capturar la micrographs del cubreobjetos recubierto con polímero utilizando un microscopio electrónico de barrido a un voltaje de aceleración de 20 kV en modo de imagen de electrones secundarios.

7. Observaciones Microscopía de Fuerza Atómica

1. Analiza un área de 20 x 20 m de la superficie del polímero.
2. Establecer una velocidad de barrido de 1,32 Hz a 1,60 Hz.
3. Configurar una resolución de 512 x 512 píxeles en la región explorada.
4. Calcula la raíz cuadrada media (RMS o Rq) del recubrimiento mediante el uso de la media de desviaciones de altitud tomadas del plano medio de datos de imagen, expresado como:
   
   Cuando Zi es el valor actual Z, y N es el número de puntos dentro del área determinada.
5. 7.5 Se calcula la desviación o la media de rugosidad superficial (Ra) de la imagen utilizando,
   
   Cuando Z (x) es la función que describe tque la superficie del perfil se analiza en términos de altura (Z) y la posición (x) de la muestra sobre la longitud de evaluación "L". Ra representa el valor medio de la superficie con respecto al plano central.

8. Cultivo Celular y Diferenciación

1. Cultura y diferenciar lo humano línea de células madre embrionarias (células madre) H9 como se describe en Hay ^17.
2. Separar las células usando un reactivo de disociación y replate ellos en PU134 portaobjetos recubiertos en el Día 9 del proceso de diferenciación, en presencia de un medio libre de suero como se describe en Szkolnicka ^18,19.
   Nota: Se prefiere el uso de una disociación celular enzimática para el desprendimiento de células físico.

9. citocromo P450 ensayo funcional

1. Medir la actividad de CYP3A, siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Incubar hepatocitos derivados de células madre en el Día 13 o día 19, y medios sin células - como control negativo, con el substr apropiadacomió durante 5 horas a 37 ° C.
3. Recoger los sobrenadantes de las células y los medios de comunicación, llevar a cabo el ensayo según las instrucciones del fabricante.
4. Medir el nivel de actividad de CYP y relativa normalizada para el área de superficie (cm ^2).

10. Inmunoticción

1. Lave hESC deriva hepatocitos con PBS, durante 1 min, repita dos veces.
2. Añadir hielo frío metanol al 100% para fijar las células, en lugar de -20 ° C durante 10 min.
3. Lavar las células con PBS durante 5 min y repetir dos veces.
4. Se incuban las células con PBS / T (0,1% de Tween) / 10% de BSA durante 1 hora a RT.
5. Aspirar la solución PBST y añadir el anticuerpo primario apropiado diluido en PBS / T (0,1% de Tween) / 1% de BSA, se incuba a 4 ° C con suave agitación O / N.
6. Lavar las células con PBS / T (0,1% de Tween) / BSA al 1% durante 5 min y repetir tres veces.
7. Diluir el anticuerpo apropiado en PBS / T (0,1% de Tween) / 1% de BSA, añadir a las células y se incuba en la oscuridad a RT durante 1 h con agitación suave.
8. Lavar las células con PBS durante 5 min y repetir tres veces.
9. Añadir MOWIOL 488 (que contiene DAPI 1: 1.000) a cada pocillo, añadir un cubreobjetos con cuidado para reducir el número de burbujas de aire. Tienda células fija a 4 ° C en la oscuridad. Observe tinción utilizando un microscopio con un filtro adecuado y la lámpara fluorescente. Los anticuerpos primarios y secundarios optimizados se enumeran en la Tabla 1.

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Resultados

Disolvente de polímero influye en la topografía de la superficie del polímero recubierto

Poliuretano 134 se solubilizó en cloroformo, ya sea solo o en combinación con tolueno o tetrahidrofurano o diclorometano y los portaobjetos de vidrio mediante revestimiento por centrifugación con las diferentes formulaciones. Microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía de fuerza atómica (AFM) se utilizaron para caracterizar las propiedades físicas de los revestimien...

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Discusión

Muchos de los métodos actuales utilizados para generar hepatocitos a partir de células madre se basan en matrices indefinidos de origen animal. Estos sustratos pueden ser costosos y altamente variable, que afecta a la función celular y la estabilidad, lo que representa una barrera significativa a la aplicación. Por lo tanto, se realizó una pantalla para materiales sintéticos que apoyan la cultura de células madre de hepatocitos derivados. Hemos identificado, un poliuretano sencilla (PU134), formado por la polimer...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker	Edmun Bühler	KS-15
Irradiator	CIS Biointernational	IBL 637
Spin coater	Specialty Coating System	P-6708
Scanning Electron Microscope	Philips	XL30CPSEM
Atomic Force Microscope	DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4	Promega	V8902
UV bulb	ESCO
NanoScope analysis software	VEECO		version 1.20
Fluorescence microscope	Olympus	TH45200	Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates	Corning, UK	3527
glass slides	Scientific Laboratory Supplies	MIC3308
Diethylene glycol	Sigma–Aldrich	93171
1,6-hexanediol	Sigma–Aldrich	240117
Neopentyl glycol	Sigma–Aldrich	408255
Adipic acid	Sigma–Aldrich	9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide	Sigma–Aldrich	227056
Diethyl ether	Sigma–Aldrich	676845
titanium (IV) butoxide	Sigma–Aldrich	244112
1,4-butanediol	Sigma–Aldrich	493732
Vacuum oven	Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate)	Sigma–Aldrich	101688
Tetrahydrofurane	Sigma–Aldrich	401757
Sputter coater	Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)	Gibco	10010031	Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20	Scientific Laboratory Supplies Ltd	EC607
Methanol	Scientific Laboratory Supplies Ltd	CHE5010
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich, UK	A7906
MOWIOL 488 DAPI	Calbiochem	475904	Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit	Promega	V8902
Hepatozyme	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013