JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта статья будет сосредоточена на разработке полимерных покрытием поверхностей для долгосрочного, стабильного культура стволовых клеток получены человеческие гепатоциты.

Аннотация

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.

Введение

Биологические материалы широко используются в поддержании и дифференциации плюрипотентных стволовых клеток 1. В то время как позволяет, эти биологические субстраты часто содержат множество неопределенных компонентов. Матригель является широко используемым субстратом для культуры и дифференциации стволовых клеток. К сожалению, его переменный состав влияет функцию клеток и фенотип. Хотя разнообразие альтернативных, более определенные биологические матриц были использованы 2-7, их животного происхождения или плохой масштабируемости делает их непригодными кандидатов для промышленного производства. Поэтому идентификация синтетические альтернативы, с определенным составом и надежной работы, являются ключевыми целями в исследовании стволовых клеток.

В попытке преодолеть ограничения неопределенных культивирования клеток субстратов, междисциплинарное сотрудничество между химией и биологией определили синтетические материалы со способностью поддерживать фенотип клеток. SynthEtic субстраты являются масштабируемыми, экономически эффективным, и могут быть изготовлены в сложных 3D структур, имитируя в естественных условиях окружающей среды. Благодаря этим свойствам синтетические субстраты были широко используются для поддержки и привод дифференцировку многих типах клеток 8-10.

Расширенный и высокой пропускной анализы способствовали оперативно провести проверку синтетических материалов, из крупных библиотек, и доставлены новые материалы с гибкими свойствами с широкого применения в биомедицинских исследованиях и разработках 11-13. Используя высокую пропускную способность, полимерной технологии скрининга микро-массив, мы быстро определили простой полиуретан (PU134), подходит для поддержания человека стволовых клеток, полученных гепатоцитов. Этот полимер был найден, чтобы быть выше на животных, полученных подложек в отношении дифференцировки гепатоцитов и функции 14-16. Мы впоследствии оптимизировать процесс при нанесении покрытий, топографии и стерилизации для доступа эффектына полимерной производительности в стабилизации функцию гепатоцитов и продолжительность жизни. Это имеет важные последствия в отношении понимания основ гепатоцитов биологии для основе моделирования клеток и регенеративной медицины приложений.

Технология здесь описано представляет собой пример того, как поверхность из синтетического полимера могут быть оптимизированы, чтобы сохранить фенотип клеток. Мы считаем, что сочетание этой технологии с протоколом дифференцировки бесплатно гепатоцитов эффективность сыворотки имеет потенциал, чтобы обеспечить масштабируемое производство гепатоцитов для использования в моделировании в пробирке и регенеративной медицины.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Синтез PHNGAD (поли [1,6-hexanodiol / неопентил гликоль / ди (этиленгликоль)--alt адипиновой кислоты] диол)

figure-protocol-142

Схема 1: Синтез PHNAGD Схематическое представление синтеза PHNAGD.. PHNAGD готовили по реакции 1,6-Hexanodiol, диэтиленгликоль, neoppentyl гликоля и адипиновой кислоты. PHNAGD, поли [1,6-hexanodiol / неопентил гликоль / ди (этиленгликоль)--alt адипиновой кислоты] диол.

  1. Применение термической обработки для мономеров 1,6-гександиол, ди (этиленгликоль) и неопентилгликоля при 40 ° С в течение 48 ч в вакуумной печи, чтобы удалить остатки воды. Разрешить к холоду до комнатной температуры под вакуумом.
  2. Добавить 22 ммоль каждого мономера и адипиновой кислоты (55 ммоль) в два-горлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой бар и соединен с ловушкой Дина-Старка.
  3. Поместите весь узел в вакууме и осторожно нагреть GLAssware при 40 ° С в течение 6 часов, с тем чтобы избежать поглощения влаги во время добавления химических в колбу.
  4. Добавить с помощью шприца, по капле, 0,0055 моль катализатора титана (IV) бутоксиду.
  5. Реакционную смесь перемешивают при 180 ° С, под атмосфере N2 в течение 24 ч, и собирают остаточной воды в ловушке Дина-Старка. Дать продукту остыть до комнатной температуры.

2 Синтез PU134

figure-protocol-1500

Схема 2: Синтез PU134 Схематическое представление синтеза полиуретана PU134 134 был подготовлен в результате реакции 1,0 экв о PHNGAD с 2,0 экв в 4,4'-метиленбис (фенилизоцианат), с последующим добавлением 1,0. экв из 1,4-бутандиол удлинителя цепи.

  1. Смешайте один эквивалент полиола PHNGAD (Mn ~ 1800 Да, 3,2 ммоль) с двумя эквивалентами 4«4-метилен (фенил изоцианат) (6,4 ммоль) в безводном N, N-диметилформамиде (12 мл).
  2. Реакционную смесь перемешивают при 70 ° С, под атмосфере N2.
  3. Добавить с помощью шприца по каплям титанового катализатора (IV) бутоксид (0,8% мас).
  4. После 1 часа, добавляют один эквивалент удлинитель цепи 1,4-бутандиол (3,2 ммоль). Увеличение температуры на 90 ° С и перемешивают в течение 24 ч под N 2 атмосфере.
  5. После реакции, собирают осаждением из полиуретана добавлением диэтилового эфира (гексан или воды также может быть использован) по каплям в реакционный раствор до тех пор, осаждение не происходит.
  6. Центрифуга решение в 5300 мкг в течение 5 мин.
  7. Декантировать супернатант и не высохнуть при 40 ° С в вакуумном сушильном шкафу до испарения растворителя.
    Примечание: Для того чтобы гарантировать, что конечный продукт реакции обладает правильные параметры в отношении к молекулярно-массовым распределением, функциональный ГроуPS полимера и температур плавления и стеклования, различные аналитические методы и методы могут быть использованы, например, гель-проникающей хроматографии или Fitr спектроскопии.

3 Получение PU134 Solutions

  1. Взвешивают 200 мг PU134 в стеклянный флакон.
  2. Развести PU134 до конечной концентрации 2% в ряде растворителей: хлороформ, комбинации хлороформа и толуола в соотношении 1: 1, тетрагидрофуран и комбинация тетрагидрофурана и дихлорметана в соотношении 1: 1.
    Примечание: Избрание правой растворителя варьируется в зависимости от полимера, чтобы использовать. Различные растворители обладают разные температуры кипения, что может повлиять на растворение полимера.
  3. Встряхнуть раствор энергично в течение 20 мин при комнатной температуре с использованием шейкера со скоростью 200 мот / мин, до тех пор пока раствор не станет однородным и не наблюдается осадок.

4 Покрытие стеклах с PU134

  1. Поставьте Rouй 15 мм 2 покровное на спин нанесения покрытий.
  2. Применение 50 мкл раствора PU134 друг с помощью пипетки. Регулировка громкости на PU134 решения соответственно для необходимого размера покровного сохраняя объем на поверхность соотношение пропорциональный.
  3. Спин каждый покровное на 7 сек при 23 х г.
  4. Воздух сухой покровное при комнатной температуре в течение по крайней мере 24 часов перед стерилизацией.

5 Облучение покровное

  1. Гамма-облучение покровное с покрытием полимера с применением дозы 10 Грейс с помощью лабораторной облучатель в течение 12 мин.
  2. УФ облучение с полимерным покрытием покровное использованием 30 Вт, УФ лампы в течение 16 минут с каждой стороны.
  3. Поместите полимерным покрытием покровное в подходящем планшет для тканевых культур в соответствии с размером слайдов.

6 сканирующей электронной микроскопии

  1. Золото слой полимера покровное путем напыления на 200 сек в атмосфере 5 х 10 -1 миллибар давления.
  2. Захват мкгraphs из полимерной покрытием покровное использованием сканирующего электронного микроскопа при ускоряющем напряжении 20 кВ в режиме вторичной электронной визуализации.

7. атомно-силовой микроскопии Наблюдения

  1. Сканирование площадью 20 х 20 мкм от поверхности полимера.
  2. Настройте скорость сканирования от 1,32 Гц до 1,60 Гц.
  3. Настройте разрешение 512 х 512 пикселей в отсканированном регионе.
  4. Рассчитать среднеквадратичное (RMS или Rq) покрытия с использованием средних отклонениях по высоте, взятых из средней плоскости данных изображения, выражена следующим образом:
    figure-protocol-5796
    Где Zi является текущее значение Z, и N является число точек в пределах данной области.
  5. 7.5 Рассчитайте отклонение или среднее шероховатость поверхности (Ra) изображения с использованием,
    figure-protocol-6092
    Где Z (х) является функцией, которая описывает тон поверхности профиля проанализированы с точки зрения высоты (Z) и в положении (х) образца по длине оценки "L". Ra представляет собой среднее значение поверхности по отношению к центральной плоскости.

8 Культура клеток и дифференцировки

  1. Культура и дифференцировать человеческие эмбриональные линии стволовых клеток (чЭСК) H9, как описано в Hay 17.
  2. Отделить клеток с использованием диссоциации реагента и replate их на предметные стекла, покрытые PU134 на 9 день процесса дифференцировки, в присутствии бессывороточной среде, как описано в Szkolnicka 18,19.
    Примечание: Использование ферментативной диссоциации клеток предпочтительно физической отряда клеток.

9. цитохрома Р450 функциональный анализ

  1. Измерьте CYP3A деятельность в соответствии с инструкциями изготовителя.
  2. Выдержите чЭСК полученных гепатоциты на 13-й день или День 19, и средства массовой информации без клеток - в качестве отрицательного контроля, с соответствующим подстрокаели в течение 5 ч при 37 ° С.
  3. Соберите супернатанатах клеток и СМИ, проводить анализ в соответствии с инструкциями изготовителя.
  4. Измерьте уровень CYP деятельности и нормализованного по отношению к площади поверхности (см 2).

10. Иммуноокрашивание

  1. Промыть чЭСК полученных гепатоциты с PBS, в течение 1 мин, повторить два раза.
  2. Добавить ледяным 100% метанола, чтобы исправить клетки, место в -20 ° С в течение 10 мин.
  3. Промыть клеток с PBS в течение 5 мин и повторяют дважды.
  4. Инкубируйте клетки с PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Аспирируйте PBST раствор и добавить соответствующее первичного антитела, разбавленного в PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, инкубируют при 4 ° С и при мягком помешивании O / N.
  6. Промыть клетки с PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA в течение 5 мин и повторяют три раза.
  7. Развести соответствующего антитела в PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, добавить к клеткам и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч при осторожном перемешивании.
  8. Промыть клеток с PBS в течение 5 мин и повторяют три раза.
  9. Добавить Mowiol 488 (DAPI, содержащий 1: 1000) в каждую лунку, добавить покровное осторожно, чтобы уменьшить количество пузырьков воздуха. Магазин фиксированной клеток при 4 ° С в темноте. Соблюдайте окрашивания с помощью микроскопа с соответствующим фильтром и люминесцентных ламп. Оптимизированные первичные и вторичные антитела, перечислены в таблице 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Растворителя полимера влияет на топографию поверхности с полимерным покрытием

Полиуретан 134 солюбилизировали в хлороформе, либо по отдельности, либо в сочетании с толуол или тетрагидрофуран или дихлорметан, и предметные стекла с покрытием по спину с различны?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Многие из существующих методов, используемых для генерации гепатоциты из стволовых клеток зависят от неопределенных матриц животного происхождения. Эти субстраты могут быть дорогостоящими и весьма неоднородно, затрагивая функции клеток и стабильности, что представляет собой значит...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

DCH является CSO, директор, основатель и акционер в FibromEd продукции ООО МБ и JPI являются учредителями в FibromEd Продукты Лтд

Благодарности

DCH, MB и FK при поддержке одного EPSRC следовать по фонда. BL-V и DS друг были поддержаны MRC PhD studentships. KC поддержали финансирование из Великобритании регенеративной медицины платформы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
ShakerEdmun BühlerKS-15
IrradiatorCIS BiointernationalIBL 637 
Spin coaterSpecialty Coating SystemP-6708
Scanning Electron Microscope PhilipsXL30CPSEM
Atomic Force MicroscopeDimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4PromegaV8902
UV bulbESCO
NanoScope analysis softwareVEECOversion 1.20
Fluorescence microscopeOlympusTH45200Use Volocity 4 Software
Tissue culture platesCorning, UK 3527
glass slidesScientific Laboratory SuppliesMIC3308
Diethylene glycolSigma–Aldrich93171
1,6-hexanediolSigma–Aldrich240117
Neopentyl glycolSigma–Aldrich408255
Adipic acidSigma–Aldrich9582
anhydrous N,N-DimethylformamideSigma–Aldrich227056
Diethyl etherSigma–Aldrich676845
titanium (IV) butoxide Sigma–Aldrich244112
1,4-butanediol Sigma–Aldrich493732
Vacuum ovenThermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate)Sigma–Aldrich101688
TetrahydrofuraneSigma–Aldrich401757
Sputter coaterBal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)Gibco10010031Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20   Scientific Laboratory Supplies LtdEC607 
Methanol  Scientific Laboratory Supplies LtdCHE5010
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich, UKA7906
MOWIOL 488 DAPICalbiochem475904Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kitPromegaV8902
HepatozymeGibco17705021
TryLE expressLife Technologies12604013

Ссылки

  1. Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).
  2. Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
  3. Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).
  4. Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).
  5. Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).
  6. Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26 (19), 4171-4179 (2005).
  7. Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50 (7), 645-652 (2006).
  8. Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (1), 13-22 (2013).
  9. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3 (3), 034112(2008).
  10. Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32 (12), 3220-3232 (2011).
  11. Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30 (6), 1045-1055 (2009).
  12. Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31 (8), 2216-2228 (2010).
  13. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4 (1335), (2013).
  14. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).
  15. Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).
  16. Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1 (1), 50-53 (2012).
  17. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (34), 12301-12306 (2008).
  18. Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
  19. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).
  20. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  21. Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33 (1-2), 15-30 (1998).
  22. Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
  23. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5 (3195), (2014).
  24. Thaburet, J. -F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25 (1), 336-370 (2003).
  25. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  26. Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116 (10), 1881-1892 (2003).
  27. Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231 (1), 28-37 (2008).
  28. Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5 (4), 273-280 (2006).
  29. Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28 (1), 1806-1819 (2007).
  30. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  31. Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19 (19), 2775-2779 (2007).
  32. Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23 (3), 305-311 (2013).
  33. Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).
  34. Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

91P450

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены