Stabilisierung Leberzell Phänotyp mit optimierten Surfaces

Zusammenfassung

Dieser Artikel wird auf die Entwicklung von Polymer-beschichteten Oberflächen für die langfristige Ausrichtung, stabile Kultur der Stammzell abgeleitet humanen Hepatozyten.

Zusammenfassung

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.

Einleitung

Biologische Materialien sind weit verbreitet bei der Aufrechterhaltung und Differenzierung von pluripotenten Stammzellen ¹ verwendet. Und ermöglichen, enthalten diese biologischen Substraten oft eine Vielzahl von unbestimmten Komponenten. Matrigel ist eine häufig verwendete Substrat für die Stammzellkultur und Differenzierung. Leider beeinflusst die variable Zusammensetzung der Zellfunktion und Phänotyp. Obwohl eine Vielzahl von alternativen, definierten biologischen Matrices wurden verwendet, ^2-7, ihre tierischen Ursprungs oder schlechte Skalierbarkeit macht sie ungeeignete Kandidaten für die industrielle Fertigung. Daher ist die Identifizierung von synthetischen Alternativen, mit definierter Zusammensetzung und zuverlässige Leistung, sind wichtige Ziele in der Stammzellforschung.

In einem Versuch, die Grenzen der undefinierten Zellkultursubstraten zu überwinden, sind interdisziplinäre Kooperationen zwischen Chemie und Biologie synthetischen Materialien mit der Fähigkeit, Zell-Phänotyp unterstützt identifiziert. SynthWDV-Substrate sind skalierbar, kostengünstig und kann in komplexe 3D-Strukturen hergestellt werden, imitiert die in vivo-Umgebung. Aufgrund dieser Eigenschaften synthetischen Substraten sind weit verbreitet zu unterstützen und zu fahren Differenzierung vieler Zelltypen ^8-10.

Erweiterte und Hochdurchsatz-Assays haben die schnelle Screening von synthetischen Materialien erleichtert, von großen Bibliotheken, und lieferte neuartige Materialien mit flexiblen Eigenschaften mit breiten Anwendungen in der biomedizinischen Forschung und Entwicklung ^11-13. Verwendung von Hochdurchsatz-, Polymer-Mikroarray-Screening-Technologie, haben wir schnell eine einfache Polyurethan (PU134), geeignet für die Instandhaltung von menschlichen Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten identifiziert. Dieses Polymer wurde zu überlegen Tieren stamm Substrate hinsichtlich Hepatozyten-Differenzierung und-Funktion ^14-16 sein. Wir haben anschließend die Beschichtungsbedingungen, Topographie und Sterilisationsverfahren, Effekte zugreifen optimiertauf Polymer Leistung bei der Stabilisierung Hepatozyten Funktion und Lebensdauer. Dies hat erhebliche Auswirkungen in Bezug auf das Verständnis der Biologie Grundlagen der Hepatozyten für Zell-basierte Modellierung und Anwendungen der regenerativen Medizin.

Die hier beschriebene Technologie ist ein Beispiel, wie die Oberfläche eines synthetischen Polymers kann optimiert werden, um Zell-Phänotyp zu bewahren. Wir glauben, dass die Kombination dieser Technologie mit einer effizienten serumfreien Hepatozyten Differenzierungsprotokoll hat das Potenzial, eine skalierbare Herstellung von Hepatozyten zur Verwendung in in vitro-Modellierung und regenerative Medizin bereitzustellen.

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Protokoll

1. Synthese von PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / Neopentylglykol / Di (ethylenglykol)--alt Adipinsäure] diol)

Schema 1: Synthese von PHNAGD Schematische Darstellung der Synthese von PHNAGD.. PHNAGD wurde durch Umsetzung von 1,6-Hexanodiol, Diethylenglykol, neoppentyl Glykol und Adipinsäure hergestellt. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / Neopentylglykol / Di (ethylenglykol)--alt Adipinsäure] diol.

1. Anwenden der Wärmebehandlung auf die Monomeren, 1,6-Hexandiol, Di (ethylenglykol) und Neopentylglycol bei 40 ° C für 48 Stunden in einem Vakuumofen, um restliches Wasser zu entfernen. Lassen Sie die Kälte auf RT unter Vakuum.
2. Hinzufügen 22 mmol eines jeden Monomers und Adipinsäure (55 mMol) in einen Zweihalsrundkolben, der mit einem Rühren, ausgestattet und mit einer Dean-Stark-Apparatur angeschlossen.
3. Legen Sie die gesamte Baugruppe im Vakuum und sanft erhitzen glassware bei 40 ° C für 6 Stunden, um jegliche Feuchtigkeitsaufnahme während der Zugabe der Chemikalien in den Kolben zu verhindern.
4. Fügen über eine Spritze, Tropfen für Tropfen, 0,0055 mol des Katalysators Titan (IV) butylat.
5. Das Reaktionsgemisch wird bei 180 ° C unter einer N ₂ Atmosphäre für 24 Stunden, zu sammeln und das restliche Wasser in einer Dean-Stark-Falle. Lassen Sie das Produkt auf RT abkühlen.

2. Synthese von PU134

Schema 2: Synthese von PU134 Schematische Darstellung der Synthese von Polyurethan 134 PU134 wurde durch die Umsetzung von 1,0 Äquivalenten eines PHNGAD mit 2,0 Äquivalenten eines 4,4 '-Methylenbis (phenylisocyanat) hergestellt, gefolgt von der Zugabe von 1,0. equiv eines 1,4-Butandiol Kettenverlängerungs.

1. Mischen ein Äquivalent der Polyol PHNGAD (Mn ~ 1.800 Da, 3.2 mmol) mit zwei Äquivalenten 4"4-Methylenbis (phenylisocyanat) (6,4 mmol) in wasserfreiem N, N-Dimethylformamid (12 ml).
2. Rühre das Reaktionsgemisch bei 70 ° C unter einer N ₂ Atmosphäre.
3. Fügen über eine Spritze, Tropfen für Tropfen den Katalysator Titan (IV) butylat (0,8% wt).
4. Nach 1 Stunde, Hinzufügen eines Äquivalents des Kettenverlängerers 1,4-Butandiol (3,2 mmol). Erhöhung der Temperatur auf 90 ° C und rührt 24 h unter einer N ₂ Atmosphäre.
5. Nach der Reaktion sammeln das Polyurethan durch Ausfällung durch Zugabe von Diethylether (Hexan oder Wasser kann auch verwendet werden) tropfenweise zu der Reaktionslösung, bis der Niederschlag auftritt.
6. Zentrifugieren der Lösung bei 5.300 × g für 5 min.
7. Dekantiert und trocknet bei 40 ° C in einem Vakuumofen, bis das Lösungsmittel verdampft.
   Hinweis: Um sicherzustellen, daß das Endprodukt der Reaktion besitzt die richtigen Parameter für den Molekulargewichtsverteilung, die funktionelle groups des Polymers und der Schmelz und Glasübergangstemperaturen können verschiedene analytische Techniken und Verfahren verwendet werden, wie Gelpermeationschromatographie oder FITR Spektroskopie.

3. Vorbereitung der PU134 Lösungen

1. Wiegen 200 mg PU134 in eine Glasflasche.
2. Verdünnen PU134 bis zu einer Endkonzentration von 2% in einer Reihe von Lösemittel: Chloroform, eine Kombination von Chloroform und Toluol im Verhältnis 1: 1, Tetrahydrofuran und einer Kombination aus Tetrahydrofuran und Dichlormethan im Verhältnis 1: 1.
   Hinweis: Die Wahl der richtigen Lösungsmittel variiert in Abhängigkeit von dem Polymer zu verwenden. Unterschiedlichen Lösungsmitteln unterschiedliche Siedepunkte besitzen, die die Solubilisierung des Polymers beeinflussen kann.
3. Schütteln der Lösung kräftig für 20 min bei RT mit einer Schüttelmaschine bei einer Geschwindigkeit von 200 mot / min, bis die Lösung homogen wird und kein Niederschlag beobachtet.

4. Beschichtung von Glasobjektträger mit PU134

1. Legen Sie eine round 15 mm ² Deckglas auf dem Spin Coater.
2. Bewerben 50 ul der PU134-Lösung in jede mit einer Pipette. Stellen Sie die Lautstärke der PU134 Lösung entsprechend für die erforderliche Deck Größe halten die Volumen zu Oberfläche Verhältnis proportional.
3. Drehen Sie jedes Deckglas für 7 sec bei 23 x g.
4. Luft trocknen Deckglas bei RT für mindestens 24 Stunden vor der Sterilisation.

5. Die Bestrahlung von Coverslip

1. Gamma-Bestrahlung mit Polymer beschichteten Deckglas durch Anlegen einer Dosis von 10 Graustufen mit einer Labor-Strahler für 12 min.
2. UV-Bestrahlung mit Polymer beschichtete Deckglas mit einer 30 W, UV-Lampe für 16 min auf jeder Seite.
3. Platzieren des mit Polymer beschichteten Deckglas in einem geeigneten Gewebekulturplatte nach dem Foliengröße.

6. Rasterelektronenmikroskopie

1. Goldbeschichtungspolymer Deck durch Sputtern für 200 s in einer Atmosphäre von 5 x 10 ^-1 mbar Druck.
2. Capture the Mikrogrammraphs des mit Polymer beschichteten Deckglas mit einem Rasterelektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV in der Sekundärelektronenabbildungsmodus.

7. Atomic Force Microscopy Beobachtungen

1. Abtasten einer Fläche von 20 x 20 um für die Polymeroberfläche.
2. Eine Scan-Rate von 1,32 Hz bis 1,60 Hz.
3. Einrichtung einer Auflösung von 512 x 512 Pixel in der abgetasteten Bereich.
4. Berechnen Sie das quadratische Mittel (RMS oder RQ) der Beschichtung durch Verwendung der durchschnittlichen Höhe der Abweichungen vom Mittelwert Bilddaten Ebene genommen, ausgedrückt als:
   
   Wobei Zi die aktuelle Z-Wert ist, und N die Anzahl von Punkten innerhalb des bestimmten Gebiets.
5. 7.5 Berechnen Sie die Abweichung oder mittlere Oberflächenrauigkeit (Ra) des Bildes mit,
   
   Wobei Z (x) ist die Funktion, t beschreibter Oberflächenprofil in der Höhe (Z) und Position (x) der Probe über die Bewertungslänge "L" analysiert. Ra stellt den Mittelwert der Oberfläche relativ zu der Mittelebene.

8. Zellkultur und Differenzierung

1. Kultur und differenzieren die humane embryonale Stammzelllinie (hES) H9 als in Hay ¹⁷ beschrieben.
2. Lösen Zellen unter Verwendung eines Reagens Dissoziation und Ausstrich sie auf PU134 beschichtete Objektträger an Tag 9 des Differenzierungsprozesses, in Gegenwart von einem serumfreien Medium, wie in Szkolnicka ^18,19 beschreiben.
   Anmerkung: Die Verwendung eines enzymatischen Zell Dissoziation physikalischen Zellablösung bevorzugt.

9. Cytochrom-P450-Funktionstest

1. Messen CYP3A-Aktivität nach der Anleitung des Herstellers.
2. HESC abgeleitet Hepatozyten an Tag 13 oder Tag 19, und Medien inkubieren ohne Zellen - als Negativkontrolle, mit der entsprechenden substraß für 5 h bei 37 ° C aufweist.
3. Sammeln Ständen von Zellen und Medien, führen Sie den Test nach Anweisungen des Herstellers.
4. Messung der Höhe der CYP-Aktivität und normiert auf die Fläche (cm ^2).

10. Immunfärbung

1. Wasch hESC abgeleitet Hepatozyten mit PBS für 1 min, zwei Mal wiederholen.
2. Fügen eiskalten 100% Methanol, um Zellen zu fixieren, in -20 ° C für 10 min.
3. Waschen Sie die Zellen mit PBS für 5 min und zweimal wiederholen.
4. Inkubiere die Zellen mit PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA für 1 h bei RT.
5. Saugen Sie das PBST-Lösung und fügen Sie den entsprechenden primären Antikörpers in PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA verdünnt, Inkubation bei 4 ° C unter leichtem Schütteln O / N.
6. Waschen Sie die Zellen mit PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA für 5 min und dreimal wiederholen.
7. Verdünne die entsprechenden Antikörper in PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, in den Zellen und Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur 1 Stunde unter leichtem Schütteln.
8. Waschen Sie die Zellen mit PBS für 5 min und dreimal wiederholen.
9. Fügen MOWIOL 488 (mit DAPI 1: 1.000) in jede Vertiefung, fügen Sie ein Deckglas vorsichtig auf die Anzahl der Luftblasen zu reduzieren. Speicher fixierten Zellen bei 4 ° C im Dunkeln. Beachten Färbung unter Verwendung eines Mikroskops mit entsprechenden Filter und Leuchtstofflampen. Die optimierten primären und sekundären Antikörper sind in Tabelle 1 aufgelistet.

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Ergebnisse

Polymerlösungsmittel beeinflusst die Topographie des mit Polymer beschichteten Oberfläche

Polyurethan-134 wurde in Chloroform gelöst, entweder allein oder in Kombination mit Toluol oder Tetrahydrofuran oder Dichlormethan, und die Objektträger aus Glas mit den verschiedenen Formulierungen schleudert. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Rasterkraftmikroskopie (AFM) wurden zur Charakterisierung der physikalischen Eigenschaften der Polymerschichten (Abbildung 1).

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Diskussion

Viele der verwendeten Hepatozyten aus Stammzellen erzeugen aktuellen Methoden beruhen auf undefinierte Matrizen tierischen Ursprungs. Diese Substrate können kostspielig und sehr variabel sein und somit die Zellfunktion und der Stabilität, die ein großes Hindernis für Anwendung. Daher führten wir einen Bildschirm für synthetische Materialien, die die Kultur der Stammzell abgeleitet Hepatozyten zu unterstützen. Wir haben festgestellt, eine einfache Polyurethan (PU134) durch Polymerisation PHNGAD, MDI und ein Streck...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker	Edmun Bühler	KS-15
Irradiator	CIS Biointernational	IBL 637
Spin coater	Specialty Coating System	P-6708
Scanning Electron Microscope	Philips	XL30CPSEM
Atomic Force Microscope	DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4	Promega	V8902
UV bulb	ESCO
NanoScope analysis software	VEECO		version 1.20
Fluorescence microscope	Olympus	TH45200	Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates	Corning, UK	3527
glass slides	Scientific Laboratory Supplies	MIC3308
Diethylene glycol	Sigma–Aldrich	93171
1,6-hexanediol	Sigma–Aldrich	240117
Neopentyl glycol	Sigma–Aldrich	408255
Adipic acid	Sigma–Aldrich	9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide	Sigma–Aldrich	227056
Diethyl ether	Sigma–Aldrich	676845
titanium (IV) butoxide	Sigma–Aldrich	244112
1,4-butanediol	Sigma–Aldrich	493732
Vacuum oven	Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate)	Sigma–Aldrich	101688
Tetrahydrofurane	Sigma–Aldrich	401757
Sputter coater	Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)	Gibco	10010031	Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20	Scientific Laboratory Supplies Ltd	EC607
Methanol	Scientific Laboratory Supplies Ltd	CHE5010
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich, UK	A7906
MOWIOL 488 DAPI	Calbiochem	475904	Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit	Promega	V8902
Hepatozyme	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013