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요약

이 문서는 장기적 폴리머 코팅 된 표면을 개발에 초점을 맞출 것이다, 줄기 세포의 안정적인 문화는 인간의 간세포를 산출했다.

초록

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.

서문

생물학적 물질은 널리 능성 줄기 세포의 한 유지 및 분화에 사용되어왔다. 가능하지만, 이러한 생물학적 기질은 종종 정의되지 않은 구성 요소의 무수가 포함되어 있습니다. 마트 리겔은 줄기 세포 배양 및 분화를위한 일반적으로 사용되는 기판이다. 불행하게도, 그 변수 조성물은 세포 표현형 및 기능에 영향을 미친다. 대안 이상의 정의 된 생물학적 매트릭스들의 다양한 2-7을 사용되었지만, 그들의 동물성 또는 나쁨 확장 그들에게 산업 제조에 부적합한 후보를 만든다. 따라서, 줄기 세포 연구의 주요 목표는 정의 된 구성과 신뢰할 수있는 성능으로 합성 대안의 식별이다.

정의되지 않은 세포 배양 기판의 한계를 극복하기위한 시도에서, 화학, 생물학 학제 간의 협력은 세포 표현형을 지원하는 능력과 합성 물질을 확인했다. 신디etic 기판은, 비용 효율적인 확장 성, 그리고 생체 내 환경을 흉내 낸, 복잡한 3 차원 구조로 제조 될 수있다. 이러한 특성으로 인해, 합성 기판은 널리 다양한 유형의 세포의 분화 8-10을 지원하고 구동하기 위해 사용되어왔다.

고급 및 높은 처리량 분석 대형 도서관에서 합성 물질의 신속한 심사를 촉진하고, 생물 의학 연구 및 개발 11-13에서 다양한 응용 프로그램과의 유연한 특성을 가진 새로운 물질을 전달했다. 높은 처리량, 고분자 마이크로 어레이 검사 기술을 활용, 우리는 빠른 속도로 인간의 줄기 세포 유래 간세포의 유지 보수에 적합한 간단한 폴리 우레탄 (PU134)를 확인했다. 이 중합체는 간세포 분화와 기능 14-16와 관련하여 동물 유래의 기재에 우수한 것으로 밝혀졌다. 우리는 이후 효과를 액세스하는 도포 조건, 지형 및 살균 처리를 최적화 한간세포 기능 및 수명을 안정화 중합체 성능. 이 세포 기반의 모델링 및 재생 의학 응용 프로그램에 대한 간세포 생물학의 기초를 이해 관련하여 중요한 의미를 갖는다.

여기에 설명 된 기술은 합성 중합체의 표면이 세포 표현형을 유지하도록 최적화 될 수있는 방법의 예를 나타낸다. 우리는 효율적인 무 혈청 간세포 분화 프로토콜이 기술의 조합이 체외 모델링 및 재생 의료에 사용하기위한 간세포의 생산 확장을 제공하는 잠재력을 가지고 있다고 믿는다.

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프로토콜

PHNGAD (폴리 [1,6-hexanodiol / 네오 펜틸 글리콜 / 디 (에틸렌 글리콜) -alt - 아 디프 산] 디올)의 1 합성

figure-protocol-109

반응식 1 : PHNAGD의 합성 PHNAGD의 합성의 도식 표현.. PHNAGD는 1,6-Hexanodiol의 반응, 디 에틸렌 글리콜, n​​eoppentyl 글리콜 및 아 디프 산을 제조 하였다. PHNAGD, 폴리 [1,6-hexanodiol / 네오 펜틸 글리콜 / 디 (에틸렌 글리콜) -alt - 아 디프 산] 디올.

  1. 잔류 물을 제거하기 위해 진공 오븐에서 48 시간 동안 40 ° C에서 단량체 1,6 - 헥산 디올, 디 (에틸렌 글리콜) 및 네오 펜틸 글리콜로 열처리를 적용. 진공 상태에서 RT까지 차가운 할 수 있습니다.
  2. 딘 - 스탁 장치에 교반 막대가 장착되고 연결의 2 구 둥근 바닥 플라스크에 각각의 단량체 및 아 디프 산 (55 밀리몰)의 22 밀리몰 추가.
  3. 진공 상태에서 전체 어셈블리를 놓고 부드럽게 GLA를 가열플라스크에 화학 물질의 첨가 중에 흡습을 방지하기 위해 6 시간 동안 40 ° C의,시 ssware.
  4. 드롭에 의해 촉매 티타늄 (IV) 부톡 사이드 0.0055 몰을 드롭 주사기를 통해 추가합니다.
  5. 24 시간 동안 N 2 분위기에서 180 ° C에서 반응 혼합물을 교반하고, 딘 - 스타크 트랩에서 잔류 물을 수집한다. 제품이 RT로 냉각시킵니다.

PU134의 2 합성

figure-protocol-986

반응식 2 : PU134의 합성 PU134가 4,4 메틸렌 비스 (페닐 이소시아네이트) 2.0 당량과 PHNGAD 1.0 당량의 반응에 의해 제조 된 폴리 우레탄 (134)의 합성 도식 표현, 1.0을 첨가 하였다. 1,4 - 부탄디올 사슬 연장 제의 당량.

  1. (4) 2 당량과 폴리올 PHNGAD 1 당량 (Mn이 1,800 ~ DA, 3.2 밀리몰)을 혼합무수 N에서 '4 메틸렌 비스 (페닐 이소시아네이트) (6.4 밀리몰), N 디메틸 포름 아미드 (12 mL)을 첨가 하였다.
  2. N 2 분위기 하에서 70 ° C에서 반응 혼합물을 저어.
  3. , 주사기를 통해 추가 촉매 티타늄 드롭 들러 (IV) 부톡 사이드 (0.8 중량 %).
  4. 1 시간 후, 사슬 연장 1,4 - 부탄디올 (3.2 밀리몰)의 1 당량을 추가한다. 90 ° C의 온도를 높이고 N 2 분위기 하에서 24 시간 동안 교반한다.
  5. 반응에 이어, 침전이 일어날 때까지 반응 용액에 적가 하였다 (도 사용될 수 헥산 또는 물), 디 에틸 에테르를 첨가하여 침전에 의해 폴리 우레탄을 모은다.
  6. 5 분 동안 5,300 XG에 용액을 원심 분리기.
  7. 뜨는을 가만히 따르다 용매가 증발 할 때까지 진공 오븐에서 40 ° C에서 떨어져 건조.
    주 : 위해 반응의 최종 생성물은 분자량 분포에 관한 정확한 파라미터를 갖고 있는지 확인하기 위해, 기능적 GROU중합체 및 융점 및 유리 전이 온도의 PS는 다양한 분석 기술 및 방법은, 겔 투과 크로마토 그래피 또는 피트 르 분광법으로 사용될 수있다.

PU134 솔루션의 3 준비

  1. 유리 병에 PU134의 200 mg의 무게를 측정한다.
  2. 클로로포름, 1 클로로포름과 톨루엔의 조합 : 용매의 수가 2 %의 최종 농도로 희석 한 PU134 비율, 테트라 히드로 푸란과 조합 한 테트라 히드로 푸란과의 dicloromethane : 1 비율.
    참고 : 오른쪽 용매의 선거 사용할 수있는 폴리머에 따라 달라집니다. 다른 용매는 중합체의 용해에 영향을 미칠 수있는 다른 비등점을 갖는다.
  3. 용액을 균질하게하고 침전물이 관찰되지 않을 때까지, 200 MOT / 분의 속도로 진탕을 사용하여 RT에서 20 분 동안 격렬히 흔들어 용액.

PU134 유리 슬라이드의 4 코팅

  1. 알자 배치스핀 코터에 ND 15mm이 커버 슬립.
  2. 피펫을 사용하여 각 PU134 용액 50 μl를 적용합니다. 비율에 비례하는 양 표면을 유지해야 커버 슬립 크기에 따라 PU134 용액의 양을 조정한다.
  3. 23의 X g에서 7 초 동안 각 coverslip에 스핀.
  4. 멸균하기 전에 최소 24 시간 동안 실온에서 공기 건조 커버 슬립.

커버 슬립의 5 조사

  1. 12 분 동안 실험실 조사 장치를 사용하여 회색의 열 용량을 적용하여 중합체 코팅 된 커버 슬립을 감마 - 조사한다.
  2. 16 분 각 팀의 30 W, UV 전구를 사용하여 폴리머 코팅 된 커버 슬립을 조사 자외선.
  3. 슬라이드 크기에 따라 적합한 조직 배양 접시에 고분자 코팅 된 커버 슬립을 놓습니다.

6 주사 전자 현미경

  1. 압력이 5 × 10-1 밀리바의 분위기에서 200 초간 스퍼터링에 의해 금 코트 폴리머 커버 슬립.
  2. microg 캡처이차 전자 촬상 모드에서의 20 kV의 가속 전압에서 주 사형 전자 현미경을 사용하여 코팅 된 커버 슬립의 중합체 raphs.

7 원자 힘 현미경 관찰

  1. 중합체 표면의 20 × 20 ​​μm 인 영역을 스캔.
  2. 1.32 Hz에서에서 1.60 Hz로 스캔 속도를 설정합니다.
  3. 스캔 한 지역에서 512 X 512 픽셀의 해상도를 설정합니다.
  4. 루트 평균 화상 데이터 플레인에서 찍은 높이 편차의 평균을 이용하여 코팅의 제곱 (RMS 또는 자승)를 계산 의미로 표현 :
    figure-protocol-3425
    여기서 닫아 현재 Z 값이며, N은 주어진 지역 내 점의 수이다.
  5. 이용한 화상의 7.5 편차를 계산하거나, 표면 평균 거칠기 (라)
    figure-protocol-3607
    어디 Z (X)는 t을 설명하는 기능입니다그 높이 (Z) 및 평가 길이 "L"을 통해 샘플의 위치 (X)의 관점에서 분석 프로파일 표면. RA가 중심면에 대하여 표면의 평균 값을 나타낸다.

8 세포 배양 및 분화

  1. 농경 건초 및 17에 기재된 바와 같이 인간 배아 줄기 세포주 (hESC의) H9 차별화.
  2. 해리 시약을 이용하여 세포를 분리하고 (18,19)에 대해 설명 Szkolnicka으로 무 혈청 배지의 존재하에 분화 과정의 일 9시 PU134 코팅 슬라이드 위에 그들을 replate.
    주 : 효소 적 세포 해리의 사용은 물리적 셀 박리하는 것이 바람직하다.

9 사이토 크롬 P450 기능 분석

  1. 제조업체의 지침에 따라 CYP3A 활동을 측정한다.
  2. 세포없이 hESC의 파생 일 13 일 19에서 간세포, 미디어를 품어 - 음성 대조군으로, 적절한 SUBSTR로37 ° C에서 5 시간 동안 먹었다.
  3. , 셀 및 미디어에서 상층 액을 수집 제조업체의 지침에 따라 분석을 수행한다.
  4. 표면적 (cm 2) ~ CYP 활성 및 정규화의 상대적인 수준을 측정한다.

(10) 면역 염색

  1. 워시 hESC의 1 분 동안 PBS로 간세포를 유도, 두 번 반복합니다.
  2. 10 분 동안 -20 ° C에 차가운 얼음 백퍼센트 세포를 해결하기 위해 메탄올, 장소를 추가합니다.
  3. 5 분 동안 PBS로 세포를 씻으 두 번 반복합니다.
  4. PBS / T (0.1 % 트윈) RT에서 1 시간 / 10 % BSA와 함께 세포를 배양한다.
  5. PBST 솔루션을 기음과 PBS / T (0.1 % 트윈) / 1 % BSA에 희석 적절한 일차 항체를 추가, 부드러운 교반 O / N로 4 ° C에서 배양한다.
  6. 5 분 동안 PBS / T (0.1 % 트윈) / 1 % BSA와 세포를 세척하고 세 번 반복합니다.
  7. , PBS / T (0.1 % 트윈) / 1 % BSA에 적합한 항체를 희석하여 세포에 추가하고 교반과 함께 1 시간 동안 RT에서 어두운 곳에서 배양.
  8. 5 분 동안 PBS로 세포를 세척하고 세 번 반복합니다.
  9. 각 웰에 기포의 수를 줄이기 위해 부드럽게 커버 슬립을 추가 (1000 DAPI 일을 포함) MOWIOL 488를 추가합니다. 스토어는 어둠 속에서 4 ° C에서 세포를 고정. 적절한 필터 및 형광 램프 현미경을 사용하여 염색 관찰한다. 최적화 된 일차 및 이차 항체는 표 1에 나열되어 있습니다.

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결과

고분자 용매 중합체 코팅 표면의 지형에 영향

폴리 우레탄 (134)은 단독으로 또는 톨루엔 또는 테트라 하이드로 퓨란 또는 디클로로 메탄과 유리 슬라이드가 다양한 제형으로 스핀 코팅과 조합하여, 클로로포름에 용해시켰다. 주사 전자 현미경 (SEM) 및 원자력 현미경 (AFM)을 (도 1) 중합체 코팅의 물리적 성질을 특성화하기 위해 사용되었다. 톨루엔, 클...

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토론

줄기 세포로부터 간세포를 생성하는 데 사용되는 현재의 방법의 대부분은 동물 유래의 미정 행렬에 의존한다. 이러한 기판은 어플리케이션에 상당한 장벽을 나타내는 세포의 기능과 안정성에 영향을 미치는, 비싸고 매우 가변적 일 수있다. 따라서, 우리는 줄기 세포 유래 간세포의 문화를 지원하는 합성 물질에 대한 화면을 수행 하였다. 우리가 식별 한 견고한 간세포 분화 방식과 조합 PHNGAD, MDI ...

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공개

DCH는 CSO, FibromEd 제품 유한 회사의 이사, 설립자 FibromEd 제품 유한 회사 MB와 JPI의 주주 아르 설립자 주주입니다

감사의 말

DCH, MB와 FK는 기금에 EPSRC 사후에 의해 지원되었다. BL-V와 DS는 각 MRC의 박사 studentships에 의해 지원되었다. KC는 영국 재생 의학 플랫폼에서 자금에 의해 지원되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
ShakerEdmun BühlerKS-15
IrradiatorCIS BiointernationalIBL 637 
Spin coaterSpecialty Coating SystemP-6708
Scanning Electron Microscope PhilipsXL30CPSEM
Atomic Force MicroscopeDimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4PromegaV8902
UV bulbESCO
NanoScope analysis softwareVEECOversion 1.20
Fluorescence microscopeOlympusTH45200Use Volocity 4 Software
Tissue culture platesCorning, UK 3527
glass slidesScientific Laboratory SuppliesMIC3308
Diethylene glycolSigma–Aldrich93171
1,6-hexanediolSigma–Aldrich240117
Neopentyl glycolSigma–Aldrich408255
Adipic acidSigma–Aldrich9582
anhydrous N,N-DimethylformamideSigma–Aldrich227056
Diethyl etherSigma–Aldrich676845
titanium (IV) butoxide Sigma–Aldrich244112
1,4-butanediol Sigma–Aldrich493732
Vacuum ovenThermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate)Sigma–Aldrich101688
TetrahydrofuraneSigma–Aldrich401757
Sputter coaterBal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)Gibco10010031Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20   Scientific Laboratory Supplies LtdEC607 
Methanol  Scientific Laboratory Supplies LtdCHE5010
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich, UKA7906
MOWIOL 488 DAPICalbiochem475904Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kitPromegaV8902
HepatozymeGibco17705021
TryLE expressLife Technologies12604013

참고문헌

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