Estabilização hepatocelular Fenótipo Usando superfícies sintéticas otimizados

Resumo

Este artigo irá focar no desenvolvimento de superfícies de polímeros revestido de longo prazo, estável cultura de células-tronco derivadas de hepatócitos humanos.

Resumo

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.

Introdução

Os materiais biológicos têm sido amplamente utilizados para a manutenção e diferenciação de células estaminais pluripotentes ^1. Enquanto permitindo, estes substratos biológicos, muitas vezes contêm uma infinidade de componentes indefinidos. Matrigel é um substrato comumente usado para a cultura e diferenciação de células-tronco. Infelizmente, a sua composição variável influencia a função de células e fenótipo. Apesar de uma variedade de matrizes biológicas alternativas, mais definidos foram utilizados ^2-7, a sua origem animal ou pobre escalabilidade os torna candidatos inadequados para o fabrico industrial. Portanto, a identificação de alternativas sintéticas, com composição definida e desempenho de confiança, são objetivos-chave na investigação sobre células estaminais.

Numa tentativa de ultrapassar as limitações dos substratos de cultura celular indefinido, a colaboração entre interdisciplinar da química e da biologia identificaram materiais sintéticos com a capacidade para suportar o fenótipo da célula. Synthsubstratos etic são escaláveis, de baixo custo, e podem ser fabricados em estruturas 3D complexas, imitando o ambiente in vivo. Devido a estas propriedades de substratos sintéticos têm sido amplamente utilizados para suportar e conduzir a diferenciação de muitos tipos de células ^8-10.

Ensaios avançadas e de alto rendimento têm facilitado a rápida triagem de materiais sintéticos, a partir de grandes bibliotecas, e entregues novos materiais com propriedades flexíveis com larga aplicação em pesquisa e desenvolvimento ^11-13 biomédica. Utilizando alto rendimento, tecnologia de rastreio de polímero de micro-arranjo, que rapidamente identificado um poliuretano simples (PU134), adequado para a manutenção de células estaminais derivadas de hepatócitos humanos. Este polímero verificou-se ser superior a substratos derivados de animais no que diz respeito à função e diferenciação de hepatócitos ^14-16. Temos posteriormente otimizado o processo de condições de revestimento, topografia e esterilização para acessar efeitossobre o desempenho do polímero de estabilização da função de hepatócitos e tempo de vida. Isto tem implicações significativas no que diz respeito à compreensão de fundamentos da biologia dos hepatócitos para modelagem baseada em células e aplicações de medicina regenerativa.

A tecnologia aqui descrita representa um exemplo de como a superfície de um polímero sintético pode ser optimizado para preservar fenótipo celular. Acreditamos que a combinação desta tecnologia com um protocolo de diferenciação de hepatócitos sem soro eficiente tem o potencial de proporcionar uma produção escalável de hepatócitos para uso em modelagem in vitro e medicina regenerativa.

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Protocolo

1. Síntese de PHNGAD (Poli [1,6-hexanodiol / neopentilglicol / di (etileno-glicol) de ácido adípico--alt] diol)

Esquema 1: Síntese de PHNAGD Representação esquemática da síntese de PHNAGD.. PHNAGD foi preparado pela reacção de 1,6-Hexanodiol, dietilenoglicol, neoppentyl glicol e ácido adípico. PHNAGD, Poli [1,6-hexanodiol / neopentilglicol / di (etileno-glicol) de ácido adípico--alt] diol.

1. Aplicar um tratamento de calor para os monómeros de 1,6-hexanodiol, di (etileno-glicol) e neopentil glicol a 40 ° C durante 48 horas num forno de vácuo para remover qualquer água residual. Deixa-se a frio até a temperatura ambiente sob vácuo.
2. Adicionar 22 mmoles de cada monómero e ácido adípico (55 mmol) a um balão de fundo redondo de duas tubuladuras equipado com uma barra de agitação e ligado a um aparelho de Dean-Stark.
3. Coloque todo o conjunto sob vácuo e aquecer lentamente a ABLssware a 40 ° C durante 6 horas, a fim de evitar qualquer possibilidade de absorção de humidade, durante a adição do produto químico para o balão.
4. Adicionar através de uma seringa, gota a gota, 0,0055 mole do catalisador de titânio (IV), butóxido de potássio.
5. Agita-se a mistura de reacção a 180 ° C, sob uma atmosfera de N ₂ durante 24 h, e recolher a água residual na armadilha de Dean-Stark. Permitir que o produto a arrefecer até à temperatura ambiente.

2 Síntese de PU134

Esquema 2: Síntese de PU134 Representação esquemática da síntese de poliuretano PU134 134 foi preparado através da reacção de 1,0 equivalentes de um PHNGAD com 2,0 equiv de um 4,4 '-metilenobis (fenil-isocianato), seguido pela adição de 1,0. equiv de um extensor de cadeia de 1,4-butanodiol.

1. Misturar um equivalente do poliol PHNGAD (Mn ~ 1800 Da, 3,2 mmol) com dois equivalentes de 4'4-metilenobis (fenil isocianato) (6,4 mmol) em N, N-dimetilformamida (12 ml).
2. Agita-se a mistura de reacção a 70 ° C, sob uma atmosfera de N _2.
3. Adicionar através de uma seringa, gota a gota, o catalisador de titânio (IV), butóxido de potássio (0,8% em peso).
4. Após 1 hora, adicionar um equivalente do extensor de cadeia de 1,4-butanodiol (3,2 mmol). Aumentar a temperatura a 90 ° C e agita-se durante 24 horas sob uma atmosfera de N _2.
5. Após a reacção, recolher o poliuretano por precipitação por adição de éter dietílico (hexano ou água pode também ser usado), gota a gota para a solução reaccional até a precipitação ocorre.
6. Centrifuga-se a solução a 5300 xg durante 5 min.
7. Decantar o sobrenadante e secar a 40 ° C num forno de vácuo até que o solvente se evapora.
   Nota: A fim de garantir que o produto final da reacção possuem os parâmetros de correcção relativos à distribuição do peso molecular, o grou funcionalps do polímero, e as temperaturas de fusão e de transição vítrea, de várias técnicas e métodos de análise pode ser utilizado, tais como a cromatografia de permeação em gel ou espectrometria de FITR.

3 Preparação de Soluções PU134

1. Pesar 200 mg de PU134 em uma garrafa de vidro.
2. Diluir PU134 para uma concentração final de 2% de uma série de solventes: clorofórmio, uma combinação de clorofórmio e de tolueno na proporção 1: 1, tetra-hidrofurano, e uma combinação de tetra-hidrofurano e diclorometano na proporção 1: 1.
   Nota: A escolha do solvente direita varia dependendo do polímero a ser usado. Diferentes solventes possuem diferentes pontos de ebulição, que podem afectar a solubilização do polímero.
3. Agitar a suspensão vigorosamente durante 20 min à temperatura ambiente usando um agitador a uma velocidade de 200 mot / min, até a solução se tornar homogénea e é observado nenhum precipitado.

4 Revestimento de Vidro Slides com PU134

1. Coloque uma rouDN 15 mm ² lamela no aplicador de rotação.
2. Aplicar 50 ul da solução a cada PU134 usando uma pipeta. Ajustar o volume da solução em conformidade PU134 para o tamanho lamela necessário manter o volume à superfície relação proporcional.
3. Gire cada lamela de 7 seg a 23 x g.
4. Ar lamela seco à temperatura ambiente durante pelo menos 24 horas antes da esterilização.

5. Irradiação de Coverslip

1. Gamma-irradiar polímero lamela revestida através da aplicação de uma dose de 10 Grays utilizando um irradiador de laboratório durante 12 min.
2. UV irradiar polímero revestido lamela usando a 30 W, lâmpada UV por 16 min cada lado.
3. Coloque a lamela revestida com polímero em uma placa de cultura de tecido apropriado de acordo com o tamanho do diapositivo.

6. Microscopia Eletrônica de Varredura

1. Ouro revestimento por pulverização catódica lamela polímero para 200 segundos em uma atmosfera de 5 x 10 ^-1 milibares de pressão.
2. Capture a micrographs da lamela polímero revestido usando um microscópio eletrônico de varredura em uma tensão de aceleração de 20 kV em modo de imagem de elétrons secundários.

7. Observações Microscopia de Força Atômica

1. Digitalizar uma área de 20 x 20 um de a superfície do polímero.
2. Configurar uma taxa de varredura de 1,32 Hz a 1,60 Hz.
3. Configure uma resolução de 512 x 512 pixels na região digitalizada.
4. Calcular a raiz quadrada da média (RMS ou QR) do revestimento usando a média dos desvios de altura retirados do plano médio de dados de imagem, expressa como:
   
   Quando Zi é o valor actual Z, e N é o número de pontos dentro da área dada.
5. 7.5 Calcule o desvio ou média rugosidade da superfície (Ra) da imagem, usando,
   
   Quando Z (x) é a função que descreve tele superfície perfil analisados ​​em termos de altura (Z) e posições (x) da amostra ao longo do comprimento de avaliação de "L". Ra representa o valor médio da superfície em relação ao plano central.

8 Cultura e diferenciação celular

1. Cultura e diferenciar o humano linha de células-tronco embrionárias (hESC) H9, conforme descrito no Hay ^17.
2. Separar as células utilizando um reagente de dissociação e replate los para PU134 lâminas revestidas no Dia 9 do processo de diferenciação, na presença de um meio isento de soro como descrito no Szkolnicka ^18,19.
   Nota: O uso de uma célula de dissociação enzimática é preferido ao descolamento celular física.

9. citocromo P450 Ensaio Funcional

1. Medir a actividade do CYP3A seguindo as instruções do fabricante.
2. Incubar hESC hepatócitos derivados no dia 13 ou no dia 19, e meios de comunicação, sem células - como controle negativo, com o substr apropriadocomeu durante 5 horas a 37 ° C.
3. Colete sobrenadantes de células e meios de comunicação, realizar o ensaio de acordo com as instruções do fabricante.
4. Medir o nível de actividade de CYP e normalizada em relação à área de superfície ⁽² cm).

10. Imunocoloração

1. Lavar células estaminais embrionárias humanas hepatócitos derivados com PBS, durante 1 min, repetir duas vezes.
2. Adicionar gelo frio 100% de metanol para fixar as células, em lugar de -20 ° C durante 10 min.
3. Lavar as células com PBS durante 5 minutos e repetir duas vezes.
4. Incubar as células com PBS / T (0,1% de tween) / 10% de BSA durante 1 hora à temperatura ambiente.
5. Aspirar a solução de PBST e adicionar o anticorpo primário adequado diluídos em PBS / T (0,1% de tween) / BSA a 1%, incubar a 4 ° C com agitação suave S / N.
6. Lavar as células com PBS / T (0,1% de tween) / BSA a 1% durante 5 minutos e repetir três vezes.
7. Diluir o anticorpo apropriado em PBS / T (0,1% de tween) / BSA a 1%, adicionar às células e incuba-se no escuro à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação suave.
8. Lavar as células com PBS durante 5 minutos e repetir três vezes.
9. Adicionar MOWIOL 488 (contendo DAPI 1: 1000) a cada poço, adicione uma lamela suavemente para reduzir o número de bolhas de ar. Loja células fixas, a 4 ° C no escuro. Observe a coloração utilizando um microscópio com filtro apropriado e lâmpada fluorescente. Os anticorpos primários e secundários optimizados estão listadas na Tabela 1.

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Resultados

Solvente de polímero influencia a topografia da superfície de polímero revestido

Poliuretano 134 foi solubilizado em clorofórmio, quer isoladamente ou em combinação com tolueno ou tetra-hidrofurano ou diclorometano, e as lâminas de vidro de spin-revestidos com as diferentes formulações. A microscopia electrónica de varrimento (SEM) e de microscopia de força atómica (AFM), foram utilizados para caracterizar as propriedades físicas dos revestimentos de polímeros ...

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Discussão

Muitos dos actuais métodos utilizados para gerar células estaminais a partir de hepatócitos de confiar em matrizes indefinidas de origem animal. Estes substratos podem ser caros e altamente variável, afetando a função celular e estabilidade, o que representa uma barreira significativa à aplicação. Por isso, foi realizada uma triagem dos materiais sintéticos que apoiam a cultura de células-tronco derivadas de hepatócitos. Foram identificadas, um poliuretano simples (PU134), formada por polimerização de PHNG...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips
Shaker	Edmun Bühler	KS-15
Irradiator	CIS Biointernational	IBL 637
Spin coater	Specialty Coating System	P-6708
Scanning Electron Microscope	Philips	XL30CPSEM
Atomic Force Microscope	DimensionV Nanoscope, VEECO
p4-GLO CYP3A4	Promega	V8902
UV bulb	ESCO
NanoScope analysis software	VEECO		version 1.20
Fluorescence microscope	Olympus	TH45200	Use Volocity 4 Software
Tissue culture plates	Corning, UK	3527
glass slides	Scientific Laboratory Supplies	MIC3308
Diethylene glycol	Sigma–Aldrich	93171
1,6-hexanediol	Sigma–Aldrich	240117
Neopentyl glycol	Sigma–Aldrich	408255
Adipic acid	Sigma–Aldrich	9582
anhydrous N,N-Dimethylformamide	Sigma–Aldrich	227056
Diethyl ether	Sigma–Aldrich	676845
titanium (IV) butoxide	Sigma–Aldrich	244112
1,4-butanediol	Sigma–Aldrich	493732
Vacuum oven	Thermoscientific
4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate)	Sigma–Aldrich	101688
Tetrahydrofurane	Sigma–Aldrich	401757
Sputter coater	Bal-Tec SCD 050
Inmunostaining
Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2)	Gibco	10010031	Store at room temperature
PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20	Scientific Laboratory Supplies Ltd	EC607
Methanol	Scientific Laboratory Supplies Ltd	CHE5010
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich, UK	A7906
MOWIOL 488 DAPI	Calbiochem	475904	Made up in Tris HCl and glycerol as per manufacturers instructions
Cell culture and Functional assay
CYP3A activity pGLO kit	Promega	V8902
Hepatozyme	Gibco	17705021
TryLE express	Life Technologies	12604013