Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

Resumen

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Resumen

Con el ritmo de los avances científicos en rápida aceleración, se necesitan nuevos métodos de la neurociencia experimental para manipular rápida y fácilmente la expresión génica en el cerebro del ratón. Aquí se describe una técnica introducida por primera Passini y Wolfe para la entrega intracraneal directa de transgenes codificada por el virus en el cerebro del ratón neonatal. En su forma más básica, el procedimiento sólo requiere un cubo de hielo y una jeringa de microlitro. Sin embargo, el protocolo también se puede adaptar para su uso con los marcos estereotáxica para mejorar la consistencia de investigadores nuevos en la técnica. El método se basa en la capacidad del virus adeno-asociado (AAV) para moverse libremente de los ventrículos cerebrales en el parénquima cerebral, mientras que el revestimiento ependimario es todavía inmaduros durante las primeras 12-24 horas después del nacimiento. La inyección intraventricular de AAV en esta edad los resultados en la transducción generalizada de neuronas en todo el cerebro. Expresión comienza pocos días después de la inyección y persiste durante la lifetime del animal. Título viral se puede ajustar para controlar la densidad de las neuronas transducidas, mientras que la co-expresión de una proteína fluorescente proporciona una etiqueta vital de las células transducidas. Con la creciente disponibilidad de las instalaciones del núcleo viral para proporcionar reactivos tanto off-the-shelf, pre-envasados ​​y preparación personalizada viral, este enfoque ofrece un método oportuno para la manipulación de la expresión génica en el cerebro del ratón que es rápido, fácil y mucho menos costoso que la ingeniería de línea germinal tradicional.

Introducción

Los métodos tradicionales para la modificación de la expresión de genes neuronales requieren tiempo y es costoso manipulaciones de la línea germinal. Alternativa de novo enfoques tales como la electroporación en el útero o la inyección estereotáxica lentiviral producir resultados más rápidos y son menos costosos, pero tienen la desventaja de requerir una intervención quirúrgica compleja ^1-3. Además, la expresión transgénica tiene un rango espacial limitada con estos métodos. En este documento, se describe un método rápido, fácil, y económico para la manipulación neuronal generalizada a través de la inyección intraventricular de virus adeno-asociado (AAV) en el cerebro de ratón neonatal. El método fue descrito por primera vez por John Wolfe y Marco Passini en 2001, donde se sugirieron pequeño tamaño de partícula de AAV permitió que se difunda dentro del fluido espinal cerebral a medida que pasa desde los ventrículos laterales a través de la barrera ependimaria inmaduro y en el parénquima cerebral ^{4, 5.} La inyección intraventricular de AAV dentro de la frimero 24 hr después de los rendimientos de nacimiento de transducción viral generalizada de subconjuntos neuronales que abarcan todas las regiones del cerebro, de los bulbos olfativos al tallo cerebral ^6,7. Transgenes Virally entregados-se expresan y se activa a los pocos días de la inyección y persisten hasta por un año después de la transducción. Por lo tanto, esta manipulación versátil permite estudios que van desde el desarrollo del cerebro postnatal temprano con el envejecimiento y la degeneración en el adulto.

Al adaptar la técnica a nuestras necesidades experimentales específicos, nos hemos centrado principalmente en AAV8 serotipo debido a que es el más eficiente en la transducción de las neuronas ^6. Se demuestra que el título viral se puede diluir para controlar la densidad de las neuronas transducidas para experimentos de prueba consecuencias de células intrínseca de la manipulación genética. Además, se demuestra que dos virus podrían ser co-inyectados para producir patrones de expresión que se polarizan hacia los conjuntos de neuronas distintas o coincidentes, dependiendo de los serotipos elegidas paraembalaje viral. Nuestro trabajo se expande la versatilidad de esta técnica para su uso en una amplia gama de parámetros experimentales neurociencia.

Protocolo

Realice todos los procedimientos y protocolos que involucran animales de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los procedimientos descritos aquí fueron revisados ​​y aprobados por el Colegio Baylor de Medicina Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

Virus adeno-asociado (AAV) vectores-de replicación incompetente para la entrega transgén en el cerebro de roedores están aprobados para el uso de Bioseguridad Nivel 1. Consulte el sitio web de los CDC para la publicación del Gobierno de Estados Unidos "Bioseguridad en Laboratorios de Microbiología y Biomédicas (bmbl)", que detalla los requisitos específicos relativos a los procedimientos de protección y manejo de virus adecuados. Consulte con el personal local de seguridad veterinaria y ambiental para aprender los requisitos específicos institucionales para los procedimientos que utilizan los virus. Regulaciones con respecto a las salas de procedimientos, cuarentena, y la identificación de las jaulas de riesgo biológico varían a través de las instituciones.

1. Prepare P0 cachorros y madres adoptivas

1. Proporcionar alta Chow grasa para todas las mujeres embarazadas y lactantes para apoyar las demandas de energía de la reproducción y la lactancia.
2. Por la noche, configure una jaula de cría mediante la adición de una o dos mujeres sanas a la jaula de un solo macho residente. A la mañana siguiente, revise las hembras por un tapón de apareamiento y separar las hembras de los machos si un enchufe está presente.
   1. Utilice madres adoptivas para elevar cachorros de un fondo genético con características maternas pobres (por ejemplo, C57BL / 6 o C3HeJ). Madres adoptivos aceptan cachorros de otra camada si las crías nacen transferidos dentro de los cuatro días de la propia camada de la madre de crianza.
   2. Configurar una jaula separada de apareamiento usando ICR hembras o FVB junto a los criadores experimentales de modo que los dos conjuntos de las hembras dan a luz en aproximadamente el mismo tiempo.
3. Las hembras se entregarán en 19 ± 1 días de la fecha de enchufe, dependiendo de la cepa de fondo. Tres días antes de la delivery (16 días después de la fecha de enchufe), coloque la mujer embarazada en una jaula limpia con material de nidificación fresco y un refugio cubierto.
4. Compruebe si los cachorros recién nacidos dos veces al día a partir 2 días antes de la fecha probable de parto (17 días después de la fecha de enchufe). Examine la jaula con un mínimo de estrés a las madres por leerlo a través de la parte inferior de la presencia de los recién nacidos de color rosa. Los ratones generalmente entregan los cachorros en la mañana, pero en raras ocasiones se entregará en la tarde.
5. Planifique para realizar inyecciones tan pronto como los cachorros están amamantando (que será evidente por manchas de leche visibles), o dentro de 6 horas de nacimiento, lo que ocurra primero.

2. preparación del equipo para la inyección

1. Preparar una jeringa de inyección de 10 l con una aguja de 32 G para los recién nacidos P0 generales. Si se realiza la inyección estereotáxica, montar la jeringa en el brazo manipulador.
2. Si usa un marco estereotáxico para inyecciones, enfriar la etapa neonatal a 4-8 ° C mediante la adición de 100% ethanol y hielo seco para el depósito en el extremo frontal del bloque. Mantener la temperatura por encima de 1 ° C para evitar la congelación de los cachorros.

3. Preparar diluciones virales para inyección

1. Preparar una solución de 1% de colorante azul de tripano (20x de stock).
2. Preparar 5-25 alícuotas de virus (AAV) stock adeno-asociado dentro de una cabina de bioseguridad de Clase 2. Coloque estas alícuotas a -80 ° C para su uso futuro. Evite los ciclos de congelación-descongelación adicionales ya que esto hace que el virus de perder la eficacia de transducción.
3. Retire una parte alícuota de AAV del -80 ° C congelador y colocar en hielo para descongelar.
4. Preparar la solución para inyección viral mediante la dilución del virus en solución salina enfriada con hielo 1x tamponada con fosfato (PBS). Comience con una dilución en serie de diez veces ⁽¹⁰ 10-agosto 10 partículas virales / hemisferio) para la optimización inicial del patrón de transducción.
5. Añadir 20x azul de tripano a la solución de AAV a una concentración final de 0,05%.

4. Staging En crías para inyección

1. Coloque una placa de aluminio pequeña en hielo para enfriar. Depositar una tarea toallita seca en la parte superior de la placa para proteger la piel del cachorro desde el metal frío. Esto sirve como una superficie plana frío para anestesiar y la inyección de los cachorros.
2. Preparar una almohadilla de calentamiento adecuado para mantener ratones recién nacidos caliente antes y después de la inyección.
3. Una vez que los cachorros recién nacidos han comenzado a enfermera, eliminar aproximadamente la mitad de ellos de la jaula y dejar la otra mitad con su madre. Coloca los cachorros recogidos en la plataforma de calentamiento a la espera de la inyección.
   NOTA: Si la madre biológica no se preocupa por los cachorros, retire toda la basura de la jaula de inmediato y colocar a los cachorros sobre un bloque de calentamiento a la espera de la inyección. Esta situación puede darse con la primera camada nacida en C57BL / 6 hembras o con otras cepas puras que tienen características pobres de reproducción. En esta situación, manchas de leche no serán visibles en los cachorros recién nacidos.
4. Transferir una cría de la almohadilla térmica sobre la placa de metal frío para inducir la anestesia hipotermia. Espere 2-3 minutos para que el cachorro se convierta en totalmente anestesiado. Confirmar anestesia apretando suavemente una pata y supervisar por falta de movimiento o respiración.

5. La inyección de AAV en ratones recién nacidos

1. A mano alzada inyección intracraneal de AAV en ratones recién nacidos:
   1. Cargar 5 l de AAV diluyó con 0,05% de azul de tripano en la jeringa de inyección.
   2. Limpie suavemente la cabeza del cachorro anestesiado con un algodón empapado en alcohol al 70%.
   3. Identificar los sitios de inyección en 2/5 de la distancia desde la sutura lambda para cada ojo. Un sitio de la inyección alternativa se encuentra a unos 0,8-1 mm lateral de la sutura sagital, a medio camino entre lambda y bregma. Estos puntos de referencia son visibles a través de la piel en P0.
   4. Marcar el sitio de la inyección con una pluma de laboratorio no tóxico.
   5. Sostenga la jeringa con la escala visible para moniToring el volumen de solución dispensada.
   6. Asegúrese de que el pulgar puede llegar a la parte superior del émbolo. A continuación, retire el dedo pulgar del émbolo mientras se coloca la aguja para evitar que accidentalmente distribuir virus.
   7. Encontrar una posición cómoda para sujetar el brazo para la inyección al poner el codo sobre la mesa y se inclina el brazo en el cubo de hielo.
   8. Coloque el cachorro en su lado con su cabeza directamente debajo de la jeringa. Gire la cabeza del cachorro para que el lugar de la inyección marcada quede hacia arriba, y con suavidad pero con firmeza mantener esta posición con la mano abierta.
   9. Mantenga la jeringa perpendicular a la superficie del cráneo y inserte la aguja en el sitio de inyección marcada a una profundidad de aproximadamente 3 mm. Inyectar la aguja hasta que la resistencia disminuye ligeramente, lo que indica que la aguja ha penetrado en el ventrículo lateral. Si se necesita una referencia, marcar 3 mm de la punta de la aguja con el fabricante no tóxico. Ajuste la profundidad de la inyección para el tamaño de las crías y la tensión sobre la base de tinte targeting de los ventrículos.
   10. Mantenga la jeringa rígida de modo que el émbolo puede ser deprimido sin mover la aguja más lejos en el cerebro. Si la inyección se desplaza hacia el tálamo, la propagación viral se verá gravemente limitada.
   11. Comenzar a inyectar lentamente virus mientras se monitoriza el volumen dispensado de la jeringa. Administrar un volumen máximo de 2 l en cada ventrículo. Si la aguja está en la posición correcta, el colorante se extiende para llenar el ventrículo.
   12. Lentamente retire la aguja.
   13. Deje que el primer lugar de la inyección para cerrar antes de inyectar el otro hemisferio.
       NOTA: No inyectar el mismo sitio más de una vez. Volver a insertar el virus fuerzas de aguja que ya ha sido inyectada a filtrarse y causa lesiones o la muerte del cachorro.
   14. Inyectar el ventrículo contralateral usando el mismo procedimiento.
2. Inyección estereotáxica de AAV en ratones neonatal:
   1. Cargar 5 l de AAV se diluyó con 0,05% azul de tripano into la jeringa de inyección en poder del manipulador estereotáxica.
   2. Coloque suavemente la cabeza del cachorro entre las barras del oído del marco neonatal. Asegúrese de que la cabeza es de nivel en el eje Y (de adelante hacia atrás) comprobando que la línea entre lambda y bregma es paralela a la etapa. Asegúrese de que la cabeza es de nivel en el eje X (lado a lado) comprobando que una línea imaginaria entre las orejas, o una línea entre los ojos, es paralela a la etapa.
   3. Limpie suavemente la cabeza del cachorro anestesiado con un algodón empapado en alcohol al 70%.
   4. Utilice el manipulador estereotáxica para colocar la jeringa por encima de lambda y luego cero las coordenadas X e Y. Mover los brazos estereotáxica a (X, Y) = (0,8, 1,5) mm para cachorros P0 estándar.
      NOTA: El tamaño de las crías y las coordenadas estereotáxica puede variar por la tensión y la edad. Ajuste coordenadas basado en inyecciones de colorante según sea necesario para apuntar a los ventrículos laterales.
   5. Lentamente baje la aguja en el sitio de la inyección. La superficie del cráneo se indent y suelte una vez que la aguja ha penetrado en la piel. Retraer la aguja hasta que el cráneo recupera su forma cóncava normal, pero mantener el bisel de la aguja debajo de la piel. Cero la coordenada Z en este punto.
   6. Inserte la aguja hasta Z = -1,7 mm y luego retractarse a -1,5 mm.
   7. Lentamente inyecte el virus. Cada hemisferio puede aceptar hasta 2 l de solución.
   8. Mantener la jeringa en su lugar durante 30-60 segundos después de completar la inyección y luego retraer la aguja lentamente durante 1-2 min.
   9. Repita el procedimiento para el hemisferio contralateral, utilizando coordenadas negativas en el eje X para el sitio de la inyección.
      NOTA: Las coordenadas alternativos para la inyección son (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) mm y (1,2, 1,0, -1,5) mm. Realice la primera inyección en (0.8, 2.0), a continuación, pasar a (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) y, finalmente, (1,2, -1,0). Inyectar 1 l de solución en cada sitio, para un total de 2 l por hemisferio. Mueva rápidamente entre las inyecciones para completar el procedimiento en less de 10 min.

6. post-inyección Care

1. Después de completar las inyecciones en ambos hemisferios, colocar el cachorro de nuevo en la almohadilla de calentamiento hasta que su temperatura corporal y color de la piel vuelva a la normalidad y el cachorro comienza a moverse.
2. Si se utiliza la madre biológica de amamantar a los recién nacidos inyectados, devolver los cachorros inyectados a la madre biológica después de restablecerse el movimiento normal. Coloca los cachorros no inyectados restantes en la plataforma de calentamiento. Repita el procedimiento hasta que se hayan inyectado todos los ratones.
3. Si se utiliza una madre adoptiva para amamantar a los recién nacidos inyectados, transferir todos los cachorros inyectados a la madre de acogida para la atención después de que se recuperen el movimiento normal.
   1. Eliminar la mayor parte o la totalidad de los cachorros que pertenecen a la madre adoptiva de la jaula para asegurar el éxito de los animales inyectados.
   2. Si cachorros de crianza de la madre y las crías inyectados tienen el mismo ojo y la piel de color, marcar las crías de la madre de acogida con una pluma de laboratorio para que puedan serdistinguido más tarde.
   3. Coloque las crías de la madre adoptiva y algunos de su ropa de cama junto con los cachorros inyectados. Asegúrese de que los cachorros inyectados adquieren el aroma de su descendencia biológica para mejorar la aceptación de las nuevas crías.
   4. Coloque sólo los cachorros inyectados de nuevo en la jaula de la madre adoptiva. Cull ningún cachorros restantes de la madre adoptiva.
4. Asegúrese de que la madre asiste a la enfermería y los cachorros inyectados dentro de los 10 min de colocarlos en la jaula. Si la madre no recoge las crías dentro de este tiempo, las crías transferir a otra madre adoptiva.
5. Etiqueta de la jaula con una tarjeta de peligro biológico para mostrar que contiene los animales inyectados con virus. Casa de la jaula en un área aprobada durante 72 horas.
6. Después del período de cuarentena de 72 horas, trasladar a la madre y los cachorros (pero no ropa de cama u otros artículos de la jaula) a una jaula limpia. Lleve a cabo esta transferencia dentro de un gabinete de bioseguridad nivel 2 para evitar la exposición a la ropa de cama de forma viral contaminada. REEncienda la jaula limpia con los animales inyectados a la instalación normal del ratón.
7. Coloque la jaula sucia en una bolsa de riesgo biológico, esterilizar en autoclave, y luego regresar a la jaula para el vivero.

7. Cleanup

1. Colocar la solución de virus restante a 4 ° C para su uso futuro. El virus mantiene la eficacia de transducción durante al menos 2 meses cuando se almacena a 4 ° C ^8.
2. Desinfectar la aguja de inyección y una jeringa con 2% de lejía seguido de enjuagues repetidos en agua desionizada.
3. Limpiar la zona de trabajo con 2% de lejía seguido de etanol al 70%.
4. Recoger todos los artículos desechables que incluyen puntas de pipetas, tubos, mascarilla y guantes en una bolsa de plástico de. Deseche los materiales de desecho como es requerido por las leyes locales y las políticas institucionales (es decir, en autoclave o incinerar).

8. Preparar cerebros de ratón de Imagen

1. Publicar un ratón inyectado en una cámara de dióxido de carbono a la eutanasia de 34 semanas después de la inyección. Siga las pautas institucionales para los procedimientos apropiados de eutanasia. No perfundir los animales con paraformaldehído ya que esto saciar la etiqueta de fluorescencia.
2. Retire todo el cerebro del cráneo y fijar, por 3-12 horas en paraformaldehído al 4% en PBS a 4 ° C.
3. Transferir el cerebro fija al 30% de sacarosa para crioprotección. Incubar a 4 ° C hasta que el cerebro hunde hasta el fondo.
4. Recoge un cubo de hielo seco finamente picado. Cortar el cerebro a la mitad hacia abajo de la línea media. Denunciar las mitades del cerebro en el hielo seco para congelar.
5. Enfriar la fase microtomo añadiendo hielo seco y etanol al 100%.
6. Asegure el cerebro a los escenarios con la línea media hacia abajo con PBS, y dejar que se congele.
7. Sección a través del cerebro a 30-45 micras de espesor utilizando un microtomo de congelación-deslizante.
8. Se colocan los cortes en placas de 24 pocillos que contenían solución anticongelante (250 ml de glicerol, 300 ml de etileno glicol, 500 ml de tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4). Las placas de cubierta wipapel de aluminio ª y almacenar a -20 ° C para su uso futuro.
9. Recoge las secciones 1-4 pocillos y lavar 3 veces en PBS.
10. Mount secciones en portaobjetos de microscopio y cubreobjetos. Permita que se sequen en un lugar oscuro.
11. Diapositivas de imágenes utilizando los filtros adecuados para YFP nativo o tdTomato para comprobar el patrón de transducción de virus.

Resultados

El éxito de los rendimientos de inyección viral intraventricular expresión neuronal generalizada y robusto. Aquí evaluamos la transducción viral usando YFP o tdTomato genes fluorescentes bajo el control del promotor de la beta-actina de pollo (promotor CBA). Estas construcciones se empaquetan en AAV8 y se inyectan en los ventrículos laterales del neonatales ratones (P0) ICR. Altos títulos virales (10 ¹⁰ partículas por hemisferio) resultaron en etiquetado denso del bulbo olfatorio, el cuerpo estriado, ...

Discusión

Hemos descrito un procedimiento versátil para manipular la expresión génica neuronal usando AAV como vehículo para la entrega generalizada en el cerebro de ratón neonatal. En comparación con otros métodos de transgénesis neuronal tales como electroporación en el útero ¹ o inyección intracraneal estereotáxico ^2,3, inyección viral neonatal es relativamente fácil y simple. El procedimiento básico se puede realizar en minutos con sólo un cubo de hielo y una jeringa de microlitro. Superv...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR outbred mice	Harlan	Hsd:ICR (CD-1)	This strain is also known as CD-1
FVB inbred mice	The Jackson Laboratory	1800	5-6 weeks of age
Nestlets	Lab Supply	NESTLETS
Shepherd shacks	Lab Supply	SS-mouse
High fat rodent chow	Purina Mills	PicoLab Mouse diet 20, #5058	This is our standard breeder chow
High fat rodent chow (alternative)	Harlan Laboratories	Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S	If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed
Injection syringe	Hamilton	7653-01	10 ml syringe
Injection needles	Hamilton	7803-04, RN 6PK PT4, 0.375"	32 G, for standard P0 injections
Metal plate for cryoanesthesia	McMaster Carr	8975K439	Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop
Small animal stereotaxic device with digital readout	David Kopf Instruments	Model 940
Universal syringe holder with needle support foot	David Kopf Instruments	Model 1772-F1
Neonatal frame	Stoelting	51625	Officially called a mouse and neonatal rat adaptor
Biohazard disposal bags with sterile indicator	VWR	14220-030	Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal