Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Özet

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Özet

Bilimsel gelişmeler hızlanarak ile, yeni yöntemler hızlı ve kolay fare beyninin gen ifadesini işlemek için deneysel nörobilim için gereklidir. Burada ilk yenidoğan fare beyninin içine viral olarak kodlanmış Transgenlerin doğrudan intrakranial teslimat için Passini ve Wolfe tarafından tanıtılan bir tekniği açıklar. En temel formunda, prosedür sadece bir buz kovası ve bir mikrolitre şırınga gerektirir. Bununla birlikte, aynı zamanda, iletişim kuralı tekniğe yeni araştırmacı tutarlılığını arttırmak için sterotaksik çerçeveler ile birlikte kullanılmak üzere adapte edilebilir. Bir yöntem olup, astarlama ependim hala doğumdan sonraki ilk 12-24 saat içinde ise olgunlaşmamış beyin parankimasma içine serebral ventriküller serbestçe hareket adeno-ilişkili virüs (AAV) de yeteneklerine bağlıdır. Beyin boyunca nöronların yaygın iletiminde bu yaş sonuçlara AAV'nin intraventriküler enjeksiyonu. İfade enjeksiyon gün içinde başlar ve lifetim için devamhayvan örn. Viral titresi floresan proteini ko-ekspresyonu kalıt aktarımlı hücrelerin önemli bir etiket sağlar iken, transduse nöronların yoğunluğunu kontrol etmek için ayarlanabilir. Hem off-the-raf, ambalajlı reaktifler ve özel viral hazırlanmasını sağlamak viral çekirdek tesislerin yükselen durumu ile, bu yaklaşım, hızlı, kolay ve çok daha az pahalı fare beyninin gen ifadesini değiştirmek için bir zamanında bir yöntem sunuyor Geleneksel germlıne mühendislik daha.

Giriş

Nöral gen ifadesini değiştirerek geleneksel yöntemler zaman alıcı ve pahalı germlıne manipülasyonlar gerektirir. De novo Alternatif hızlı sonuçlar ve daha az maliyetlidir fakat karmaşık cerrahi müdahale ^1-3 gerektiren bir dezavantajına sahip utero elektroporasyon veya steryotaksik Lentiviral enjeksiyon gibi yaklaşımlar. Ayrıca, transgen ifade bu yöntemler ile sınırlı mekansal yelpazesine sahiptir. Burada, neonatal fare beyin adeno-ilişkili virüs (AAV) intraventriküler enjeksiyon ile yaygın nöronal manipülasyon için bir hızlı, kolay ve ekonomik bir yöntem tarif etmektedir. Bu yöntem ilk ^olarak, AAV, bu olgunlaşmamış ependim bariyerden ile beyin parankiması ^4, lateral ventriküllere geçtiği gibi beyin omurilik sıvısı içinde dağılmasına izin onlar küçük bir parçacık boyutuna önerilen 2001, John Wolfe Marco Passini tarafından tanımlanmıştır ^5. F içindeki AAV'nin intraventriküler enjeksiyonuirst doğum verimleri bulbuslarında gelen beyin sapı ^6,7 için, beynin her bölgesini kapsayan nöral altkümelerin yaygın viral transdüksiyon sonra 24 saat. Viral-teslim transgenler ifade ve enjeksiyon gün içinde aktif ve transdüksiyon sonra bir yıl kadar daha devam edilir. Dolayısıyla, bu çok yönlü manipülasyon erken doğum sonrası beyin gelişiminde gelen yetişkin yaşlanma ve dejenerasyon kadar çalışmaları sağlar.

Bu nöronlar ⁶ transducing de en verimli olduğu için bizim özel deneysel ihtiyaçlarına tekniği adapte olarak, öncelikle AAV8 serotipinden odaklanmıştır. Viral titre genetik manipülasyon deneyler test hücre iç sonuçlardan transduse nöronların yoğunluğunu kontrol etmek için seyreltilmiş edilebileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, iki virüs için seçilen serotipler bağlı olarak, bu durum nöron ayrı veya üst üste gelen kümeler doğru bastırılmaktadır salgılanma modellerini üretmek için birlikte enjekte edilebilir olduğunu göstermektedirViral ambalaj. Çalışmalarımız deneysel nörobilim ayarları geniş bir yelpazede kullanım için bu tekniğin çok yönlülük genişler.

Protokol

Tüm prosedürleri ve Bakımı ve Kullanımı Laboratuvar Hayvanları Sağlık Rehberi National Institutes göre hayvanlarla ilgili protokolleri gerçekleştirin. Burada anlatılan prosedürleri gözden ve Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Baylor College tarafından kabul edildi.

Kemirgen beyin transgen için replikasyon-yetersiz adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörleri Biyo güvenlik seviyesi 1 kullanım için onaylanmıştır. Uygun koruma ve virüs kullanım prosedürleri ile ilgili özel gereksinimler detayları "Mikrobiyoloji ve Biyomedikal Laboratuvarları (BMBL) Biyogüvenlik" ABD Hükümeti yayın için CDC web sitesine bakın. Virüslerin kullanıldığı işlemleri için kurumsal özel gereksinimleri öğrenmek için yerel veteriner ve çevre güvenliği personeli ile kontrol edin. Prosedür odaları, karantina ve biyolojik tehlike kafesleri belirlenmesi ile ilgili yönetmelikler kurumlar arasında farklılık gösterebilir.

1. ÖnP0 Pups ve Foster Anneler pare

1. Bütün hamile ve emziren dişiler üreme ve laktasyon enerji taleplerini desteklemek için yüksek yağ chow sağlayın.
2. Akşamları, bir tek yerleşik erkek kafesine bir veya iki sağlıklı kadın ekleyerek bir yetiştirme kafesi yukarı ayarlayın. Sonraki sabah, bir birleşme fiş kadın kontrol etmek ve bir fiş mevcut ise, erkek ve dişileri ayrı gelen.
   1. (Örneğin, C57BL / 6 veya C3HeJ) kötü anne özellikleri olan bir genetik geçmişe ikinci yavrular artırmak için koruyucu anneler kullanın. Transfer yavrular üvey annenin kendi çöp dört gün içinde doğmuş olması gerekir üvey anneler başka bir aileden gelen yavrular kabul.
   2. Kadın iki kümesi yaklaşık olarak aynı zamanda uygulanması ve böylece deneysel yetiştiriciler yanında ICR veya FVB kadın kullanarak ayrı bir birleşme kafes kadar ayarlayın.
3. Dişiler plan suşu bağlı olarak, fiş tarihinden itibaren 19 ± 1 gün içinde teslim edecek. Üç gün önce d(16 gün fiş tarihinden sonra) elivery, taze iç içe malzeme ve kapalı barınak ile temiz bir kafese hamile kadın yerleştirin.
4. Günde iki kez, beklenen doğum tarihinden 2 gün önce (17 gün fiş tarihinden sonra) başlayan yenidoğan yavrular için kontrol edin. Pembe yenidoğan varlığı için alt atmayı ile annelere minimum stresle kafes inceleyin. Fareler genellikle öğleden sonra teslim edecek Sabah, ancak nadir durumlarda yavrular teslim.
5. Yavrular, ya da hangisi önce doğum 6 saat, içinde (görünür süt noktalar belirgin olacaktır) hemşirelik gibi kısa sürede enjeksiyonları gerçekleştirmeyi planlıyoruz.

2. Enjeksiyon için donatım hazırlayın

1. Genel P0 yenidoğanlar için 32 G iğne ile 10 ul enjeksiyon şırınga hazırlayın. Steryotaksik enjeksiyon performans ise, manipülatör kolunun üzerine şırınga monte.
2. Enjeksiyonlar için bir stereotaksik çerçeve kullanılıyorsa,% 100 Ethan ekleyerek 4-8 ​​° C'ye kadar soğutulması aşamasını yenidoğanol ve bloğun ön ucunda hazneye kuru buz. Yavruların donmaya önlemek için 1 ° C üstünde bir sıcaklığa koruyun.

3. Enjeksiyon için viral seyreltilerde hazırlayın

1. ,% 1 tripan mavi boya solüsyonu (20x stok) hazırlayın.
2. Sınıf 2 biyogüvenlik kabini içinde adeno-ilişkili virüs (AAV) stokunun 5-25 ul alikotları hazırlayın. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de bu alikotları yerleştirin. Bu iletim etkinliğini kaybedecek virüs neden olur gibi ek donma-erime döngülerinden kaçınmak.
3. Çözülmesi için buz üzerine -80 ° C dondurucu ve yerden AAV bir numuneyi çıkarın.
4. Buzla soğutulmuş 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içine virüs seyreltilmesi ile enjeksiyon için viral çözelti hazırlayın. Transdüksiyon modeli ilk optimizasyonu için bir on kat seri seyreltme ⁽¹⁰ 10 ⁸ 10, viral partikül / yarıküre) ile başlar.
5. % 0.05 kadar bir son konsantrasyon elde etmek için, AAV çözeltiye 20x tripan mavisi ekleyin.

4. Enjeksiyon için Yenidoğan Pups evreleme

1. Soğutmak için buz üzerinde küçük bir alüminyum levha yerleştirin. Kuru görev soğuk metal yavrunun cildi korumak için levhanın üstüne silin yerleştirin. Bu yavrular anestezi ve enjekte edilmesi için düz bir soğuk bir yüzey olarak görev yapar.
2. Sıcak önce ve enjeksiyondan sonra neonatal fareler tutmak için uygun bir ısınma dolgusunu hazırlayın.
3. Yenidoğan yavrular hemşire başladı sonra, kafesin bunların yaklaşık yarısının kaldırmak ve anneleri ile diğer yarısını bırakın. Enjeksiyonu beklerken ısınma pad üzerinde toplanan yavrular yerleştirin.
   NOT: biyolojik anne yavrular için umurumda değil, derhal kafesten tüm çöp kaldırmak ve enjeksiyon beklenmeye bir ısınma pad üzerine yavrular yerleştirin. Bu durum C57BL / 6 kadın veya zayıf üreme özelliklerine sahip diğer kendilenmiş suşları ile doğan ilk yavru ile ortaya çıkabilir. Bu durumda, süt noktalar yenidoğan yavrular görünür olmayacaktır.
4. Hipotermi anestezi sağlamak, soğuk metal plakanın üzerine ısınma pad itibaren bir yavru aktarın. Yavru tamamen anestezi olmak için 2-3 dk bekleyin. Çok nazikçe bir pençe sıkarak anestezi onaylayın ve hareket ya da solunum eksikliği izlemek.

Yenidoğan Farelerde içine AAV'nin 5. Enjeksiyon

1. Ücretsiz el yenidoğan farelere AAV'nin içi enjeksiyon:
   1. Yük enjeksiyon şırınga içine% 0.05 tripan mavisi ile seyreltilmiş AAV'nin 5 ul.
   2. Yavaşça% 70 etanol batırılmış bir pamuklu çubukla anestezi yavru başını silin.
   3. Her göze lambda dikişine gelen mesafe 2/5 enjeksiyon siteleri belirlemek. Alternatif bir enjeksiyon sitesi yaklaşık 0,8-1 mm yarım lambda ve bregmadan arasındaki, sagital sütür gelen yanal yer almaktadır. Bu görülecek P0 deri yoluyla görebilir.
   4. Toksik olmayan bir laboratuar kalem ile enjeksiyon yerinde işaretleyin.
   5. Monitörler için görünür skala ile şırınga tutunçözeltinin hacmini toring dağıtılır.
   6. Başparmak pistonun üst ulaşmak emin olun. Virüs dağıtım yanlışlıkla önlemek için iğne konumlandırma ederken Sonra pistonu başparmak çıkarın.
   7. Buz kovası kol bankta dirsek koyarak ve eğilerek enjeksiyon için kol brace rahat bir pozisyon bulun.
   8. Doğrudan şırınga altında kafası ile yan yavru yatıyordu. İşaretli enjeksiyon sitesi yukarı bakacak şekilde yavrunun kafasını çevirin ve yavaşça ama sıkıca açık bir elinizle bu konumda tutun.
   9. Kafatasının yüzeyine dikey enjektörü ve yaklaşık 3 mm'lik bir derinliğe kadar işaretli enjeksiyon yerinde iğneyi. Direnç iğne yanal ventrikül içine nüfuz ettiğini göstermektedir, hafifçe düşer kadar iğne enjekte edilir. Referans ihtiyaç varsa, toksik olmayan makinesi iğnesinin ucu 3 mm işaretleyin. Boya t dayalı yavru boyutu ve suş için enjeksiyon derinliğini ayarlayınventriküllerin argeting.
   10. Piston beyne uzak iğne hareket olmayan depresif olabilir, böylece katı bir şırınga tutun. Enjeksiyon talamus itildiğinde, ağız yoluyla dağıtımı ciddi sınırlı olacaktır.
   11. Şırınga dağıtılan seviyesini izlerken yavaş virüs enjekte başlayın. Her ventrikül içine 2 ul maksimum hacmi yönetmek. İğne doğru pozisyonda ise, boya ventrikül doldurmak yayılacak.
   12. Yavaşça iğneyi çıkartın.
   13. Ilk enjeksiyon sitesi diğer yarımkürede enjekte önce kapatmak için izin verin.
       NOT: Bir kez daha aynı site daha enjekte etmeyin. Zaten kaçak enjekte ve yavru yaralanma veya ölüme neden olmuştur iğne güçleri virüs reinserting.
   14. Aynı prosedür kullanılarak, karşı ventrikül enjekte edilir.
2. Yenidoğan farelere AAV'nin stereotaksik enjeksiyonu:
   1. % 0.05 tripan mavisi int ile seyreltildi, AAV'nin yük 5 ulstereotaksik manipülatör tarafından düzenlenen enjeksiyon şırınga o.
   2. Yavaşça yenidoğan çerçevenin kulak çubukları arasında yavrunun kafasını yerleştirin. Emin baş lambda ve bregmadan arasındaki çizgi sahneye paralel olduğunu kontrol ederek Y-ekseninde seviyesi (önden arkaya) olduğundan emin olun. Emin kafa kulaklar, ya da gözleri arasında bir çizgi arasında bir hayal çizgi, sahneye paralel olduğunu kontrol ederek X-ekseninde seviyesi (yan yana) olduğundan emin olun.
   3. Yavaşça% 70 etanol batırılmış bir pamuklu çubukla anestezi yavrunun kafasını silin.
   4. Lambda Yukarıda şırınga konumlandırmak için stereotaksik manipülatör kullanın ve daha sonra X ve Y koordinatlarını sıfır. = (X, Y) stereotaksik kollarını hareket ettirin (0.8, 1.5) standart P0 yavrular için mm.
      NOT: Pup boyut ve stereotaksik koordinatlar zorlanma ve yaşa göre değişebilir. Lateral ventriküllerin hedef gerektiği gibi boya enjeksiyonu dayalı koordinatları ayarlayın.
   5. Yavaş yavaş enjeksiyon yerinde içine iğne düşük. Kafatasının yüzeyi ind doyurmayaİğne cildi nüfuz sonra ent ve sonra serbest bırakın. Kafatası normal içbükey şeklini kurtarır kadar iğne geri çekin, ancak cilt altında iğne eğim tutun. Z bu noktada koordinat sıfır.
   6. Z = -1.7 mm kadar iğne takın ve daha sonra -1.5 mm çekin.
   7. Yavaş yavaş virüs enjekte. Her hemisfer çözüm 2 ul kadar kabul edebilir.
   8. Enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, 30-60 saniye yerinde tutmak ve şırınga daha sonra yavaş yavaş 1-2 dakika boyunca iğne geri çekilir.
   9. Enjeksiyon bölgesinde için X-ekseninde negatif koordinatlarını kullanarak, Kontralateral hemisferde için tekrarlayın.
      Not: enjeksiyon için alternatif koordinatlar (X, Y, Z, (=), 0.8, 2.0, -1.5) mm (1.2, 1.0, -1.5) mm. (0.8, 2.0) ilk enjeksiyonu işlemi, son olarak da (0.8, 2.0), (1.2, 1.0) ve (1.2, -1.0) hareket ettirin. , Hemisfer başına 2 ml'lik bir toplam her yerinde çözeltinin 1 ul enjekte edilir. Les yordamı tamamlamak için enjeksiyonlar arasında hızla hareket10 dakika daha lar.

6. Post-enjeksiyon Bakımı

1. Her iki yarımkürede içine enjeksiyon tamamladıktan sonra, normal vücut ısısı ve cilt rengi dönene kadar ısınma pad üzerinde yavru geri yerleştirin ve yavru hareket etmeye başlar.
2. Enjekte yenidoğanlar hemşire biyolojik anne kullanıyorsanız bunlar normal hareketini kurtarmak sonra, biyolojik anneye enjekte yavrular dönmek. Isınma pad üzerinde kalan Uninjected yavrular yerleştirin. Tüm farenin enjekte edilene kadar işlemi tekrarlayın.
3. Enjekte yenidoğanlar hemşire için üvey annen kullanıyorsanız bunlar normal hareketini kurtardıktan sonra, bakım için üvey annenin bütün enjekte yavrular aktarın.
   1. Enjekte edilen hayvanların başarısını sağlamak için çoğu veya kafesinden Üvey anneden ait yavruların tümünü kaldırmak.
   2. Foster annenin yavruların ve enjekte yavrular aynı göz ve cilt rengi varsa onlar olabilir böylece, bir laboratuar kalem ile beslemek anneden yavrular işaretlemekDaha sonra ayırt.
   3. Foster annenin yavrularını ve enjekte yavrular ile birlikte onların yatak bazı yerleştirin. Enjekte yavrular yeni yavruların kabul iyileştirmek için onun biyolojik yavruların kokusunu elde emin olun.
   4. Geri foster annenin kafesine içine sadece enjekte yavrular yerleştirin. Üvey anneden kalan yavrular itlaf.
4. Anne katılıyor ve kafesin içine yerleştirerek 10 dakika içinde enjekte yavrular hemşirelik emin olun. Anne, bu süre içinde yavrular toplamak değilse, başka bir bakıcı anneye yavrular transfer.
5. Bu viral-enjekte hayvanları içerdiğini göstermek için bir biohazard kartı ile kafesi etiketleyin. Ev 72 saat boyunca onaylı bir bölgede kafes.
6. 72 saat karantina döneminden sonra, temiz bir kafes anne ve yavrular (ancak hiçbir yatak veya diğer kafes öğeler) aktarın. Herhangi bir viral-kontamine yatak maruz kalmasını önlemek için bir Düzey 2 biyogüvenlik kabini içinde bu transferi gerçekleştirin. Rnormal fare tesisine enjekte edilmiş hayvanlardan olan temiz bir kafes eturn.
7. , Biyolojik olarak tehlikeli torba içine kirli kafes yerleştirin otoklavlanarak sterilize edilir ve daha sonra vivaryum için kafes döner.

7. Temizleme

1. Ileride kullanılmak üzere 4 ° C 'de, geri kalan virüs çözümü yerleştirin. 4 ° C'de ⁸ arasında saklandığında en az bir virüs, 2 ay boyunca transdüksiyon etkinliğinin muhafaza eder.
2. Iyonu giderilmiş su içinde tekrar kez durulanır ve ardından% 2 ağartıcı ile bir iğne ve şırınga dezenfekte.
3. % 70 etanol ile takip% 2 çamaşır suyu ile çalışma alanı temizleyin.
4. Plastik biyolojik tehlike torba içinde pipet uçları, tüpler, maske, ve eldivenler dahil tüm tek öğeleri toplamak. Yerel yasalar ve kurumsal politikalar (yani otoklav veya yakmayın) gerektirdiği atık malzemelerin imha ediniz.

8. Görüntüleme Fare Brain hazırlayın

1. 3- bir karbon dioksit ötenazi odasına enjekte fare yerleştirin4 hafta sonrası enjeksiyon. Uygun ötanazi uygulamaları için kurumsal kurallarına uyun. Bu floresan etiketi gidermek olacak gibi paraformaldehitle hayvanları serpmek etmeyin.
2. Kafatası bütün beyinleri çıkarın ve 4 ° C de PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde 3-12 saat boyunca düzeltin.
3. Donmaya karşı koruma sağlamak için,% 30 sakaroza sabit beyin aktarın. Beyin dibine batar kadar 4 ° C'de inkübe edilir.
4. Ince ufalanmış kuru buz bir kova toplayın. Orta hatta aşağı yarısında beyin kesin. Dondurmak için kuru buz içinde beyin yarıyı sakla.
5. Kuru buz ve% 100 etanol eklenerek mikrotom sahne soğutun.
6. PBS kullanarak aşağı orta çizgisi ile sahneye beyin Güvenli ve donmasına izin.
7. Bir donma-kayar mikrotomu kullanılarak 30-45 mikron kalınlığında beyin aracılığıyla Bölüm.
8. Antifriz solüsyonu (250 mi, gliserol, 300 ml etilen glikol, 500 ml 0.1 M fosfat tamponu, pH 7.4) içeren 24 oyuklu plakalar içinde yer bölümleri. Kapak plakaları wigelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de inci kalay folyo ve saklayın.
9. 1-4 kuyulardan bölümleri toplayın ve PBS içinde 3x yıkayın.
10. Mikroskop slaytlar ve kapak üzerine Dağı bölümleri. Slaytlar karanlık bir konuma kurumasını bekleyin.
11. Yerli YFP veya tdTomato uygun filtreleri kullanarak görüntü slaytlar virüs transdüksiyon desen kontrol etmek.

Sonuçlar

Başarılı ventrikül içi enjeksiyon, viral verimleri ve yaygın nöronal sağlam ifade. Burada YFP veya tavuk beta aktin promoteri (CBA promotör) kontrolü altında tdTomato floresan genler kullanılarak viral transdüksiyon değerlendirildi. Bu yapılar AAV8 içine paketlenmiş ve neonatal (P0) ICR fındık fareleri lateral ventriküllere enjekte edildi. Yüksek virüs titerleri (hemisfer başına 10 ¹⁰ parçacıklar) (sol, Şekil 1A) yoğun bir koku ampul etiketleme, striatum, serebral ...

Tartışmalar

Yenidoğan fare beyin yaygın dağıtımı için bir araç olarak kullanılarak AAV nöronal gen ekspresyonunu kontrol etmek için bir çok yönlü bir prosedür tarif edilmiştir. Böyle utero elektroporasyon ¹ veya sterotaksik intrakranial enjeksiyon ^2,3 olarak nöronal transgenesis diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, yenidoğan viral enjeksiyon nispeten kolay ve basittir. Temel prosedür, sadece bir buz kovası ve bir mikrolitre şırınga ile birkaç dakika içinde yapılabilir. O...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR outbred mice	Harlan	Hsd:ICR (CD-1)	This strain is also known as CD-1
FVB inbred mice	The Jackson Laboratory	1800	5-6 weeks of age
Nestlets	Lab Supply	NESTLETS
Shepherd shacks	Lab Supply	SS-mouse
High fat rodent chow	Purina Mills	PicoLab Mouse diet 20, #5058	This is our standard breeder chow
High fat rodent chow (alternative)	Harlan Laboratories	Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S	If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed
Injection syringe	Hamilton	7653-01	10 ml syringe
Injection needles	Hamilton	7803-04, RN 6PK PT4, 0.375"	32 G, for standard P0 injections
Metal plate for cryoanesthesia	McMaster Carr	8975K439	Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop
Small animal stereotaxic device with digital readout	David Kopf Instruments	Model 940
Universal syringe holder with needle support foot	David Kopf Instruments	Model 1772-F1
Neonatal frame	Stoelting	51625	Officially called a mouse and neonatal rat adaptor
Biohazard disposal bags with sterile indicator	VWR	14220-030	Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal