Интрацеребровентрикулярное Вирусный Инъекция по неонатологии мозга мыши для устойчив и распространен нейронов трансдукции

Резюме

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Аннотация

С темпы научного прогресса быстро ускоряется, новые методы необходимы для экспериментальной неврологии быстро и легко манипулировать экспрессии генов в мозге мыши. Здесь мы опишем технику впервые введено Пассини и Вулф для прямого внутричерепного доставки вирусно-кодированных трансгенов в неонатальном мозге мыши. В своей самой базовой форме, процедура требует только ведро со льдом и микролитровых шприц. Однако протокол также может быть адаптирована для использования с стереотаксических кадрами чтобы улучшить согласованность для исследователей новых к технике. Метод основан на способности адено-ассоциированный вирус (AAV) свободно перемещаться из желудочков головного мозга в паренхиме головного мозга в то время как эпендимных подкладка еще незрелый в течение первых 12-24 часов после рождения. Внутрижелудочковая инъекция AAV в этом возрасте приводит к широко распространенной трансдукции нейронов по всему мозгу. Выражение начинается через несколько дней после инъекции и сохраняется в течение lifetimэлектронной животного. Титр вируса можно регулировать, чтобы контролировать плотность трансдуцированных нейронов, в то время как совместная экспрессия флуоресцентного белка обеспечивает важную метку трансдуцированных клеток. С ростом доступности вирусных основных объектов обеспечения и вне-полки, расфасованные реагенты и заказ вирусный препарат, такой подход предоставляет своевременную способ манипулирования экспрессию генов в мозге мыши, которая быстро, легко, и гораздо дешевле, чем традиционные зародышевой инженерии.

Введение

Традиционные методы для модификации выражение нейронной гена требуют трудоемких и дорогостоящих зародышевых манипуляций. Альтернативный De Novo подходов, таких как внутриутробное электропорации или стереотаксической инъекции лентивирусов дают более быстрые результаты и являются менее дорогостоящими, но имеют тот недостаток, что требует сложного хирургического вмешательства ^1-3. Кроме того, выражение трансгена имеет ограниченный пространственный спектр с этими методами. Здесь мы опишем быстрый, легкий, и экономичный метод для широкого нейронов манипуляции с помощью внутрижелудочкового введения аденоассоциированного вируса (AAV) в неонатальном мозге мыши. Этот метод был впервые описан John Wolfe и Marco Пассини в 2001 году, где они предложили малый размер частиц AAV позволило ему диффундировать в спинно-мозговой жидкости, когда она проходит от боковых желудочков через незрелых эпендимных барьер и в паренхиме головного мозга ^{4, 5.} Внутрижелудочковая инъекция AAV в фрежде 24 ч после рождения урожайности широко распространены вирусная трансдукции нейронных подмножеств, охватывающих все области мозга, от обонятельных луковиц в стволе головного мозга ^6,7. Виралли устанавливаемые трансгены выражены и активным в течение нескольких дней инъекции и сохраняться в течение до одного года после трансдукции. Таким образом, этот универсальный манипуляции позволяет исследования, начиная от раннего развития послеродовой мозга старения и дегенерации у взрослых.

При адаптации технику к нашим конкретных экспериментальных потребностей, мы были сосредоточены в основном на AAV8 серотипа, потому что это самый эффективный на трансдуцирующих нейроны ^6. Мы покажем, что титр вируса может быть разбавлен контролировать плотность трансдуцированными нейронов для сотовых-внутренняя последствий тестирования эксперименты генетических манипуляций. Кроме того, мы показываем, что два вируса могут совместно вводят производить паттерны экспрессии, которые смещены в сторону различных или совпадающих наборов нейронов, в зависимости от серотипов, выбранных длявирусная упаковка. Наша работа расширяет универсальность этой методики для использования в широком диапазоне экспериментальных условиях Neuroscience.

протокол

Выполните все процедуры и протоколы, связанные с животным в соответствии с Национальными Институтами путеводителя по уходу и использованию лабораторных животных. Процедуры, описанные здесь были рассмотрены и одобрены Медицинского колледжа Бэйлора Уходу за животными и использованию комитета.

Репликация-некомпетентным аденоассоциированный вирус (AAV) векторов для доставки трансгенов в мозге грызунов одобрены для уровня биологической 1 использования. Обратитесь на сайт CDC для публикации правительства США "биобезопасности в микробиологии и биомедицинских лабораториях (BMBL)" в котором подробно конкретные требования в отношении надлежащей защиты и обработки вирус процедур. Проверьте с местным персоналом ветеринарной и экологической безопасности, чтобы узнать, институциональные требования, специфичные для процедур с использованием вирусов. Правила о процедуре номеров, карантинных и идентификации биологически опасных клеток различаются по учреждений.

1 Preсрезать P0 детенышей и приемной матери

1. Обеспечить высокую Фат Чоу для всех беременных и кормящих женщин, чтобы поддерживать энергетические потребности разведения и кормления грудью.
2. Вечером, создали питательную клетку путем добавления одного или двух здоровых самок в клетке одного жителя мужского пола. На следующее утро, проверить самок для спаривания вилки и отделить женщин от мужчин, если плагин присутствует.
   1. Используйте приемных матерей, чтобы поднять щенков от генетического фона с бедных матерей характеристик (например, C57BL / 6 или C3HeJ). Приемные мамы принимают щенков из другого помета, если переданные щенки рождаются в течение четырех дней собственного помета приемных матери.
   2. Настройте отдельный спаривания клетку, используя ICR или FVB самок наряду экспериментальных заводчиков, так что эти два набора женщин доставить примерно в то же время.
3. Самки доставит в 19 ± 1 дней с даты плагина, в зависимости от фонового напряжения. За три дня до Delivery (через 16 дней после даты плагина), поместите беременных женщин в чистую клетку с пресной раскроя материала и крытое помещение.
4. Проверьте новорожденных щенков два раза в день, начиная за 2 дня до ожидаемой даты поставки (17 дней после даты плагина). Осмотрите клетку с минимальным стрессом для матерей по выглядывал через дно на наличие розовых новорожденных. Мыши обычно доставить щенков утром, но в редких случаях будет поставлять в полдень.
5. План выполнения инъекции, как только щенки кормящих (которая будет видно видимыми молока пятен), или в течение 6 ч рождения, что наступит раньше.

2 Подготовьте оборудование для инъекций

1. Приготовьте 10 мкл инъекционный шприц с 32 G иглы для общих P0 новорожденных. При выполнении стереотаксической инъекции, смонтировать шприц на манипулятора.
2. При использовании стереотаксической рамки для инъекций, охладить новорожденных этап к 4-8 ° С, добавив 100% Итанола и сухого льда в резервуаре на переднем конце блока. Поддерживайте температуру выше 1 ° С, чтобы избежать обморожения из щенков.

3 Подготовьте Вирусные разведений для инъекций

1. Подготовьте 1% трипановый решение синий краситель (20x наличии).
2. Подготовьте 5-25 мкл аликвот аденоассоциированного вируса (AAV) складе внутри класса 2 биобезопасности кабинета. Поместите эти аликвоты при -80 ° С для дальнейшего использования. Избегайте дополнительных циклов замораживания-оттаивания, так как это вызывает вирус терять трансдукции эффективность.
3. Удалить аликвоту AAV от -80 ° C морозильник и место на льду таять.
4. Подготовьте вирусный раствор для инъекций путем разбавления вируса в ледяную 1x фосфатным буферным солевым раствором (PBS). Начните с десятикратным серийного разведения (10 от ¹⁰ до 10 ⁸ вирусных частиц / полушария) для начальной оптимизации шаблона трансдукции.
5. Добавить 20x трипановым синим в AAV растворе до конечной концентрации 0,05%.

4. Постановка новорожденные щенки для инъекций

1. Нанесите небольшое алюминиевая пластина на льду, чтобы охладиться. Поместите сухой задачей стереть в верхней части пластины для защиты кожи щенка от холодного металла. Это служит плоской холодной поверхности для анестезии и инъекционных щенков.
2. Подготовьте потепления площадку, подходящую для поддержания новорожденных мышей тепло до и после инъекции.
3. После того, как новорожденные щенки начали медсестра, удалить примерно половина из них из клетки и оставить вторую половину со своей матерью. Поместите собранные щенков на потепление площадку в ожидании инъекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если биологическая мать не заботится о щенков, удалить весь мусор из клетки сразу и поместите щенков на потепления площадку в ожидании инъекции. Такая ситуация может возникнуть с первого помета, рожденного C57BL / 6 самок или с другими инбредных линий, которые имеют плохие характеристики размножения. В этой ситуации, молочные пятна не будут видны на новорожденных щенков.
4. Трансфер одного щенка от потепления площадку на холодную металлическую пластину, чтобы вызвать гипотермию анестезии. Подождите 2-3 минуты для щенка, чтобы стать полностью под наркозом. Подтвердите анестезии очень нежно сжимает лапу и монитор для отсутствия движения или дыхания.

5 Инъекция AAV в новорожденных мышей

1. Бесплатный рук внутричерепное введение AAV в неонатальном мышей:
   1. Нагрузка 5 мкл разбавленной AAV с 0,05% трипанового синего в шприц для инъекций.
   2. Аккуратно протрите головку анестезированной щенка ватным тампоном, смоченным в 70% этанола.
   3. Определить инъекции сайты на 2/5 расстояния от лямбда шва для каждого глаза. Альтернативный участок инъекции находится примерно в 0,8-1 мм латерально от сагиттального шва, на полпути между лямбда и брегмы. Эти ориентиры видны через кожу при P0.
   4. Отметить место инъекции нетоксичного лабораторного пера.
   5. Держите шприц со шкалой видимой для Мониторинг объем раствора обойтись.
   6. Убедитесь, что палец может достичь вершины поршня. Затем снимите палец с поршнем, а также позиционирование иглы, чтобы избежать случайного дозирования вирус.
   7. Найдите удобное положение, чтобы окружить руку для инъекций, поставив локоть на скамейке и, опираясь на руку на ведре со льдом.
   8. Положите щенка на бок с его головы прямо под шприц. Поверните голову щенка так, чтобы его маркированная место инъекции вверх, и мягко, но твердо удержать эту позицию с открытой ладонью.
   9. Удерживая шприц перпендикулярно к поверхности черепа и вставить иглу в отмеченных месте инъекции на глубину примерно 3 мм. Введите иглу до тех пор, сопротивление незначительно уменьшается, указывая, что игла проникла в боковой желудочек. Если ссылка необходима, отмечают 3 мм от кончика иглы с нетоксичным производителя. Отрегулируйте глубину впрыска для размера щенка и деформации на основе красителя тargeting желудочков.
   10. Удерживая шприц жестко таким образом, что поршень может быть подавлен без перемещения иглы дальше в головном мозге. Если инъекция смещается в таламус, вирусное распространение будет сильно ограничен.
   11. Начните медленно инъекционных вирус во время мониторинга распределенного объема из шприца. Администрирование максимальный объем 2 мкл в каждую желудочка. Если игла находится в правильном положении, краситель будет распространяться для заполнения желудочка.
   12. Медленно извлеките иглу.
   13. Разрешить первый участок инъекции, чтобы закрыть перед инъекцией другом полушарии.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Не вводить тот же сайт несколько раз. Повторная вирус игольчатые силы, что уже вводят просачиваться и вызывает травмы или смерть щенка.
   14. Введите контралатеральный желудочек, используя ту же самую процедуру.
2. Стереотаксическая инъекция AAV в неонатальном мышей:
   1. Нагрузка 5 мкл разбавленного AAV с 0,05% трипанового синего междунаро инъекции шприцем, проведенного стереотаксической манипулятора.
   2. Аккуратно поместите голову щенка между уха баров неонатального кадра. Убедитесь, что голова уровень в Y-оси (спереди назад), проверяя, что грань между лямбда и брегмы параллельно сцене. Убедитесь, что голова уровень в оси Х (из стороны в сторону), проверив, что воображаемая линия между ушами, или линии между глазами, параллельно сцене.
   3. Аккуратно протрите голову под наркозом щенка ватным тампоном, смоченным в 70% этанола.
   4. Используйте стереотаксической манипулятор для позиционирования выше лямбда шприц, а затем обнулить X и Y координаты. Перемещение стереотаксические оружие (X, Y) = (0,8, 1,5) мм для стандартных P0 щенков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер Щенок и стереотаксической координаты могут варьироваться в зависимости от штамма и возраста. Отрегулируйте координаты на основе инъекций красителя, как необходимы для восполнения боковые желудочки.
   5. Медленно опустите иглу в месте инъекции. Поверхность черепа будет индЛОР и затем отпустите раз игла проникла в кожу. Уберите иглу, пока череп не восстанавливает свою нормальную вогнутую форму, но сохранить скос иглы под кожу. Нулевой Z координат в этой точке.
   6. Вставьте иглу до Z = -1,7 мм, а затем убрать в -1,5 мм.
   7. Медленно введите вирус. Каждое полушарие может принять до 2 мкл раствора.
   8. Держите шприц в месте в течение 30-60 сек после завершения инъекции, а затем медленно втяните иглу над 1-2 мин.
   9. Повторите эти действия для контралатерального полушария, используя отрицательные координаты в X-оси для инъекции.
      Примечание: Альтернативные координаты для инъекции (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) мм и (1,2, 1,0, -1,5) мм. Выполните первую инъекцию в (0,8, 2,0), а затем перейти к (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) и, наконец, (1.2, -1.0). Введите 1 мкл раствора на каждом участке, в общей сложности 2 мкл на полушарии. Быстро перемещаться между инъекциями, чтобы завершить процедуру в ЛЕс чем 10 мин.

6 Сообщение впрыском Уход

1. После завершения инъекции в оба полушария, не размещать щенка обратно на потепление площадку, пока его температура тела и кожи цвета возвращения к нормальной жизни и щенок начинает двигаться.
2. При использовании биологическую мать, чтобы ухаживать инжектированные новорожденных, вернуться инжектированные щенков к биологической матери после того, как восстановить нормальное движение. Поместите оставшиеся неинъецированных щенков на потепление площадку. Повторите процедуру, пока все мыши не были введены.
3. При использовании приемных маму кормить инжектированные новорожденных, передать все инъекционные щенков к приемной матери для ухода после восстановления нормального движения.
   1. Удалить все или почти все из щенков, принадлежащих к приемной матери из клетки, чтобы обеспечить успех инжектированных животных.
   2. Если щенки приемной матери и вводили щенки имеют одинаковую глаз и цвет кожи, отмечают щенков от приемной матери с лабораторной перо, чтобы они могут бытьотличается позже.
   3. Поместите щенков приемной матери, и некоторые из их залегания вместе с инжектированных щенков. Убедитесь, что введенные щенки приобретают аромат ее биологического потомства улучшить принятие новых щенков.
   4. Поместите только инъекционные щенков обратно в клетку приемного матери. Cull оставшихся щенков от приемной матери.
4. Убедитесь, что мать идет к и уход инжектированные щенков в течение 10 мин размещения их в клетку. Если мать не собирает щенков в течение этого времени, передать щенков в другой приемной матери.
5. Этикетка клетку с биологической карты, чтобы показать, что он содержит вирусно-инъекционные животных. Дом клетка в специально предназначенном месте в течение 72 часов.
6. После 72 ч карантинного периода, передать матери и щенков (но без постельных принадлежностей или других предметов Кейдж) на чистую клетку. Выполните эту передачу внутри правительственного уровня 2 биологической безопасности, чтобы избежать контакта с любой вирус-загрязненной подстилки. RВозвращенная чистую клетку с инжектированных животных в регулярный объекте мыши.
7. Поместите грязную клетку в биологической мешок, стерилизовать в автоклаве, а затем вернуться в клетку к вивария.

7 Очистка

1. Поместите оставшееся вирусов решение при 4 ° С для дальнейшего использования. Вирус сохраняет эффективность трансдукции не менее 2 месяцев при хранении при 4 ° С ^8.
2. Дезинфекцию инъекционную иглу и шприц с 2% хлорной извести с последующим повторных промывок в деионизированной воде.
3. Очистите рабочую зону с 2% отбеливателя с последующим 70% этанола.
4. Соберите все одноразовые предметы в том числе наконечников пипеток, трубок, маски и перчатки в пластиковой биологической мешок. Удаление отходов в соответствии с требованиями местного законодательства и институциональной политики (то есть автоклав или сжигать).

8 Подготовьте мозг мышей для визуализации

1. Разместить вводят мышь в двуокиси углерода эвтаназии камере при 3-4 недели после инъекции. Следуйте институциональные рекомендации по надлежащих процедур эвтаназии. Не заливать животных с параформальдегиде как это утолит этикетку флуоресценции.
2. Удалить Весь головной мозг черепа и исправить в течение 3-12 ч в 4% параформальдегид в PBS при 4 ° С.
3. Перенести фиксированную мозг 30% сахарозы для криозащиты. Инкубируют при 4 ° С до тех пор, пока мозг опускается на дно.
4. Соберите ведро мелко измельченного сухого льда. Вырезать мозг пополам вниз по средней линии. Бери половинки мозга в сухом льду, чтобы заморозить.
5. Охладите этап микротоме добавлением сухого льда и 100% этанола.
6. Закрепите мозг на сцену с средней линии вниз с помощью PBS, и позволяют заморозить.
7. Раздел через мозг на уровне 30-45 толщиной мкм с использованием замерзания скольжения микротом.
8. Место разделы в 24-луночные планшеты, содержащие растворы антифриза (250 мл глицерина, 300 мл этиленгликоль, 500 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,4). Накладки Wiй фольга и хранить при температуре -20 ° C для дальнейшего использования.
9. Соберите секции из 1-4 скважин и промыть 3 раза в PBS.
10. Mount разделы Онто микроскопа и покровным. Разрешить слайды высохнуть в темном месте.
11. Горки изображение, используя соответствующие фильтры для родной YFP или tdTomato проверить шаблон вирус трансдукции.

Результаты

Успешные интравентрикулярные доходность вирусной инъекции распространенным и надежным нейронов выражения. Здесь мы оценили вирусную трансдукцию с помощью YFP или tdTomato флуоресцентные гены под контролем курица бета промотор актина (ЦБА промоутера). Эти конструкции были упакованы в AAV8 и...

Обсуждение

Мы описали универсальный порядок манипулирования выражение нейронов генов с помощью AAV как транспортное средство для широкого доставки в неонатальном мозге мыши. По сравнению с другими методами нейронов трансгенеза, например, внутриутробное электропорации ¹ или стереотаксичес...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR outbred mice	Harlan	Hsd:ICR (CD-1)	This strain is also known as CD-1
FVB inbred mice	The Jackson Laboratory	1800	5-6 weeks of age
Nestlets	Lab Supply	NESTLETS
Shepherd shacks	Lab Supply	SS-mouse
High fat rodent chow	Purina Mills	PicoLab Mouse diet 20, #5058	This is our standard breeder chow
High fat rodent chow (alternative)	Harlan Laboratories	Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S	If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed
Injection syringe	Hamilton	7653-01	10 ml syringe
Injection needles	Hamilton	7803-04, RN 6PK PT4, 0.375"	32 G, for standard P0 injections
Metal plate for cryoanesthesia	McMaster Carr	8975K439	Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop
Small animal stereotaxic device with digital readout	David Kopf Instruments	Model 940
Universal syringe holder with needle support foot	David Kopf Instruments	Model 1772-F1
Neonatal frame	Stoelting	51625	Officially called a mouse and neonatal rat adaptor
Biohazard disposal bags with sterile indicator	VWR	14220-030	Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal