Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

Résumé

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Résumé

Avec le rythme des progrès scientifiques accélérer rapidement, de nouvelles méthodes sont nécessaires pour neurosciences expérimentales de manipuler rapidement et facilement l'expression des gènes dans le cerveau de la souris. Nous décrivons ici une technique introduite par Passini et Wolfe pour la livraison intracrânienne directe des transgènes d'origine virale codée dans le cerveau de souris nouveau-né. Dans sa forme la plus simple, la procédure exige seulement un seau à glace et une seringue microlitre. Toutefois, le protocole peut également être adapté pour une utilisation avec des cadres stéréotaxiques d'améliorer la cohérence de nouveaux chercheurs de la technique. Le procédé repose sur la capacité des virus adéno-associé (AAV) de se déplacer librement dans les ventricules cérébraux dans le parenchyme du cerveau tandis que le revêtement épendymaire est encore immature au cours de la première de 12 à 24 heures après la naissance. Injection intraventriculaire de l'AAV à cet âge, les résultats dans la transduction généralisée des neurones dans le cerveau. Expression commence dans les jours suivant l'injection et persiste pendant la lifetime de l'animal. Titre viral peut être réglé pour contrôler la densité de neurones transduites, tandis que la co-expression d'une protéine fluorescente fournit une étiquette vital de cellules transduites. Avec la disponibilité croissante des installations de base virales pour fournir des réactifs à la fois hors-the-shelf, pré-emballés et préparation virale coutume, cette approche offre une méthode opportune pour la manipulation de l'expression des gènes dans le cerveau de la souris qui est rapide, facile et beaucoup moins coûteux d'ingénierie traditionnel de la lignée germinale.

Introduction

Les méthodes traditionnelles pour modifier l'expression des gènes de neurones ont besoin de temps et les manipulations de la lignée germinale coûteux. Alternative de novo approches comme dans l'électroporation in utero ou injection stéréotaxique lentiviral donner des résultats plus rapides et moins coûteuses mais présentent l'inconvénient de nécessiter une intervention chirurgicale complexe ^1-3. En outre, l'expression du transgène a une portée spatiale limitée avec ces méthodes. Ici, nous décrivons une méthode rapide, simple et économique pour la manipulation neuronale généralisée par injection intraventriculaire de virus adéno-associé (AAV) dans le cerveau de souris nouveau-nés. La méthode a été décrite par John Wolfe et Marco Passini en 2001, où ils ont suggéré petite taille de particule d'AAV a permis de se diffuser dans le liquide céphalo-rachidien qui passe à partir des ventricules latéraux à travers la barrière épendymaire immatures et dans le parenchyme cérébral ^{4, 5.} L'injection intraventriculaire de l'AAV à l'intérieur de la fIRST 24 h après la naissance des rendements de transduction virale généralisée des sous-ensembles de neurones couvrant toutes les régions du cerveau, des bulbes olfactifs de tronc cérébral ^6,7. Transgènes d'origine virale livrés sont exprimés et active dans les jours suivant l'injection et persistent jusqu'à un an après la transduction. Ainsi, cette manipulation polyvalent permet des études allant du développement du cerveau postnatal précoce de vieillissement et la dégénérescence chez l'adulte.

En adaptant la technique à nos besoins expérimentaux spécifiques, nous avons mis l'accent principalement sur ​​AAV8 sérotype car elle est la plus efficace pour transduire des neurones ^6. Nous montrons que le titre viral peut être dilué pour contrôler la densité de neurones transduites pour essai de conséquences expériences cellulaires intrinsèques de manipulation génétique. De plus, nous démontrons que les deux virus peuvent être co-injectés pour produire des profils d'expression qui sont sollicités vers des ensembles distincts de neurones ou qui se chevauchent, en fonction des sérotypes choisis pourencapsidation virale. Notre travail se développe la polyvalence de cette technique pour une utilisation dans un large éventail de paramètres de neurosciences expérimentales.

Protocole

Effectuer toutes les procédures et protocoles impliquant des animaux conformément aux National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Les procédures décrites ici ont été examinés et approuvés par le Baylor College of Medicine institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

virus adéno-associé (AAV) vecteurs de réplication incompétent pour la livraison du transgène dans le cerveau de rongeurs sont approuvés pour le niveau de biosécurité 1 utilisation. Consultez le site Web CDC pour la publication du gouvernement américain "prévention des risques biotechnologiques en microbiologie et biomédicales Laboratories (BMBL)" qui détaille les exigences spécifiques concernant les procédures de protection et de transport de virus appropriés. Vérifiez auprès du personnel de sécurité vétérinaire et environnementale locale pour connaître les exigences spécifiques de procédures institutionnelles pour utilisant des virus. Règlement concernant les pièces de la procédure, la quarantaine, et l'identification des cages de risque biologique varient selon les institutions.

1. Prépare P0 chiots et Foster mères

1. Fournir haute chow de graisse pour toutes les femmes enceintes et allaitantes de soutenir les besoins énergétiques de la reproduction et la lactation.
2. Dans la soirée, mettre en place une cage d'élevage en ajoutant une ou deux femelles en bonne santé à la cage d'un mâle résident unique. Le lendemain matin, vérifiez les femmes pour une prise d'accouplement et de séparer les femmes des hommes, si une prise est présente.
   1. Utilisez mères adoptives pour élever les petits à partir d'un fond génétique avec les caractéristiques maternelles pauvres (par exemple, C57BL / 6 ou C3HeJ). Mères adoptives acceptent chiots d'une autre portée si les chiots sont nés transférés dans les quatre jours de la litière propre de la mère nourricière.
   2. Mettre en place une cage d'accouplement séparé à l'aide ICR femelles ou FVB à côté des éleveurs expérimentaux, afin que les deux groupes de femmes accouchent à peu près au même moment.
3. Les femelles livrer dans 19 ± 1 jours à compter de la date de la prise, en fonction de la souche de fond. Trois jours avant dIVRAISON (16 jours après la date de prise), placer la femme enceinte dans une cage propre avec du matériel de nidification frais et un abri couvert.
4. Vérifiez nouveaux-nés deux fois par jour à partir 2 jours avant la date prévue de l'accouchement (17 jours après la date de prise). Examinez la cage avec un minimum de stress pour les mères en regardant à travers le fond de la présence de nouveau-nés roses. Souris délivrent des petits le matin, mais en de rares occasions prononcera dans l'après-midi.
5. Planifiez à pratiquer des injections dès que les chiots sont allaitent (qui sera évident par les taches de lait visibles), ou dans les 6 heures de la naissance, selon la première éventualité.

2 Préparer l'équipement pour injection

1. Préparer une seringue d'injection de 10 pi avec une aiguille de 32 G pour les nouveau-nés généraux P0. Si vous effectuez injection stéréotaxique, monter la seringue dans le bras manipulateur.
2. Si vous utilisez un cadre stéréotaxique pour préparations injectables, refroidir le stade néonatal à 4-8 ° C en ajoutant 100% ethanet d'utilisation de la neige carbonique dans le réservoir à l'extrémité avant du bloc. Maintenir la température au-dessus de 1 ° C pour éviter les gelures des chiots.

3 Préparer les dilutions virales pour injection

1. Préparer un trypan solution de colorant bleu de 1% (20x stock).
2. Préparer des aliquotes 5-25 ul de virus adéno-associé (AAV) de bouillon dans une enceinte de sécurité biologique de classe 2. Placez ces aliquotes à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Eviter les cycles de congélation-décongélation supplémentaires que cela entraîne la transduction du virus à perdre leur efficacité.
3. Retirer une aliquote de l'AAV de -80 ° C congélateur et placer sur la glace à dégeler.
4. Préparation de la solution pour injection virale par le virus de dilution dans une solution saline de phosphate de 1x glacée tamponnée (PBS). Commencer avec une dilution en série de dix fois ⁽¹⁰ oct-10 août particules virales / hémisphère) pour l'optimisation de la configuration initiale de transduction.
5. Ajouter 20x bleu trypan à la solution de l'AAV à une concentration finale de 0,05%.

4. Mise en scène du nouveau-nés pour injection

1. Placer une petite plaque d'aluminium sur la glace pour refroidir. Placer une tâche chiffon sec sur le dessus de la plaque pour protéger la peau du chiot à partir du métal froid. Cela sert comme une surface froide plat pour anesthésier et injecter les chiots.
2. Préparer un coussin chauffant approprié pour garder souriceaux nouveau-nés au chaud avant et après l'injection.
3. Une fois que les nouveau-nés ont commencé à infirmière, d'éliminer environ la moitié d'entre eux de la cage et laisser l'autre moitié avec leur mère. Placez les petits recueillies sur le coussin chauffant en attendant injection.
   REMARQUE: Si la mère biologique ne se soucie pas pour les chiots, retirez la litière de la cage immédiatement et placer les chiots sur un coussin chauffant à attendre injection. Cette situation peut se produire avec la première portée née à C57BL / 6 femelles ou avec d'autres souches consanguines qui ont des caractéristiques de reproduction pauvres. Dans cette situation, les taches de lait ne seront pas visibles sur nouveau-nés.
4. Transférer un chiot de la coussin chauffant sur la plaque de métal froid pour induire une hypothermie anesthésie. Attendez 2-3 min pour le chiot à devenir pleinement anesthésiés. Confirmez l'anesthésie en pressant très doucement une patte et surveiller l'absence de mouvement ou la respiration.

5. injection de l'AAV à des souris nouveau-né

1. Gratuit main d'injection intracrânienne de l'AAV à des souris nouveau-né:
   1. Charge 5 ul de AAV dilué avec 0,05% de bleu trypan dans la seringue d'injection.
   2. Essuyez doucement la tête du chiot anesthésié avec un coton-tige imbibé d'éthanol à 70%.
   3. Identifier les points d'injection à 5.2 de la distance à partir de la suture lambda à chaque oeil. Site d'injection de remplacement est située à environ 0,8 à 1 mm latéralement à partir de la suture sagittale, à mi-chemin entre le bregma et lambda. Ces points de repère sont visibles à travers la peau à P0.
   4. Marquer le point d'injection avec un stylo de laboratoire non-toxique.
   5. Tenez la seringue avec l'échelle visible pour moniveillance le volume de solution distribuée.
   6. Assurez-vous que le pouce puisse atteindre le haut du piston. Ensuite, retirer le pouce du piston tout en positionnant l'aiguille pour éviter accidentellement distribution virus.
   7. Trouver une position confortable pour caler le bras pour injection en plaçant le coude sur le banc et se penchant sur le bras le seau à glace.
   8. Placez le chiot sur le côté avec la tête directement sous la seringue. Tournez la tête du chiot afin que le site d'injection marquée vers le haut, et doucement mais fermement tenir cette position avec une main ouverte.
   9. En tenant la seringue perpendiculaire à la surface du crâne et introduire l'aiguille au niveau du site d'injection marqué jusqu'à une profondeur d'environ 3 mm. Injecter l'aiguille jusqu'à ce que la résistance diminue légèrement, ce qui indique que l'aiguille a pénétré dans le ventricule latéral. Si l'on avait besoin d'une référence, marquer 3 mm de la pointe de l'aiguille avec machine non-toxique. Régler la profondeur d'injection pour la taille de chiot et de la souche sur la base de colorant targeting des ventricules.
   10. En tenant la seringue de façon rigide de sorte que le plongeur peut être enfoncé sans déplacer l'aiguille plus loin dans le cerveau. Si l'injection est déplacé dans le thalamus, la propagation virale sera sévèrement limitée.
   11. Commencer l'injection de virus lentement tout en surveillant le volume distribué à partir de la seringue. L'administration d'un volume maximal de 2 ul dans chaque ventricule. Si l'aiguille est dans la position correcte, le colorant se propage à remplir le ventricule.
   12. Retirer lentement l'aiguille.
   13. Laisser le premier site d'injection avant l'injection pour fermer l'autre hémisphère.
       NOTE: Ne pas injecter le même site plus d'une fois. Réinsérer le virus des forces de l'aiguille qui a déjà été injecté à s'échapper et cause un préjudice ou la mort du chiot.
   14. Injecter le ventricule controlatéral en utilisant la même procédure.
2. Injection stéréotaxique de l'AAV à des souris nouveau-né:
   1. Charge 5 pi d'AAV dilué avec 0,05% trypan int bleuo la seringue d'injection a eu lieu par le manipulateur stéréotaxique.
   2. Placez délicatement la tête du chiot entre les barres d'oreilles de la trame du nouveau-né. Assurez-vous que la tête est au niveau de l'axe Y (avant vers l'arrière) en vérifiant que la ligne entre lambda et bregma est parallèle à la scène. Assurez-vous que la tête est au niveau de l'axe des X (côté à l'autre) en vérifiant que une ligne imaginaire entre les oreilles, ou une ligne entre les deux yeux, est parallèle à la scène.
   3. Essuyez doucement la tête du chiot anesthésié avec un coton-tige imbibé d'éthanol à 70%.
   4. Utilisez le manipulateur stéréotaxique pour positionner la seringue au-dessus de lambda, puis zéro les coordonnées X et Y. Déplacez les bras stéréotaxiques à (X, Y) = (0,8, 1,5) mm pour bébés P0 standard.
      NOTE: taille de chiot et coordonnées stéréotaxiques peuvent varier selon la souche et l'âge. Réglez coordonnées basé sur des injections de colorants nécessaires pour cibler les ventricules latéraux.
   5. Abaissez lentement l'aiguille dans le site d'injection. La surface du crâne sera indent puis relâchez une fois l'aiguille a pénétré dans la peau. Rétracter l'aiguille jusqu'à ce que le crâne retrouve sa forme concave normale, mais garder le biseau de l'aiguille sous la peau. Zéro la coordonnée Z à ce point.
   6. Insérer l'aiguille jusqu'à Z = -1,7 mm et puis se rétractent à -1,5 mm.
   7. Lentement injecter le virus. Chaque hémisphère peut accepter jusqu'à 2 pi de solution.
   8. Conserver la seringue en place pendant 30-60 secondes après la fin de l'injection, puis retirer lentement l'aiguille sur 1-2 min.
   9. Répétez l'opération pour l'hémisphère controlatéral, à l'aide des coordonnées négatives sur l'axe X pour le site d'injection.
      REMARQUE: coordonnées alternatifs pour l'injection sont (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) mm et (1.2, 1.0, -1.5) mm. Effectuer la première injection à (0,8, 2,0), puis passer à (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) et enfin (1.2, -1.0). Injecter 1 pl de solution sur chaque site, pour un total de 2 pi par hémisphère. Déplacez-vous rapidement entre les injections pour terminer la procédure dans less à 10 min.

6. post-injection de soins

1. Après avoir terminé les injections dans les deux hémisphères, placez le chiot de retour sur le coussin chauffant jusqu'à son retour de la couleur de la température du corps et de la peau à la normale et le chiot commence à se déplacer.
2. Si vous utilisez la mère biologique pour soigner les nouveau-nés injectés, retourner les chiots injecté à la mère biologique après qu'ils récupèrent le mouvement normal. Placez les petits non-injecté restant sur le coussin chauffant. Répétez la procédure jusqu'à ce que toutes les souris ont été injectées.
3. Si vous utilisez une mère d'accueil pour soigner les nouveau-nés injectés, transférer tous les petits injecté à la mère d'accueil pour les soins après qu'ils récupèrent le mouvement normal.
   1. Enlever la plupart ou la totalité des chiots appartenant à la mère nourricière de la cage pour assurer le succès des animaux injectés.
   2. Si les chiots de la mère adoptive et chiots injectés ont la même couleur de peau et des yeux, marquer chiots de la mère d'accueil avec un stylo de laboratoire afin qu'ils puissent êtredistinguer par la suite.
   3. Placez les chiots de la mère nourricière et une partie de leur literie avec les chiots injectés. Veiller à ce que les chiots injectés acquérir l'odeur de sa progéniture biologique afin d'améliorer l'acceptation des nouveaux chiots.
   4. Placez seulement les chiots réinjecté dans la cage de la mère nourricière. Abattre des petits restants de la mère nourricière.
4. Assurez-vous que la mère assiste à nourrir leurs petits et injectés dans les 10 min de les placer dans la cage. Si la mère ne recueille pas les chiots dans ce délai, le transfert à un autre chiots mère adoptive.
5. Étiqueter la cage avec une carte de risque biologique pour montrer qu'il contient des animaux d'origine virale injectés. Maison de la cage dans un endroit approuvé pour 72 heures.
6. Après la période de quarantaine de 72 heures, transférer la mère et les petits (mais pas de literie ou d'autres articles de la cage) à une cage propre. Effectuez ce transfert dans une enceinte de sécurité biologique de niveau 2 pour éviter l'exposition à toute la literie contaminés par un virus. ReTurn la cage propre avec les animaux injectés à l'établissement régulier de la souris.
7. Placez la cage sale dans un sac de risque biologique, stériliser à l'autoclave, puis retourner la cage pour le vivarium.

7 Nettoyage

1. Placer la solution de virus restant à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. Le virus conserve l'efficacité de transduction pendant au moins 2 mois lorsqu'elle est stockée à 4 ° C ^8.
2. Désinfecter l'aiguille d'injection et une seringue avec 2% d'agents blanchissants, suivi par des rinçages répétés dans de l'eau désionisée.
3. Nettoyer la zone de travail avec 2% de l'eau de Javel suivie par 70% d'éthanol.
4. Collecter tous les objets jetables, y compris les embouts de pipette, tubes, masque et des gants dans un sac en plastique risque biologique. Éliminer les déchets conformément à la loi locale et les politiques institutionnelles (c.-à-autoclave ou incinérer).

8 Préparer cerveaux de souris pour l'imagerie

1. Passer une souris injectée dans une chambre de l'euthanasie de dioxyde de carbone à 34 semaines après l'injection. Suivez les directives institutionnelles pour les procédures d'euthanasie appropriées. Ne pas perfuser les animaux avec du paraformaldéhyde comme cela éteindre l'étiquette de fluorescence.
2. Retirer l'ensemble des cerveaux de crâne et de fixer pour 3-12 heures dans du paraformaldéhyde 4% dans du PBS à 4 ° C.
3. Transférer le cerveau fixe à 30% de saccharose pour la cryoconservation. Incuber à 4 ° C jusqu'à ce que le cerveau coule au fond.
4. Recueillir un seau de glace sèche finement broyée. Couper le cerveau en deux en bas de la ligne médiane. Enterrez les moitiés du cerveau dans la glace sèche à geler.
5. Refroidir le stade de microtome en ajoutant de la neige carbonique et de l'éthanol à 100%.
6. Fixez le cerveau de la scène avec la ligne médiane vers le bas à l'aide de PBS, et le gel.
7. Section à travers le cerveau à 30-45 um d'épaisseur à l'aide d'un microtome de congélation coulissant.
8. Placer les articles dans des plaques à 24 puits contenant une solution d'antigel (250 ml de glycerol, 300 ml d'éthylène glycol, 500 ml de 0,1 M de tampon phosphate, pH 7,4). plaques de couverture wie papier d'aluminium et conserver à -20 ° C pour une utilisation future.
9. Recueillir sections de 1-4 puits et laver 3x PBS.
10. Sections de montage sur des lames de microscope et lamelle. Laisser les lames sécher dans un endroit sombre.
11. Les diapositives d'images à l'aide de filtres appropriés pour YFP natif ou tdTomato pour vérifier le motif de transduction du virus.

Résultats

Le succès d'injection intraventriculaire rendement viral d'expression généralisée et robuste neuronale. Ici, nous avons évalué la transduction virale utilisant YFP ou tdTomato gènes fluorescents sous le contrôle du promoteur de la bêta de poulet de l'actine (promoteur de l'ABC). Ces constructions ont été emballés dans AAV8 et injecté dans les ventricules latéraux de souris (P0) ICR néonatales. Titres viraux élevés (10 ^{à 10} particules par hémisphère) ont donné lieu à l'...

Discussion

Nous avons décrit un procédé polyvalent pour la manipulation de l'expression génique en utilisant des neurones AAV comme vecteur de livraison répandu dans le cerveau de souris nouveau-nés. Comparé à d'autres méthodes de transgénèse neuronale tels que électroporation in utero ou ^une injection intracrânienne stéréotaxique ^2,3, injection virale néonatale est relativement facile et simple. La procédure de base peut être réalisé en quelques minutes seulement avec un seau à g...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR outbred mice	Harlan	Hsd:ICR (CD-1)	This strain is also known as CD-1
FVB inbred mice	The Jackson Laboratory	1800	5-6 weeks of age
Nestlets	Lab Supply	NESTLETS
Shepherd shacks	Lab Supply	SS-mouse
High fat rodent chow	Purina Mills	PicoLab Mouse diet 20, #5058	This is our standard breeder chow
High fat rodent chow (alternative)	Harlan Laboratories	Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S	If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed
Injection syringe	Hamilton	7653-01	10 ml syringe
Injection needles	Hamilton	7803-04, RN 6PK PT4, 0.375"	32 G, for standard P0 injections
Metal plate for cryoanesthesia	McMaster Carr	8975K439	Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop
Small animal stereotaxic device with digital readout	David Kopf Instruments	Model 940
Universal syringe holder with needle support foot	David Kopf Instruments	Model 1772-F1
Neonatal frame	Stoelting	51625	Officially called a mouse and neonatal rat adaptor
Biohazard disposal bags with sterile indicator	VWR	14220-030	Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal