영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

요약

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

초록

과학적 진보의 속도가 급속하게 가속으로, 새로운 방법은 빠르고 쉽게 마우스 뇌에서 유전자 발현을 조작하는 실험 신경 필요하다. 여기에서 우리는 첫째 신생아 마우스의 뇌에 바이러스처럼 인코딩 유전자의 직접 두개 내 배달 Passini와 울프에 의해 도입 된 기술을 설명합니다. 가장 기본적인 형태에서, 절차는 얼음 양동이 마이크로 리터 주사기를 필요로한다. 그러나, 프로토콜은 기술에 대한 새로운 연구 일관성을 향상시키기 위해 정위 된 프레임과 함께 사용하도록 구성 될 수있다. 방법은 뇌실막 라이닝 여전히 출생 후 처음 12-24 시간 동안 미숙 상태에서 뇌 실질에 대뇌 심실에서 자유롭게 이동하는 아데노 - 연관 바이러스 (AAV)의 능력에 의존한다. 뇌 신경 세포에 걸쳐 광범위하게 전달이 시대 결과에서 AAV의 뇌 실내 주입. 식 주입 일 이내에 시작 lifetim 지속동물의 예. 바이러스 역가가 형광 단백질의 공동 발현은 형질 도입 된 세포의 중요한 라벨을 제공하는 반면, 형질 뉴런의 밀도를 제어하기 위해 조절 될 수있다. 두 기성품 사전이 패키지 시약 및 커스텀 바이러스 제제를 제공하는 바이러스 코어 시설 상승 가용성이 방법은 빠르고 쉽고 훨씬 저렴 마우스 뇌에서 유전자 발현을 조작하기위한 적시 방법을 제공한다 기존의 생식 세포 공학을.

서문

신경 유전자 발현을 변경하기위한 전통적인 방법은 시간과 비용이 많이 소요 생식선 조작을 필요로한다. 노보 데 대체 빠른 결과를 얻을 수 및 비용이 덜 드는하지만 복잡한 수술 적 치료 ^1-3을 요구하는 단점이있다 자궁 전기 천공 법 (electroporation) 또는 정위 렌티 바이러스 주입에 같은 접근한다. 또한, 형질 전환 유전자의 발현은 이들 방법으로 한정 공간 범위를 갖는다. 여기서, 우리는 신생아 마우스의 뇌에 아데노 - 관련 바이러스 (AAV)의 뇌 실내 주입을 통해 광범위한 신경 세포 조작을위한 빠르고, 쉽고, 경제적 인 방법을 설명합니다. 이 방법은 ^첫째, AAV 그것이 미숙 뇌실막 장벽을 통해 뇌 실질 ^(4)에 횡 심실로부터 전달대로 뇌척수액 내에서 확산 할 수의 그들이 작은 입자 크기를 제시 2001, 존 울프 마르코 Passini 의해 설명되었다 ^5. F 내 AAV의 뇌 실내 주입IRST 출생 수익률 후각 전구에서 뇌간 ^6,7로, 뇌의 모든 영역에 걸쳐 신경 부분 집합의 광범위한 바이러스 전달 후 24 시간. 바이러스 성으로 배달 된 유전자는 표현 주입 일 이내에 활성 및 전달 후 최대 1 년 동안 지속된다. 따라서,이 다양한 조작은 출생 초기 뇌 발달에서 성인의 노화 및 퇴행성 변화에 이르기까지 다양한 연구를 할 수 있습니다.

이 뉴런 ^{6 열} 변환에서 가장 효율적이므로 우리의 요구에 특정한 실험 기법을 적응에서는 주로 AAV8 혈청 형에 초점을 맞추고있다. 우리는 바이러스 역가가 유전자 조작 실험의 테스트 셀 고유의 결과에 대한 형질 뉴런의 밀도를 제어하기 위해 희석 될 수 있음을 보여준다. 또한, 우리는이 바이러스 혈청 형에 대한 선택에 따라 별개의 뉴런 또는 중첩 세트를 향해 바이어스된다 발현 패턴을 생성하기 위해 공동으로 주입 될 수 있음을 입증바이러스 성 포장. 우리의 연구는 신경 과학 실험 설정의 넓은 범위에서 사용하기위한이 기술의 기능성을 확장한다.

프로토콜

모든 절차와 관리 및 사용 실험 동물의 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 동물을 포함하는 프로토콜을 수행합니다. 여기에 설명 된 절차를 검토하고 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 베일러 대학에 의해 승인되었다.

쥐의 뇌에서 유전자 전달을위한 복제 - 무능한 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 벡터는 바이오 안전성 레벨 1의 사용이 승인됩니다. 적절한 보호 및 바이러스 처리 절차에 대한 특정 요구 사항 "미생물학 및 생물 의학 연구소 (BMBL)에서 바이오 안전성"미국 정부 간행물에 대한 CDC 웹 사이트를 참조하십시오. 바이러스를 사용 절차에 대한 제도적 특정 요구 사항을 배우고 지역의 동물과 환경 안전 담당자에게 문의하십시오. 절차 실, 검역 및 생물 학적 케이지의 식별에 관한 규정은 기관에 따라 다르며.

1 전P0 새끼들까지 잔치 및 포스터 어머니를 깎다

1. 모든 임신 및 수유 여성은 번식 수유의 에너지 수요를 지원하기 위해 높은 지방 차우를 제공합니다.
2. 저녁에는 단일 거주 남성의 케이지에 하나 또는 두 개의 건강한 여성을 추가하여 사육 케이지를 설정합니다. 다음 날 아침, 짝짓기 플러그에 여성을 확인하고 플러그가있는 경우 남성에서 여성으로 구분합니다.
   1. (예를 들어, C57BL / 6 C3HeJ) 가난한 산모의 특성을 가진 유전 적 배경에서 새끼를 높이기 위해 수양 어머니를 사용합니다. 전송 된 새끼가 위탁 어머니의 자신의 쓰레기 사일 내에서 태어난 경우 포스터 어머니는 다른 쓰레기에서 새끼를 받아 들인다.
   2. 암컷의 두 세트가 거의 동시에 전달되도록 실험 브리더 함께 또는 ICR 암컷 FVB를 사용하여 별도 정합 케이지를 설정한다.
3. 여성은 배경 변형에 따라 플러그 날로부터 19 ± 일일에 제공합니다. 세 가지 일 전에 D에(십육일 플러그 날짜 이후) elivery, 신선한 재료를 중첩 및 덮여 쉼터 깨끗한 케이지에 임신 여성을 배치합니다.
4. 하루에 두 번 예상 배송 날짜 2 일 전에 (십칠일 플러그 일 이후)부터 신생아 새끼를 확인합니다. 핑크 신생아의 존재의 바닥을 통해 엿하여 어머니에 최소한의 스트레스와 케이지를 검사합니다. 마우스는 일반적으로 오후에 제공 할 것입니다 아침에 있지만 드문 경우에 새끼를 제공합니다.
5. 새끼가, 또는 먼저 중 출생 6​​ 시간 이내 (가시 우유 관광 명소에 의해 명백 할 것이다) 간호 마자 주사를 수행 할 계획입니다.

2 사출 용 장비를 준비

1. 일반적으로 P0 신생아를위한 32 G 바늘을 10 μL 주입 주사기를 준비합니다. 정위 주사를 수행하는 경우, 조작자 암에 주사기를 장착.
2. 주사를위한 고정대를 사용하는 경우, 100 % 이단을 추가하여 4-8 ° C에 신생아 단계를 냉각OL과 블록의 전방 단부에 리저버에 드라이 아이스. 강아지의 동상을 방지하기 위해 1 ° C 이상 온도를 유지합니다.

3 주입을위한 바이러스 성 희석 준비

1. 1 % 트리 판 블루 염색 용액 (20 배 주식을) 준비합니다.
2. 2 등급 생물 안전 캐비닛 내부에 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 주식의 5-25 ㎕의 분취 량을 준비합니다. 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 이러한 분취를 놓습니다. 이 전달 효능을 잃을 바이러스 발생의 원인이되므로 추가로 동결 - 해동 사이클을 피하십시오.
3. 해동 얼음에 -80 ° C 냉동고 장소에서 AAV의 분취 량을 제거합니다.
4. 얼음처럼 차가운 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 바이러스를 희석하여 주입을위한 바이러스 솔루션을 준비합니다. 전달 패턴의 초기 최적화를위한 10 배 용액을 희석 ^(10월 10일에서 10월 8일까지 바이러스 입자 / 반구)로 시작합니다.
5. 0.05 %의 최종 농도 AAV 용액에 트리 판 블루 (20X)를 추가한다.

4. 사출에 대한 신생아 새끼들까지 잔치를 준비

1. 냉각 얼음에 작은 알루미늄 판을 놓습니다. 건조 작업이 차가운 금속에서 강아지의 피부를 보호하기 위해 접시 위에 놓고 와이프. 이 새끼를 마취하고 주입하기위한 평면 차가운 표면 역할을합니다.
2. 따뜻한 전과 주사 후 신생아 쥐를 유지하기에 적합한 온난화 패드를 준비합니다.
3. 신생아 새끼가 간호사로 시작하면, 케이지에서 그 중 약 절반을 제거하고 자신의 어머니와 함께 나머지 절반을 둡니다. 주사를 기다리는 동안 온난화 패드에 수집 된 새끼를 놓습니다.
   참고 : 생물학적 어머니가 새끼를 돌보는하지 않는 경우, 즉시 케이지에서 전체 쓰레기를 제거하고 주입을 기다리고 온난화 패드에 새끼를 놓습니다. 이 상황은 C57BL / 6 여성이나 가난한 번식 특성이 다른 근친 변종으로 태어난 최초의 쓰레기가 발생할 수 있습니다. 이 상황에서, 우유 반점은 신생아 새끼에 표시되지 않습니다.
4. 저체온 마취를 유도하기 위해 차가운​​ 금속 접시에 온난화 패드에서 한 강아지를 전송합니다. 강아지가 완전히 마취가 될 때까지 2 ~ 3 분을 기다립니다. 아주 부드럽게 발을 압박하여 마취를 확인하고 이동이나 호흡의 부족을 모니터링 할 수 있습니다.

신생아 마우스로 AAV의 5 사출

1. 무료 손 신생아 쥐에 AAV의 두개 내 주사 :
   1. 로드 주입 주사기로 0.05 % 트리 판 블루 희석 AAV의 5 μL.
   2. 조심스럽게 70 % 에탄올에 적신 면봉으로 마취 된 강아지의 머리를 닦아냅니다.
   3. 각각의 눈에 람다 봉합까지의 거리의 2/5에서 주사 부위를 확인합니다. 다른 주사 부위는 약 0.8-1 mm 반 람다와 브레 그마 사이의 시상 봉합 및 측면에 위치해 있습니다. 이 랜드 마크는 P0에서 피부를 통해 볼 수 있습니다.
   4. 비 독성 실험 펜 주사 부위를 표시한다.
   5. 모니 볼 수 규모 주사기를 잡고용액의 부피를으로 모니터링하는 것은 분배.
   6. 엄지 플런저의 상단에 도달 할 수 있는지 확인합니다. 바이러스를 분배 실수 피하기 위해 바늘을 위치하면서 다음 플런저에서 엄지 손가락을 제거합니다.
   7. 얼음 통에 팔을 벤치에 팔꿈치를 넣고 기울고에 의해 주입을위한 팔을 지탱하기 편안한 위치를 찾습니다.
   8. 직접 주사기에서 머리와 옆에 강아지를 놓습니다. 표시된 주사 부위가 위를 향하도록 강아지의 머리를 돌려 조심스럽게 단단히 손바닥이 위치를 유지.
   9. 두개골의 표면에 수직 주사기를 잡고 약 3 mm의 깊이로 표시된 주사 부위에 주사 바늘을 삽입한다. 저항 바늘 뇌실에 침투되었음을 약간 감소 할 때까지 바늘을 주입한다. 기준이 필요한 경우, 비 독성 메이커와 바늘의 선단부로부터 3mm를 표시한다. 염료 t에 기초하여 크기 및 강아지 균주 주입 깊이를 조정심실의 argeting.
   10. 플런저가 뇌에 멀리 이동없이 바늘 함몰 될 수 있도록 주사기를 단단히 잡고. 주사를 시상으로 변위되면, 바이러스 확산이 심각하게 제한됩니다.
   11. 주사기에서 분배 된 볼륨을 모니터링하면서 천천히 바이러스를 주입 시작합니다. 각 심실에 2 μL의 최대 볼륨을 관리 할 수​​ 있습니다. 바늘이 정확한 위치에있는 경우, 염료는 심실을 채우기 위해 확산된다.
   12. 천천히 바늘을 철회.
   13. 첫번째 주사 부위가 다른 반구를 주입하기 전에 종료 할 수 있습니다.
       참고 : 여러 번 같은 사이트 더 주입하지 마십시오. 이미 누출 주입 강아지의 부상이나 사망의 원인이 된 바늘 힘 바이러스를 다시 삽입.
   14. 동일한 절차를 사용하여 반대쪽 뇌실 주입한다.
2. 신생아 쥐에 AAV의 정위 주사 :
   1. 0.05 % 트리 판 블루 정수로 희석 AAV의로드 5 μL정위 조작하는 사람에 의해 개최 주입 주사기 오.
   2. 조심스럽게 신생아 프레임의 귀 막대 사이 강아지의 머리를 놓습니다. 확실히 머리가 람다와 브레 그마 사이의 라인이 무대에 평행 한 것을 확인하여 Y 축에 레벨 (앞에서 뒤로) 확인하십시오. 확실히 머리가 귀, 또는 눈 사이에 선 사이의 상상 선이 무대에 평행 한 것을 확인하여 X 축에서 레벨 (측면 좌우로) 확인하십시오.
   3. 조심스럽게 70 % 에탄올에 적신 면봉으로 마취 된 강아지의 머리를 닦아냅니다.
   4. 람다 상기 주사기를 위치 정위 매니퓰레이터를 사용하고 X 및 Y 좌표를 제로. = (X, Y)에 정위 팔을 이동 (0.8, 1.5) 표준 P0 새끼에 대한 mm.
      참고 : 강아지의 크기와 정위 좌표 변형과 연령에 따라 다를 수 있습니다. 측면 심실을 대상으로 필요에 따라 염료 주사를 기반으로 좌표를 조정합니다.
   5. 천천히 주사 부위에 바늘을 낮 춥니 다. 두개골의 표면은 산업사합니다바늘이 피부에 침투되면 ENT는 다음 놓습니다. 두개골이 정상 오목 형상을 회복 할 때까지 바늘을 후퇴하지만 피부에서 바늘의 경사를 유지한다. Z는이 시점에서 조정 제로.
   6. Z = -1.7 mm까지 바늘을 삽입 한 후 -1.5 mm로 후퇴.
   7. 천천히 바이러스를 주입. 각 반구는 용액 2 μL를 받아 들일 수 있습니다.
   8. 주사를 완료 한 후 30 ~ 60 초 동안 제자리에 주사기를 유지하고 천천히 1-2 분에 걸쳐 바늘을 철회.
   9. 주사 부위에 대한 X-축의 음의 좌표를 사용하여, 반대쪽 반구 대해 반복.
      NOTE : 주사 대체 좌표는 (X, Y, Z) = (0.8, 2.0, -1.5) mm 및 (1.2, 1.0, -1.5) mm. (0.8, 2.0)에서 첫번째 주사를 수행 한 후 마지막으로 (0.8, -2.0), (1.2, 1.0) 및 (1.2, -1.0)로 이동합니다. 반구 당 2 ㎕의 총, 각 사이트에서 액 1 μl를 주입한다. 레의 절차를 완료하려면 주사를 신속하게 이동10 분 초 이상.

6 주입 후 케어

1. 남반구와 북반구 모두에 주사를 완료 한 후 정상 체온과 피부 색이 돌아올 때까지 온난화 패드에 강아지를 다시 배치하고 강아지가 움직이기 시작한다.
2. 주입 된 신생아를 간호하기 위해 생모를 사용하는 경우가 정상적인 움직임을 회복 한 후, 생물학적 어머니에게 주입 된 새끼를 반환합니다. 온난화 패드에 남아있는 uninjected 새끼를 놓습니다. 모든 쥐가 주입 될 때까지 절차를 반복합니다.
3. 주입 된 신생아를 간호하기 위해 수양 엄마를 사용하는 경우가 정상적인 움직임을 회복 한 후, 관리를위한 위탁 어머니에 삽입 된 모든 새끼를 전송합니다.
   1. 주입 된 동물의 성공을 보장하기 위해 대부분 또는 케이지에서 위탁 어머니에 속하는 새끼를 모두 제거합니다.
   2. 수양 어머니의 새끼와 주입 강아지 같은 눈과 피부 색깔이있는 경우가 될 수 있도록, 실험실 펜으로 위탁 어머니로부터 새끼를 표시나중에 구별.
   3. 수양 어머니의 새끼와 주입 된 새끼와 함께 자신의 침대의 일부를 놓습니다. 주입 된 새끼 새 새끼의 수용을 개선하기 위해 그녀의 생물학적 자손의 향기를 획득했는지 확인하십시오.
   4. 다시 위탁 어머니의 케이지에 만 주입 새끼를 놓습니다. 수양 어머니로부터 남아있는 새끼를 추려.
4. 어머니가 참석 케이지에 그들을 배치의 10 분 이내에 주입 된 새끼를 간호되어 있는지 확인합니다. 어머니가이 시간 내에 새끼를 수집하지 않는 경우, 다른 수양 어머니 새끼를 전송합니다.
5. 이 바이러스처럼 주입 동물을 포함 것을 보여주기 위해 생물 학적 카드 케이지를 레이블을 지정합니다. 주택의 72 시간 동안 승인 된 지역에서 케이지.
6. 72 시간 검역 기간이 끝나면 깨끗한 케이지에 어머니와 새끼 (하지만 침구 또는 다른 케이지 항목) 전송할 수 있습니다. 어떤 바이러스처럼 오염 된 침구에 대한 노출을 피해야 레벨이 바이오 안전성 캐비닛 내부의이 전송을 수행합니다. R일반 마우스 기능에 주입 된 동물과 깨끗한 케이지를 eturn.
7. , 생물 학적 가방에 더러운 케이지를 놓고 고압 증기 멸균 소독 한 다음 동식물 사육장에 케이지를 반환합니다.

7 정리

1. 나중에 사용하기 위해 4 ° C에서 나머지 바이러스 솔루션을 놓습니다. 4 ° C의 ^팔에 저장 될 때 바이러스는 최소 2 개월 동안 전달 효율을 유지합니다.
2. 탈 이온수 반복 헹굼 다음에 2 % 표백제 주사 바늘과 주사기를 소독.
3. 70 % 에탄올 다음에 2 % 표백제로 작업 영역을 청소합니다.
4. 플라스틱 생물 가방에 피펫 팁, 튜브, 마스크 및 장갑을 포함하여 모든 일회용 항목을 수집합니다. 현지 법 제도적 정책 (즉, 오토 클레이브 또는 소각)에 의해 필요에 따라 폐기물 처리하십시오.

8 이미징 마우스의 두뇌를 준비

1. 3에서 이산화탄소 안락사 챔버 내로 주입 된 마우스를 놓고사주 포스트 분사. 적절한 안락사 절차에 대한 제도적 지침을 따르십시오. 이 형광 라벨을 해소하므로 파라 포름 알데히드와 동물을 관류하지 마십시오.
2. 두개골에서 전체 뇌를 제거하고 4 ° C에서 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 3-12 시간 동안 수정.
3. cryoprotection에 30 % 자당에 고정 두뇌를 전송합니다. 뇌가 바닥에 침몰 할 때까지 4 ° C에서 품어.
4. 미세하게 분쇄 건조 얼음 양동이를 수집합니다. 중간 선 아래로 반으로 뇌를 잘라. 동결 건조 얼음에 뇌 반쪽을 묻어.
5. 드라이 아이스 및 100 % 에탄올을 첨가하여 마이크로톰 단 쿨.
6. PBS를 사용하여 아래로 중간 선으로 단계로 뇌를 고정하고, 고정 할 수 있습니다.
7. 동결 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 30 ~ 45 μm의 두께로 뇌을 통해 섹션.
8. 부동액 용액 (250 ㎖의 글리세롤, 300 ㎖의 에틸렌 글리콜을 500 ㎖의 0.1 M 포스페이트 완충액, pH를 7.4)를 함유하는 24 - 웰 플레이트에 도시 섹션. 커버 플레이트 위스콘신향후 사용을 위해 -20 ° C에서 제 깡통 호 및 저장.
9. 1-4 우물에서 섹션을 수집하고 PBS에서 배를 씻는다.
10. 현미경 슬라이드와 커버 슬립 위에 마운트 부분. 슬라이드가 어두운 장소에 건조 할 수 있습니다.
11. 기본 YFP 또는 tdTomato에 적합한 필터를 사용하여 이미지 슬라이드 바이러스 전달 패턴을 확인합니다.

결과

성공적인 뇌 실내 바이러스 감염 수익률 광범위하고 강력한 신경 식입니다. 여기에서 우리는 YFP 또는 닭 베타 액틴 프로모터 (CBA 프로모터)의 제어하에 tdTomato 형광 유전자를 사용하여 바이러스 전달을 평가 하였다. 이러한 구조는 AAV8에 패키지 및 신생아 (P0) ICR 마우스의 좌우 심실에 주입 하였다. 높은 바이러스 역가 (반구 당 10 ¹⁰ 입자) (왼쪽 그림 1A) 밀도 후각 망울의 라벨, ...

토론

우리는 신생아 마우스의 뇌에 널리 전달을위한 수단으로 AAV를 사용하여 신경 세포의 유전자 발현을 조작하기위한 다양한 절차를 설명했다. 이러한 자궁 일렉트로 ^일 또는 정위 두개 내 주사 ^2,3에서와 같이 신경 세포의 형질 전환의 다른 방법에 비해 신생아 바이러스 감염은 비교적 쉽고 간단합니다. 기본 절차는 얼음 양동이 및 마이크로 리터 주사기로 분에 수행 할 수 있습니다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR outbred mice	Harlan	Hsd:ICR (CD-1)	This strain is also known as CD-1
FVB inbred mice	The Jackson Laboratory	1800	5-6 weeks of age
Nestlets	Lab Supply	NESTLETS
Shepherd shacks	Lab Supply	SS-mouse
High fat rodent chow	Purina Mills	PicoLab Mouse diet 20, #5058	This is our standard breeder chow
High fat rodent chow (alternative)	Harlan Laboratories	Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S	If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed
Injection syringe	Hamilton	7653-01	10 ml syringe
Injection needles	Hamilton	7803-04, RN 6PK PT4, 0.375"	32 G, for standard P0 injections
Metal plate for cryoanesthesia	McMaster Carr	8975K439	Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop
Small animal stereotaxic device with digital readout	David Kopf Instruments	Model 940
Universal syringe holder with needle support foot	David Kopf Instruments	Model 1772-F1
Neonatal frame	Stoelting	51625	Officially called a mouse and neonatal rat adaptor
Biohazard disposal bags with sterile indicator	VWR	14220-030	Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal