הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

Summary

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Abstract

עם קצב התקדמות מדע בהאצה במהירות, שיטות חדשות יש צורך למדעי מוח ניסיוני לתמרן במהירות ובקלות ביטוי גנים במוח העכבר. כאן אנו מתארים טכניקה הוצגה לראשונה על ידי Passini ווולף למסירה תוך גולגולתי ישירה של transgenes באופן ויראלי בקידוד לתוך מוח העכבר בילוד. בצורתו הבסיסית ביותר שלה, ההליך דורש רק דלי קרח ומזרק microliter. עם זאת, הפרוטוקול יכול גם להיות מותאם לשימוש עם מסגרות stereotaxic כדי לשפר את העקביות לחוקרים חדשים לטכניקה. השיטה מסתמכת על יכולתו של נגיף Adeno הקשורים (AAV) לנוע בחופשיות מחדרי הלב המוחי לparenchyma המוח בזמן שבטנת ependymal היא עדיין לא בשלה במהלך 12-24 לשעה הראשונה שלאחר לידה. הזרקה תוך חדרים של AAV בתוצאות בגיל זה בתמרה נרחבת של תאי עצב במוח. ביטוי מתחיל בתוך ימים של הזרקה ונמשך lifetimדואר של בעלי החיים. כייל נגיף יכול להיות מותאם כדי לשלוט בצפיפות של נוירונים transduced, תוך שיתוף ביטוי של חלבון פלואורסצנטי מספק תווית חיונית של תאי transduced. עם הזמינות העולה של מתקני גרעין נגיפיים לספק חומרים כימיים שני, ארוזים מראש מחוץ למדף והכנה נגיפית מותאם אישית, גישה זו מציעה בזמן שיטה לטיפול בביטוי גנים במוח העכבר שהוא מהיר, קל, והרבה פחות יקר מ הנדסה בתאי מין מסורתית.

Introduction

שיטות מסורתיות לשינוי ביטוי גנים עצבי דורשות זמן רב ומניפולציות בתאי מין יקרות. אלטרנטיבי דה נובו גישות כגון electroporation ברחם או הזרקת lentiviral stereotaxic להניב תוצאות מהירות יותר ופחות יקרים, אבל יש לי החסרון של צורך בהתערבות כירורגית מורכבת ^1-3. יתר על כן, יש ביטוי transgene מגוון מרחבי מוגבל עם שיטות אלה. בזאת, אנו מתארים שיטה מהירה, קלה, וחסכונית למניפולציה עצבית נרחבת באמצעות הזרקה תוך חדרים של נגיף Adeno הקשורים (AAV) לתוך מוח העכבר בילוד. השיטה תוארה לראשונה על ידי ג'ון וולף ומרקו Passini ב2001, שבו הם הציעו גודל חלקיקים קטן של AAV אפשר לה לפזר בתוך נוזל השדרה מוחין כשהוא עובר מחדרים לרוחב דרך מחסום ependymal לא בשלה ולתוך parenchyma המוח ^{4, 5.} הזרקה תוך חדרים של AAV בתוך first 24 שעות לאחר תשואות לידת התמרה ויראלית נרחבת של תת עצביים הכולל את כל אזור של המוח, מנורות חוש הריח לגזע המוח ^6,7. transgenes נמסר-באופן ויראלי בא לידי ביטוי ופעיל בתוך ימים של הזרקה ולהימשך עד שנה לאחר התמרה. לפיכך, מניפולציה תכליתית זה מאפשרת לימודים החל מהתפתחות המוח לאחר לידה מוקדמת להזדקנות וניוון במבוגרים.

בהתאמת הטכניקה לצרכי הניסוי הספציפי שלנו, יש לנו התמקדנו בעיקר בserotype AAV8 כי זה הוא יעיל ביותר בtransducing תאי עצב ^6. אנו מראים כי כייל נגיף יכול להיות מדוללים כדי לשלוט בצפיפות של נוירונים transduced להשלכות תא פנימי לבדיקת ניסויים של מניפולציה גנטית. בנוסף, אנו מראים כי שני וירוסים יכולים להיות שותף הזריקו לייצר דפוסי ביטוי שמוטים כלפי קבוצות שונות או חופפות של תאי עצב, בהתאם לזנים אל נבחרו לאריזת ויראלי. העבודה שלנו מרחיבה את הרבגוניות של טכניקה זו לשימוש במגוון רחב של הגדרות מדעי מוח ניסיוני.

Protocol

לבצע את כל הנהלים והפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים בהתאם למכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחי מעבדה. הנהלים שתוארו כאן היו נבדקו ואושרו על ידי המכללה ביילור לרפואה מוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

וקטורי שכפול פסול וירוס adeno הקשורים (AAV) למסירת transgene במוח המכרסם אושרו לשימוש רמת הבטיחות ביולוגית 1. עיין באתר האינטרנט של CDC לפרסום של ממשלת ארה"ב "בטיחות הביולוגית במיקרוביולוגיה וביו רפואית מעבדות (BMBL)" בו הוא מפרט את דרישות ספציפיות לגבי נהלי הגנה וטיפול וירוס נכונים. בדוק עם צוות בטיחות וטרינרים וסביבתית מקומי כדי ללמוד על דרישות ספציפיות מוסדיות לנוהלי שימוש בוירוסים. תקנות הנוגעים לחדרי הליך, סגר, וזיהוי של כלובי Biohazard להשתנות על פני מוסדות.

.1 טרוםלקלף גורי P0 ופוסטר אמהות

1. לספק אוכל עתיר שומן לכל נשים בהריון והנקה כדי לתמוך בדרישות האנרגיה של רבייה והנקה.
2. בערב, הקים כלוב רבייה על ידי הוספת נקבות אחד או שתיים בריאים לכלוב של זכר תושב בודד. למחרת בבוקר, לבדוק את הנקבות לתקע הזדווגות ולהפריד את הנקבות מהזכרים אם תקע הוא הווה.
   1. השתמש אמהות אומנה להעלות גורים מרקע גנטי עם מאפיינים אימהיים עלובים (למשל, C57BL / 6 או C3HeJ). אמהות פוסטר קיבלו גורים מהמלטה אחרת אם הגורים הועברו נולדים בתוך ארבעה ימים מההמלטה של ​​של אמו המאמצת.
   2. הגדר את כלוב הזדווגות נפרד באמצעות ICR או נקבות FVB לצד המגדלים הניסיוניים, כך ששתי קבוצות של נקבות לספק בערך באותו הזמן.
3. נקבות תספק ב19 ± 1 ימים מיום התקע, בהתאם לזן הרקע. שלושה ימים לפני דelivery (16 ימים לאחר מועד התקע), הנח את הנקבה בהריון לכלוב נקי עם חומר קינון טרי ומקלט מכוסה.
4. הגעה לגורים שזה עתה נולד, פעמים ביום החל 2 ימים לפני מועד המסירה הצפוי (17 ימים לאחר מועד התקע). לבחון את הכלוב עם לחץ מינימאלי לאמהות על ידי מציץ דרך תחתון לנוכחות של תינוקות הוורודים. עכברים בדרך כלל למסור גורים בבוקר אבל במקרים נדירים יהיה לספק בשעתי אחר הצהריים.
5. מתכוון לבצע זריקות בהקדם הגורים מניקים (שיהיה ברור על ידי כתמים נראים לעין חלב), או תוך 6 שעות של לידה, לפי המוקדם מביניהם.

.2 הכינו ציוד להזרקה

1. הכן מזרק הזרקה 10 μl עם מחט 32 G לילודי P0 כלליים. אם ביצוע הזרקת stereotaxic, הר המזרק על זרוע מניפולטור.
2. אם אתם משתמשים במסגרת stereotaxic לזריקות, לקרר את שלב היילודים ל4-8 ° C על ידי הוספה איתן 100% ol וקרח יבש למאגר בקצה הקדמי של הבלוק. שמור על הטמפרטורה מעל 1 ° C כדי למנוע כוויות קור של הגורים.

.3 להכין דילולי ויראלי להזרקה

1. הכן פתרון 1% trypan כחול צבע (20x מלאי).
2. הכן 5-25 aliquots μl של מניית adeno הקשורים הווירוס (AAV) בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class 2. הנח aliquots אלה ב-80 ° C לשימוש עתידי. הימנע להקפיא להפשיר מחזורים נוספים כמו זה גורם וירוס לאבד יעילות התמרה.
3. הסר aliquot של AAV מ-80 ° C המקפיא ומניחים על קרח להפשיר.
4. הכן את הפתרון הנגיפי להזרקה על ידי דילול הווירוס לתוך מלוח פוספט 1x קר כקרח סליין (PBS). התחל עם דילול של פי עשרה סדרתי ⁽¹⁰ אוקטובר - ^{8 אוקטובר} חלקיקים נגיפיים / חצי הכדור) לאופטימיזציה ראשונית של דפוס התמרה.
5. להוסיף 20x trypan כחול לפתרון AAV לריכוז סופי של 0.05%.

class = "jove_title"> 4. Staging יילוד הגורים להזרקה

1. מניחים צלחת אלומיניום קטנה על קרח כדי לקרר. הנח משימה יבשה לנגב על גבי הצלחת כדי להגן על העור של הגור מהמתכת הקרה. זה משמש כמשטח קר להרדמה והזרקת הגורים.
2. הכן כרית חימום המתאימים לשמירה על עכברים בילוד חם לפני ואחרי ההזרקה.
3. ברגע שהגורים שזה עתה נולדו החלו אחות, להסיר כמחצית מהם מהכלוב ולהשאיר את החצי השני עם אמם. הנח את הגורים נאספו על כרית החימום בזמן שממתין להזרקה.
   הערה: אם אמו הביולוגית לא אכפת לגורים, להסיר את כל הלכלוך מהכלוב מייד ולמקם את הגורים על כרית חימום למחכה הזרקה. מצב זה יכול לנבוע עם ההמלטה הראשונה נולדה לC57BL / 6 נקבות או עם זנים טהורים אחרים שיש להן מאפייני גידול עניים. במצב זה, כתמי חלב לא יהיו גלויים בגורים שזה עתה נולד.
4. העבר את גור אחד מכרית החימום על פלטת המתכת הקרה כדי לגרום להרדמת היפותרמיה. חכה 2-3 דקות לגור ללהיות בהרדמה מלאה. לאשר הרדמה על ידי מאוד לוחץ בעדינות את כף רגל ולפקח על חוסר תנועה או נשימה.

.5 הזרקה של AAV לעכברים בילוד

1. ביד חופשית בהזרקה תוך גולגולתי של AAV לעכברים בילוד:
   1. עומס 5 μl של AAV המדולל עם 0.05% trypan הכחולים לתוך המזרק להזרקה.
   2. נגב בעדינות את ראשו של הגור בהרדמה עם קיסם אוזניים הטבולים ב70% אתנול.
   3. זהה את אתרי ההזרקה ב2/5 של המרחק מהתפר למבדה לכל עין. אתר הזרקה חלופי ממוקם כ .8-1 מ"מ לרוחב מתפר sagittal, באמצע הדרך בין למבדה וגבחת. ציוני דרך אלו הם גלויים דרך העור בP0.
   4. סמן את אתר ההזרקה עם עט מעבדה שאינה רעיל.
   5. החזק את המזרק עם בקנה מידה גלויה למוניםtoring הנפח של פתרון לוותר.
   6. ודא שהאגודל יכול להגיע לראש הבוכנה. ואז להסיר את האגודל מהבוכנה תוך מיצוב המחט, כדי למנוע טעות מחלק וירוס.
   7. מצא את התנוחה נוחה לקיבוע שעל ידי לשים את המרפק על הספסל ונשען על זרוע דלי קרח הזרוע להזרקה.
   8. הנח את הגור בצד שלה עם הראש שלה ישירות תחת המזרק. הפעל את ראשו של הגור, כך שהזריקה הניכרת פונה כלפי מעלה, ובעדינות אך בתקיפות להחזיק בעמדה זו עם יד פתוחה.
   9. החזק את המזרק בניצב לפני השטח של הגולגולת ולהכניס את המחט במקום ההזרקה הניכרת עד לעומק של כ 3 מ"מ. הזרק את המחט עד להתנגדות יורדת מעט, מצביע על כך שהמחט חדרה לתוך החדר לרוחב. אם יש צורך בהתייחסות, לסמן 3 מ"מ מקצה המחט עם יצרנית שאינה רעילה. לכוונן את עומק ההזרקה לגודל גור ומתח המבוסס על t הצבעargeting של החדרים.
   10. החזק את המזרק נוקשה כך שהבוכנה יכולה להיות מדוכאת מבלי להזיז את המחט יותר אל תוך המוח. אם הזריקה היא עקורה לתלמוס, התפשטות נגיפית תהיה מוגבלת באופן חמור.
   11. בגין הזרקה לאט וירוס תוך מעקב הנפח להימכר המזרק. לנהל נפח מרבי של 2 μl לתוך כל חדר. אם המחט היא במיקום הנכון, הצבע יתפשט כדי למלא את החדר.
   12. לאט לאט למשוך את המחט.
   13. תאפשר לאתר הזריקה הראשון כדי לסגור לפני הזרקת חץ הכדור השני.
       הערה: אין להזריק באותו האתר יותר מפעם אחת. הכנסה מחדש של וירוס כוחות המחט שכבר הזריק לדלוף החוצה וגורם לפציעה או מוות של הגור.
   14. הזרק החדר הנגדי באותו האופן.
2. הזרקת Stereotaxic של AAV לעכברים בילוד:
   1. μl 5 העומס של AAV המדולל עם 0.05% int trypan הכחולo מזרק הזריקה שנערך על ידי מניפולטור stereotaxic.
   2. מניח בעדינות את ראשו של הגור בין סורגי האוזן של המסגרת בילוד. ודא הראש הוא רמה בציר Y (מלפנים לאחור) על ידי בדיקה כי הקו בין מבדה וגבחת הוא במקביל לבמה. ודא הראש הוא רמה בציר X (צד לצד) על ידי בדיקת ששורה דמיינה בין האוזניים, או קו בין העיניים, היא במקביל לבמה.
   3. נגב בעדינות את ראשו של הגור בהרדמה עם קיסם אוזניים הטבולים ב70% אתנול.
   4. השתמש מניפולטור stereotaxic כדי למקם את המזרק מעל למבדה ולאחר מכן לאפס את X וקואורדינטות Y. הזז את זרועות stereotaxic ל( X, Y) = (0.8, 1.5) מ"מ לגורי P0 סטנדרטיים.
      הערה: גודל גור וקואורדינטות stereotaxic עשוי להשתנות מזן וגיל. התאם קואורדינטות המבוססות על הזרקת צבע לפי צורך למקד את החדרים לרוחב.
   5. לאט לאט להוריד את המחט לתוך אתר ההזרקה. פני השטח של הגולגולת indאף אוזן גרון ולאחר מכן שחרר פעם אחת את המחט חדרה את העור. לחזור בו מהמחט עד הגולגולת משחזרת צורה הקעורה הרגילה שלו, אבל לשמור את השיפוע של המחט מתחת לעור. אפס Z לתאם בשלב זה.
   6. הכנס את המחט עד Z = -1.7 מ"מ ולאחר מכן לחזור ל-1.5 מ"מ.
   7. לאט לאט להזריק את הווירוס. כל חצי הכדור יכול לקבל עד 2 μl של פתרון.
   8. שמור את המזרק במקום 30-60 שניות לאחר שסיים את ההזרקה ולאחר מכן לחזור לאט את המחט על 1-2 דק '.
   9. חזור על פעולה עבור חצי הכדור הנגדי, תוך שימוש בקואורדינטות שליליות בציר X לאתר ההזרקה.
      הערה: קואורדינטות אלטרנטיביות להזרקה הן (X, Y, Z) = מ"מ (0.8, 2.0, -1.5) ומ"מ (1.2, 1.0, -1.5). לבצע את הזריקה הראשונה ב( 0.8, 2.0), ולאחר מכן לעבור ל( 0.8, -2.0), (1.2, 1.0) ולבסוף (1.2, -1.0). הזרק 1 μl של פתרון בכל אתר, עבור הסכום כולל של 2 μl לחץ כדור. לנוע במהירות בין זריקות כדי להשלים את ההליך בlesים מ -10 דקות.

הזרקת ההודעה Care .6

1. לאחר שסיים את הזריקות לשני חצאים הכדור, הנח את הגור בחזרה על כרית החימום עד לחזרת צבע טמפרטורת גוף ועור שלה לקדמותו ואת הגור מתחיל לנוע.
2. אם אתם משתמשים באמו הביולוגית להניק תינוקות המוזרקים, להחזיר את הגורים הזריקו לאמו הביולוגית לאחר שיתאוששו תנועה נורמלית. הנח את גורי uninjected שנותרו על כרית החימום. חזור על התהליך עד שכל העכברים כבר הזריק.
3. אם אתם משתמשים באמא מאמצת להניק תינוקות המוזרקים, להעביר את כל הגורים שהוחדרו לאמו מאמצת לטיפול אחרי שהם יתאוששו תנועה נורמלית.
   1. להסיר את רוב או את כל הגורים השייכים לאמו מאמצת מהכלוב כדי להבטיח את הצלחת של בעלי החיים שהוזרקו.
   2. אם יש לי הגורים של אמו מאמצת וגורים הזריקו את אותו צבע עיניים ועור, לסמן גורים מאמו המאמצת עם עט מעבדה, כך שניתן יהיהלהבדיל מאוחר יותר.
   3. הנח גורים של אמו המאמצת וחלק מהמצעים שלהם יחד עם הגורים המוזרקים. ודא שהגורים הזריקו לרכוש את הריח של צאצאיה הביולוגיים כדי לשפר את הקבלה של הגורים החדשים.
   4. המקום היחיד גורים מוזרקים חזרה לכלוב של אמו המאמצת. לברור כל גורים שנותרו מאמו המאמצת.
4. ודא שהאם היא השתתפות ולהנקת הגורים המוזרקים בתוך 10 דקות של הצבת אותם לכלוב. אם האמא לא תאסוף את הגורים בתוך הזמן הזה, להעביר את גורים למשנהו אמו מאמצת.
5. תווית הכלוב עם כרטיס Biohazard להראות שהוא מכיל בעלי חיים באופן ויראלי מוזרקים. בית הכלוב באזור שאושר ל72 שעה.
6. לאחר תקופת הסגר 72 שעה, להעביר את האמא וגורים (אך לא במצעים או פריטי כלוב אחרים) לכלוב נקי. לבצע העברה זו בתוך ארון 2 רמת בטיחות ביולוגית, כדי למנוע חשיפה לכל מצעים באופן ויראלי מזוהמים. Rזור הכלוב הנקי עם בעלי החיים שהוזרקו למתקן העכבר הרגיל.
7. מניחים את הכלוב המלוכלך לתוך שקית Biohazard, לעקר ידי מעוקר, ולאחר מכן להחזיר את הכלוב לביבר.

.7 ניקוי

1. מניחים את פתרון הווירוס שנותר על 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. הווירוס שומר יעילות התמרה לפחות 2 חודשים, כאשר הם מאוחסנים ב 4 ° C. ^8.
2. לחטא את מחט הזריקה ומזרק עם אקונומיקה 2% ואחרי שטיפות חוזרות ונשנות במים ללא יונים.
3. נקה את אזור העבודה עם אקונומיקה 2% ואחרי 70% אתנול.
4. לאסוף את כל הפריטים חד פעמים, כולל טיפים פיפטה, צינורות, מסכה, וכפפות בשקית Biohazard פלסטיק. השלך חומרי פסולת כנדרש על פי דין המקומי ובמדיניות מוסדית (כלומר החיטוי או לשרוף).

.8 הכינו מוח עכבר הדמיה

1. הנח עכבר מוזרק לתוך תא המתת חסד פחמן דו חמצני ב34 שבועות לאחר הזרקה. פעל לפי הנחיות מוסדיות לנוהלי המתת חסד ראויים. אל תנקבו בעלי חיים עם paraformaldehyde כמו זה יהיה להרוות את תווית הקרינה.
2. הסר את המוח כולו מהגולגולת ולתקן ל3-12 שעות ב4 paraformaldehyde% PBS על 4 מעלות צלזיוס.
3. העבר את המוח הקבוע לסוכרוז 30% לcryoprotection. דגירה על 4 מעלות צלזיוס עד למוח כיורים לתחתית.
4. לאסוף דלי של קרח יבש כתוש דק. חותך את המוח במחצית את קו האמצע. לקבור את החצאים המוח בקרח היבש להקפאה.
5. לקרר את שלב microtome על ידי הוספת קרח יבש ו100% אתנול.
6. אבטח את המוח לבמה עם קו האמצע למטה באמצעות PBS, ולאפשר להקפאה.
7. סעיף דרך המוח ב30-45 עובי מיקרומטר באמצעות microtome זזת הקפאה.
8. סעיפי מקום ל24 גם צלחות המכילות פתרון נוזל לרדיאטור (250 מ"ל גליצרול, 300 גליקול מ"ל אתילן, 500 מ"ל 0.1 M חיץ פוספט, pH 7.4). wi אטמירדיד ה הפח ולאחסן ב C ° -20 לשימוש עתידי.
9. לאסוף חלקי 1-4 בארות ולשטוף 3x ב PBS.
10. חלקי הר על גבי שקופיות מיקרוסקופ וcoverslip. לאפשר שקופיות לייבוש במיקום חשוך.
11. שקופיות תמונה באמצעות מסננים מתאימים לYFP יליד או tdTomato כדי לבדוק את דפוס התמרה וירוס.

תוצאות

תשואות מוצלחות תוך חדרי הזרקה נגיפית ביטוי עצבי נרחב וחזק. כאן אנו הערכנו התמרה ויראלית באמצעות YFP או tdTomato גני ניאון תחת השליטה של ​​אמרגן אקטין בטא עוף (אמרגן CBA). מבנים אלה היו ארוזים לAAV8 ומוזרקים לתוך החדרים לרוחב של עכברים בילוד (P0) ICR. titers הנגיפי גבוה (10 ¹⁰ חלקי...

Discussion

שתארנו הליך תכליתי עבור המניפולציה ביטוי גנים עצבי באמצעות AAV ככלי למסירה נרחבת למוח העכבר בילוד. בהשוואה לשיטות אחרות של transgenesis העצבי כגון electroporation ברחם ¹ או הזרקה תוך גולגולתי stereotaxic ^2,3, הזרקה נגיפית בילוד היא קלה ופשוט יחסית. ההליך הבסיסי יכול להתבצע בתו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR outbred mice	Harlan	Hsd:ICR (CD-1)	This strain is also known as CD-1
FVB inbred mice	The Jackson Laboratory	1800	5-6 weeks of age
Nestlets	Lab Supply	NESTLETS
Shepherd shacks	Lab Supply	SS-mouse
High fat rodent chow	Purina Mills	PicoLab Mouse diet 20, #5058	This is our standard breeder chow
High fat rodent chow (alternative)	Harlan Laboratories	Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S	If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed
Injection syringe	Hamilton	7653-01	10 ml syringe
Injection needles	Hamilton	7803-04, RN 6PK PT4, 0.375"	32 G, for standard P0 injections
Metal plate for cryoanesthesia	McMaster Carr	8975K439	Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop
Small animal stereotaxic device with digital readout	David Kopf Instruments	Model 940
Universal syringe holder with needle support foot	David Kopf Instruments	Model 1772-F1
Neonatal frame	Stoelting	51625	Officially called a mouse and neonatal rat adaptor
Biohazard disposal bags with sterile indicator	VWR	14220-030	Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal