Humano madre pluripotentes células Basado Toxicidad para el desarrollo de ensayos de la seguridad química Detección y biología de sistemas de generación de datos

Resumen

Los protocolos describen dos sistemas in vitro en las pruebas de toxicidad del desarrollo (UKK y UKN1) basado en células madre embrionarias humanas y estudios transcriptoma. Los sistemas de pruebas predicen riesgo de toxicidad para el desarrollo humano, y pueden contribuir a reducir los estudios en animales, los costos y el tiempo requerido para las pruebas de seguridad química.

Resumen

Protocolos eficientes para diferenciar células madre pluripotentes humanas a diversos tejidos en combinación con las tecnologías ómicas abrieron nuevos horizontes para las pruebas de toxicidad in vitro en las drogas potenciales. Para proporcionar una base científica sólida para este tipo de ensayos, será importante para obtener información cuantitativa sobre la evolución en el tiempo de desarrollo y sobre los mecanismos reguladores subyacentes de enfoques de biología de sistemas. Por lo tanto, dos ensayos se han sintonizado aquí por estos requisitos. En el sistema de prueba UKK, las células madre embrionarias humanas (células madre) (u otras células pluripotentes) se dejan a diferenciar de forma espontánea durante 14 días en cuerpos embrioides, para permitir la generación de las células de las tres capas germinales. Este sistema recapitula pasos clave del desarrollo temprano de embriones humanos, y puede predecir la toxicidad embrionaria temprana / teratogenicidad humano específico, si las células están expuestas a productos químicos durante la diferenciación. El sistema de prueba UKN1 se basa en la diferenciación de células madre a un population progenitor de neuroectodérmico (NEP) las células durante 6 días. Este sistema recapitula el desarrollo neuronal temprana y predice neurotoxicidad del desarrollo temprano y cambios epigenéticos provocadas por productos químicos. Ambos sistemas, en combinación con estudios de microarrays transcriptoma, son adecuados para la identificación de biomarcadores de toxicidad. Además, pueden ser utilizados en combinación para generar datos de entrada para el análisis de la biología de sistemas. Estos sistemas de prueba tienen ventajas sobre los estudios toxicológicos tradicionales que requieren grandes cantidades de animales. Los sistemas de pruebas pueden contribuir a una reducción de los costos de desarrollo de fármacos y la evaluación de la seguridad química. Su combinación arroja luz sobre todo en los compuestos que pueden influir en el desarrollo neurológico en concreto.

Introducción

La capacidad de las células madre embrionarias humanas (hESC) de diferenciarse en varios tipos de células se abrió una nueva era de las pruebas de toxicidad in vitro ^1, el modelado de la enfermedad y la medicina regenerativa ^2. Las células madre están dotados de la capacidad de auto-replicarse, para mantener su estado pluripotente, y para diferenciarse en células especializadas ^3,4. Las propiedades de células madre (capacidad para diferenciar a todos los principales tipos de células) se encuentran también en otras células madre pluripotentes humanas, tales como células inducidas humanas pluripotenciales (hiPSC) o células generadas por transferencia nuclear ^5. Por ejemplo, muchas diferentes líneas de células madre se han diferenciado en neuronas, células renales ^{6 7,} las células de la cresta neural ^{8, 9-12} cardiomiocitos, o hepatocitos como las células ^13,14. Por otra parte, células madre puede diferenciar de forma espontánea en las células de las tres capas germinales ^15-18 en cuerpos embrioides (EBS) ^19,20. Edesarrollo embrionario arly está regulada por la expresión diferencial de diversos genes relacionados con las diferentes capas germinales que ha sido capturado en el nivel de ARNm por transcriptómica utilizando la tecnología de microarrays ^15. Estos esfuerzos dieron como resultado el establecimiento de modelos toxicológicos específicos de órganos basados ​​en células madre / hiPSC y análisis transcriptómica (para revisión ver ^21,22). Estos modelos tienen ventajas sobre el uso tradicional de los animales de laboratorio para estudios toxicológicos, como estudios preclínicos utilizando animales de laboratorio no siempre son predictivos de la seguridad de las personas. Las toxicidades inducidas por las drogas encontradas en los pacientes suelen estar relacionados con los procesos metabólicos o de señalización que difieren entre humanos y animales de experimentación. La diferencia especie ha impedido la detección temprana fiable de toxicidad para el desarrollo en los seres humanos, y para los medicamentos de instancia como la talidomida y el dietilestilbestrol ^{23,24 25,26} fueron retirados del mercado debido a la teratogenicidad. ThaliDomide no ha demostrado ninguna toxicidad para el desarrollo en las ratas o ratones. Productos químicos ambientales como metil mercurio ²⁷ resultaron en toxicidad para el desarrollo prenatal con respecto al sistema nervioso en varias especies, pero las manifestaciones humanas han sido difíciles de modelar en animales. Para abordar el problema de las cuestiones de especificidad de especie, los científicos que trabajan en diferentes proyectos basados ​​en células madre como ReProTect, ESNATS, DETECTIVE etc., están comprometidos en el desarrollo de diferentes modelos de toxicidad embrionaria, neurotoxicidad, cardiotoxicidad, hepatotoxicidad y nefrotoxicidad utilizando sustancias tóxicas humanos sospechosos de afectar a los humanos. En el marco del proyecto de consorcio europeo 'Embryonic Novel Alternativo de Prueba Estrategias basadas en células madre (ESNATS)' cinco sistemas de prueba se han establecido. Un sistema de prueba de la llamada UKK (niversitäts k linikum K OLN U) sistema de prueba capta parcialmente desarrollo temprano de embriones humanos. En este sistema células H9 embrionarias humanas se diferencian en tres capas germinales (ectodermo, endodermo y mesodermo) ¹⁵ y la capa de germen de firmas específicas han sido capturados por la transcriptómica perfil utilizando la plataforma de microarrays de Affymetrix. Varios tóxicos del desarrollo como la talidomida ^28, ácido valproico, metil mercurio ^16,17, o citosina arabinósido ¹⁵ se han probado en este sistema, y se han obtenido tóxica específica de firmas de genes. En un segundo sistema de ensayo, el llamado el (niversity U de K onsta n z) UKN1 sistema de prueba 1, las células H9 se diferencian a células progenitoras neuroectodérmico (NEP) durante 6 días. Prueba de ello es la alta expresión de genes marcadores neuronales como PAX6 y OTX2. Durante la diferenciación durante 6 días, las células NEP han estado expuestos a neuro-tóxicos del desarrollo tales como VPA, el mercurio de metilo. Perfiles específicos Tóxico-de-regulada transcriptómica han sido obtedefine así mediante el uso de la plataforma de microarrays de Affymetrix ^16,29.

La nueva visión de la toxicología del siglo ²¹ prevé que los sistemas de pruebas no sólo se dan descripciones fenotípicas como histopatología en vivo, o cambios transcriptoma al final de las incubaciones de tóxico a largo plazo. Más bien sugiere que los ensayos proporcionan información mecanicista ^3, y que esta información se pueden asignar a las llamadas vías de resultados adversos (AOP) que proporcionan una justificación científica para efectos peligrosos ^30. Para proporcionar dicha información, los sistemas de ensayo aplicados tienen que ser altamente calidad controlada ^31, como por ejemplo documentado por los procedimientos de operación estándar robustos. Por otra parte, los cambios dependientes del tiempo necesitan ser asignada con alta resolución. Esto requiere que los sistemas de ensayo con cambios sincronizados ^32. Los sistemas de prueba UKN1 y UKK aquí descritos han sido optimizados para estos requisitos.

Protocolo

El siguiente protocolo se realizó usando la línea de células madre embrionarias humanas (CMEH) H9. Esta línea celular se cultivaron de forma rutinaria en fibroblastos de ratón mitóticamente inactivadas embrionarias (MEFs) en medios de cultivo suplementados con células madre bFGF y luego cultivadas en medios de células madre en placas de Petri de 6 cm recubiertas con matriz de membrana basal, como Matrigel, para deshacerse de MEFs. Las células H9 de> 80% en placas confluentes se utilizaron para su posterior aprobación. Células H9 cultivadas en placas de matriz de la membrana basal se utilizaron para la formación de EBs. Todos los procedimientos mencionados en el siguiente protocolo se han realizado utilizando métodos estándar para las prácticas de cultivo de células de asepsia y buenas.

Parte 1. Sistema de prueba UKK

1. Embrionarias Humanas Cultivo de Células Madre

1. La división y el mantenimiento de H9 de células alimentadoras
   1. Pipetear 2 ml de 0,1% de gelatina en cada placa de 6 cm y se incuba durante 30 minutos en un cultivo celular incubator (37 ° C y 5% de CO _2). Solución de gelatina Aspirar con pipeta Pasteur estéril.
   2. Añadir 2 ml de medio MEF que contiene 0,1 x 10 ⁶ células / ml MEF en las dos placas recubiertos con gelatina y se incuba en la incubadora de cultivo celular (37 ° C y 5% de CO ₂₎ O / N.
   3. El día siguiente, eliminar las células H9 frasco del tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido utilizando fórceps y descongelar el vial en un 37 ° C baño de agua con unas pinzas largas.
   4. Sacar la cubeta del baño de agua, baño con etanol al 70%, secar al aire en la cabina de bioseguridad de 15 a 30 segundos y transferir las células a 15 ml tubo Falcon.
   5. Añadir 9 ml de medio de cultivo H9 lentamente en la pared interior y centrifugar las células a 200 xg durante 5 min.
   6. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en medio de cultivo que contiene 6 ml inhibidor ROCA (10 m, Y27632) y suavemente pipeta para mezclar. Aspirar medio MEF de la placa de 6 cm y añadir 3 ml de suspensión de células en cada placa. Cambie el medio de day 3 y luego cada dos días. Subcultivo> 80% confluente células de la placa con relación de división 1: 3.
      Nota: Por lo general, en 5 a 7 días la placa se vuelve confluente. Alimentadores utilizadas se obtuvieron a partir de ratones CF1 embrión y inactivados por exposición a la radiación γ.
2. El cultivo de células H9 en placas de matriz de membrana basal recubiertas
   1. Medio de células madre Deshielo (5x) Suplemento a temperatura ambiente y añadir 100 ml en 400 ml de medio basal en cabina de bioseguridad.
   2. Matriz de membrana basal Deshielo en hielo. Añadir el volumen recomendado de matriz de membrana basal (consulte certificado de análisis para cada lote) en 24 ml enfriado DMEM / F-12 medio basal durante doce 6 cm placas. Mezclar pipeteando arriba y abajo.
   3. Añadir 2 ml en cada placa de 6 cm. Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 1 hr. Retire el medio y añadir 2 ml de medio de células madre.
   4. Saque cuatro placas H9 confluentes en MEFs. Retire las colonias diferenciadas con punta de la pipeta 1 ml bajo microscopio estereoscópico mantienen en cabina de bioseguridad.
   5. Aspiradoel medio y lavar las células con 4 ml de PBS y añadir 2 ml de medio de células madre en cada plato. Cortar las colonias indiferenciadas con 26 G aguja en al 6-9 piezas cada uno.
   6. Recoger suavemente las células en 50 ml tubo Falcon. Centrifugar a 200 xg durante 5 min.
   7. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender en 12 ml de medio de células madre. Cuente los grumos al poner 20 l en portaobjetos de vidrio bajo el microscopio y ajustar el volumen de 150 matas por ml. Añadir 2 ml de suspensión en cada placa de 6 cm.
   8. Mover las placas de ida y vuelta y los movimientos de lado a lado para la distribución macizo uniformes e incubar las placas en la incubadora de cultivo celular (37 ° C y 5% de CO _2).
   9. Retire las colonias diferenciadas y dar a cambio de medio cada dos días.

2. Cuerpos embrioides (EBS) Formación

Realizar todos los procedimientos mencionados a continuación según precauciones asépticas y en el gabinete de bioseguridad.

1. Día 0 & #8212; Revestimiento de células H9 en placas de fondo en V
   1. Preparar copolímero de bloque 5%, tal como Pluronic F 127 en PBS y se filtra a través de vacío del sistema de filtración que utilizan un 0,22 micras filtro estéril.
   2. Escudo V placas de 96 pocillos de fondo con 40 l de 5% de copolímero de bloque por pocillo e incubar a TA durante 45 min.
   3. Retire los sótanos confluentes placas de matriz de membrana con células H9 de la incubadora y retirar las colonias diferenciadas con punta de pipeta de 1 ml bajo microscopio estereoscópico en cabina de bioseguridad.
   4. Aspirar el medio y lavar las células con 4 ml de PBS. Añadir 2 ml de medio de diferenciación aleatorio (medio de cultivo H9 sin bFGF, mediano RD) en cada plato. Utilice la herramienta de paso y cortar las colonias de células H9 en grupos de tamaño y forma uniforme mediante la observación bajo microscopio estereoscópico en cabina de bioseguridad y luego raspar suavemente con el rascador de células.
   5. Recoge las matas en 50 ml tubo Falcon y centrifugar a 200 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el cell en medio RD para obtener grumos 1000 por ml.
   6. Aspirar el copolímero de bloque de placas de fondo V. Vierta los grumos en placa cuadrada estéril y con ayuda de una pipeta multicanal añadir 100 l de suspensión a cada pocillo de V placa inferior.
   7. Para la fuerza de agregación de grumos, centrifugar las placas de fondo V a 4 ° C durante 4 min a 400 x g. Incubar las placas en la incubadora de cultivo celular (37 ° C y 5% de CO ₂₎ durante cuatro días.
2. Día 4 - Colección de EBS
   1. Recoge los EBS en la placa cuadrada estéril de placas de fondo V utilizando una pipeta multicanal y ancho calibre 200 l consejos.
   2. Recoge los EBs de placa cuadrada estéril a 15 ml tubo Falcon de 10 ml pipeta serológica estéril. Permitir que EBS se asienten durante 2 min. Aspirar el sobrenadante y lavar las EBs con 5 ml de PBS.
   3. Permitir que EBS se asienten durante 2 minutos y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender EBS en medio de 5 ml RD.
   4. Pipetear a cabo medio RD 10 ml en 10 cmplacas bacteriológicas. La transferencia de los EBS en placas bacteriológicas 10 cm.
   5. Incubar las placas bacteriológicas en un agitador horizontal (movimiento de vaivén 50 / min) mantenidos en incubadora de cultivo celular (37 ° C y 5% de CO ₂₎ para el período de tiempo necesario. Dé cambio de medio (15 ml de medio RD) en días alternos.
      Nota: Se requiere un manejo suave, mientras que el cultivo de hESCs. El tamaño de EBS varía en día 4. Seleccione los EBs de tamaño uniforme (± 20%) mediante la observación bajo microscopio estereoscópico para mayor experimento. Aproximadamente el 50% EBs formadas con este método son de tamaño uniforme. La transferencia de EB en los resultados de la coctelera en forma uniforme.

3. Ensayo de citotoxicidad para IC ₁₀ Determinación

1. Transferencia de EBS en placas de fondo ópticas
   1. Descongelar 0,1% de gelatina en baño de agua a 37 ° C durante 15 min y la capa de placas de fondo ópticos con 50 l de 0,1% de gelatina por pocillo usando una pipeta multicanal. Incubar las placas a temperatura ambiente durante45 min. Después de la incubación aspirar la gelatina a partir de placas de fondo ópticos.
   2. Saque los EBs recogidos en el día 4 de cada 10 cm de placa bacteriológica que contenían medio RD.
   3. Mantenga placas inferiores ópticas en posición inclinada en cabina de bioseguridad. Transferencia dos de tamaño uniforme de EBS en 100 medio RD l por pocillo de placa de óptica inferior 96 mediante la observación bajo microscopio estereoscópico. Mantenga ^12ª columna vacía.
   4. Incubar las placas en la incubadora de cultivo celular (37 ° C y 5% de CO ₂₎ durante 24 horas.
2. La exposición al fármaco desde el día 5 al día 14
   1. Pesar el compuesto de ensayo y hacer mayor concentración en el disolvente conocido.
   2. Realice-media logarítmica de dilución del compuesto de ensayo en serie hasta 8 diluciones en el disolvente que contienen tubos falcon numeradas con la A a la H, Mantenga el tubo no. I como el control del vehículo, el tubo no. J como control negativo (medio RD) y el tubo no. K como control positivo (70% de etanol).
   3. Descongele el medio RD en baño de agua a 37° C durante 15 min. Saque 5 ml de medio de RD cada uno en 11 tubos Falcon estériles etiquetados de 1 a 11.
   4. Transferencia de 5 l de solución del tubo de la A a la K en el tubo a tubo de 1 a 11, respectivamente, y agitar los tubos. Saque la placa inferior óptica de la incubadora y retire con cuidado los medios de comunicación con el uso de la pipeta multicanal.
   5. Añadir 200 l de los medios de tubo de número 1 a 11 en las respectivas columnas de la placa de fondo óptico. Dar / cambio de drogas medio cada dos días.
      Nota: Para diluciones-media logarítmica toman 6,48 l de disolvente en 7 tubos etiquetados de 2 a 8. De más altas de transferencia de no.1 tubo de concentración 3 l a no.2 tubo, vórtice y en serie transfieren 3 l a siguiente tubo. Mantenga no.9 tubo de control del vehículo y no.10 tubo de control negativo. No.11 Tube es etanol al 70%.
3. Medición de la exposición resazurina y fluorescencia: Día 14
   1. Medio RD Deshielo en baño de agua a 37 ° C durante 15 minutos. Realizar todos los procedimientos mention adelante en ausencia de luz en la cabina de bioseguridad.
   2. Tome medio 10 ml RD en el tubo 15 ml (A) y agregar el volumen recomendado de reactivo resazurina y mezclar con la pipeta. Saque la placa inferior óptica de la incubadora y retire con cuidado todo medio con pipeta multicanal.
   3. Añadir 100 l de medio desde el tubo A en cada pocillo. Incubar la placa de cultivo celular en la incubadora (37 ° C y 5% de CO ₂₎ durante 90 min.
   4. Medir la fluorescencia utilizando espectrofotómetro (560 _Ex / 590 _Em).
4. IC ₁₀ valor de determinación
   1. Importación de los valores en el gráfico de la almohadilla prisma después de restar los valores en blanco. Set eje x como una dosis y el eje y como unidades de fluorescencia.
   2. Normalizar los valores para obtener el porcentaje en el eje Y y transformar los valores (eje x como escala logarítmica). Calcula IC ₅₀ valor mediante la respuesta a dosis sigmoidal parámetro (pendiente variable). Calcular ingrese IC ₁₀ valores utilizando siguienteecuación:
      F = 10 LogEc ₅₀ = logECF - (1 / ladera) * log (F / (100-F))
      Y = Bottom + (Superior-Inferior) / (1 ​​+ 10 ^ ((LogEc ₅₀ -X) * ladera))
   3. Determinar los valores de IC ₁₀ que han de adoptarse para estudios posteriores.

4. Estudio de biomarcadores Basado en Microarrays

1. Día 0 a 5 días:
   1. Formación de cuerpos embrioides y traslado a 10 cm placas bacteriológicas - siga los pasos mencionados en el punto 2 de la formación de cuerpos embrioide.
      Nota: Utilice tres repeticiones biológica para cada estudio. Dividir cada biológica replicar en dos partes - El tratamiento farmacológico en IC ₁₀ concentración y control del vehículo. Preparar la concentración del fármaco 10.000 veces por encima de la concentración _de IC ₁₀ en el vehículo y de esta añada 10 l a 100 ml de medio de RD con grupos de células H9 en 50 ml tubo Eppendorf mezclar bien y sembrar en placas de fondo V. Siga el mismo procedimiento para el grupo de control del vehículo.
2. En la exposición al fármaco en el día 5 a 14, recoger los EB's y transferirlos en 10 cm placas bacteriológicas en el día 4 de acuerdo a los pasos mencionados en el punto 2. Transferir las placas en agitador horizontal (reciprocidad movimiento 50 / min) en incubadora de cultivo celular (37 ° C y 5% de CO ₂₎ durante 14 días. Dé cambio de medio cada dos días.
3. Para la recogida de muestras, en el día 14, recoge las EB de placas de 10 cm a 15 ml tubo falcon con pipeta serológica estéril. Permitir que EBS se asienten durante 2 min. Aspirar el sobrenadante y lavar las EBs con 5 ml de PBS. Permitir que EBS se asienten durante 2 minutos y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender EBs en solución RNAlater 1 ml o reactivo TRIzol, vórtice y almacenar la muestra a -80 ° C hasta su posterior procesamiento.
   Nota: Realice todos los procedimientos de cabina de bioseguridad de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. Gire las placas en movimiento circular alrededor del centro para que todos los EBS en el centro, aspirar el medio de los alrededores con la ayuda de pastu vidrio estérilre pipeta, añadir 15 ml de medio de RD y luego añadir 15 l de fármaco / vehículo para grupo respectivo.

5. Aislamiento de ARN y Pruebas de Integridad

1. Aislamiento de ARN:
   La mayoría de los pasos mencionados a continuación son a realizar para la purificación de ARN utilizando RNeasy Mini Kit de acuerdo con el manual de instrucciones. Utilice siempre tubos libres de nucleasa, puntas de pipeta y agua. Mientras trabajaba con TRIzol llevar a cabo todos los procedimientos en la capilla de la seguridad química y usar gafas de protección, así como los guantes de protección química.
   1. Descongele las muestras en hielo. Si las muestras se almacenan en solución RNAlater, centrifugar los tubos a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante y añadir 1 ml de reactivo TRIzol.
   2. Triturar las muestras usando 24 G aguja y jeringa de 1 ml. Aproximadamente 15 veces trituración es suficiente para la interrupción de EBS, pared celular y las membranas plasmáticas.
   3. Añadir 200 l de cloroformo en cada muestra. Vortex para mezclar el contenido de manera uniforme. Centrífugoa 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Retire los RNeasy mini-spin columnas, tubos de 1,5 ml y etiquetarlos correctamente.
   4. Recoger el sobrenadante en tubos de 1,5 ml (Aunque la recogida de sobrenadante no molestar el medio o capa inferior). Añadir un volumen igual de etanol enfriado 70%. Mezcle el contenido por agitación suave.
   5. Aplicar 700 l de los tubos respectivos a los mini columnas de centrifugación y centrifugar ellos a 12.000 xg durante 20 segundos a RT. Realice todos los pasos adicionales a temperatura ambiente.
   6. Desechar el filtrado y aplicar la solución restante a las respectivas columnas y centrifúguelas a 12.000 xg durante 20 seg. Deseche el filtrado.
   7. Aplicar 350 l de tampón RW1 a la columna y centrifugar ellos a 12.000 xg durante 20 seg. Desechar el filtrado y aplicar 10 l de tampón de ADNasa y RDD 70 l a la columna.
   8. Incubar a TA durante 15 min. Aplicar 350 l de tampón RW1 a la columna y centrifugar ellos a 12.000 xg durante 20 seg. Deseche el filtrado. Aplicar 500 l deRPE tampón de lavado a la columna y centrifugar ellos a 12.000 xg durante 20 seg. Deseche el filtrado. Una vez más Aplicar 500 l de tampón de lavado RPE a la columna y centrifugar ellos a 12.000 xg durante 2 min. Deseche el filtrado.
   9. Shift las columnas a nuevas 2 ml y centrifugar tubos de recogida de ellos a 12.000 xg durante 1 min. Transfiera las columnas de la etiqueta tubo de 1,5 ml de recogida y aplicar 22 l de agua libre de nucleasa. Centrifugar los tubos a 12.000 xg durante 1 min.
   10. Retire el tubo de recogida y ponerlos en hielo. Cuantificar ARN usando el sistema de electroforesis automatizada.
2. Concentración de ARN, la pureza y la prueba de integridad.
   Por la pureza y la integridad del ARN probando uso automatizado sistema de electroforesis y respectivo kit ^33.

6. Estudios Microarray

1. Realice perfil transcripcional utilizando chips de matriz Humanos disponibles comerciales. Para la preparación de ARN diana, la fragmentación, la hibridación y la matriz ³⁴tinción de chips, lavado ³⁵ uso de kits comerciales disponibles.
2. Realizar el escaneo de chip matriz y control de calidad mediante el uso de la estación de fluidos estándar, escáneres de matriz y softwares operativos estándar ^36. Para el análisis de la expresión génica importar los archivos generados a partir de escáneres para el software comercial disponible norma ^37, realice la corrección de fondo, el resumen y la normalización con robusta gama Multi-Análisis (RMA).
3. Para obtener la lista de genes expresados ​​diferencialmente (de DEG) realizar una forma de análisis ANOVA. De esta lista filtrar los genes sobre la base de las veces el cambio (± 2) y p-valor controlado-FDR (<0,05). Obtenga el Análisis de Componentes Principales (PCA), mapa de calor, etc., utilizando este software.

Parte del sistema 2. UKN 1 Prueba

1. El mantenimiento de células madre

1. Siembra de MEFs
   1. Para la diferenciación utilizar la NSCB # 8534 (H9) línea celular. Ce Culturalls en fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) como células alimentadoras. Escudo matraz T25 con 4 ml de 0,1% de gelatina y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C.
   2. MEFs deshielo en 37 ° C baño de agua y transferir las células en DMEM / FBS al 10% precalentado.
   3. Girar 3,5 min con 500 xg, eliminar el sobrenadante y resuspender las células para obtener 1 x 10 ⁷ células / ml. MEFs Plate 4 x 10 ⁴ / cm ² en frascos T25 en gelatina. Opcionalmente, utilice las MEFs para los próximos dos días. Calidad de lotes MEF son un tema muy importante para el mantenimiento de células madre. Por lo tanto, es aconsejable para dilucidar la mejor compañía y método de preparación para las células H9. Utilizamos PMEF P3.
2. La división y el mantenimiento de H9
   1. Añadir 1 ml de dispasa pre-calentado por T25 frasco H9 e incubar 9 minutos a 37 ° C.
   2. Añadir 2 ml de lavado medio a Dispasa células tratadas y pipeta de 5 veces arriba y abajo con 5 ml pipeta y solución de células transferencia a un tubo Falcon.
   3. Lavar el matraz con 9 ml Medio de Lavadoy añadir las células a los otros. Girar 3,5 min con 500 xg, eliminar el sobrenadante y las células en medio 10 ml hESC volver a suspender.
   4. Gira 3.5 min con 500 xg, retire sobrenadante y células en medio 4 ml hESC volver a suspender. Añadir 0,5 ml de suspensión celular y 4,5 ml de medio de células madre y la placa en una nueva (PBS lavado) matraz T25 con MEFs. Cambio de medio hESC entero (5 ml) del matraz cada día.

2. Diferenciación de células madre hacia Células Progenitoras neuroectodérmicos (NEP)

1. Preparar medio hESC y medianas KCM. Escudo una placa de 10 cm con gelatina (0,1% en PBS) por frasco T25 y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C. Retire medio de células madre y añadir suficiente accutase para cubrir todo el fondo del matraz (1 ml por matraz T25) y se incuba de 25 a 30 min a 37 ° C.
2. Preparar placas recubiertas de matriz de membrana basal durante la incubación accutase. Añadir frío DMEM / F12 para congelados matriz de sedimento de la membrana basal y resolverlo 1:20. Filtrar Solu de la matriz de la membrana basalción a través de un filtro de células de 40 micras. Añadir solución filtrada a la placa, todo el fondo tiene que ser cubierto (se requiere 1 ml por 6 pocillos) y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente.
3. Después del período de incubación eliminar el sobrenadante matriz de membrana basal y las células de semillas en los pocillos recubiertos. Después del paso accutase (2.1) detener la reacción mediante la adición de 1,5 ml de medio HES. Raspar las células del matraz, añadir 8 ml de medio de células madre y producir una solución de una sola célula mediante pipeteo con 10 ml pipeta a fondo. Filtrar las células a través de un filtro de células de 40 micras.
4. Células de Spin 3 min con 500 xg, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células en 10 ml de células madre. Células girar de nuevo 3 min con 500 xg, eliminar el sobrenadante y las células en células madre que contienen inhibidor ROCA Y-27632 a una concentración final de 10 mM Vuelva a suspender.
5. Aspirar el sobrenadante de plato recubiertos con gelatina. Placa de suspensión de células en un plato de gelatina recubierta para eliminar los MEFs y dejar en la incubadora durante exactamente 1 hora.
   NOTA: Durante esta etapa los MEFs va settle sobre la placa recubierta de gelatina, mientras que la células madre no se puede conectar a la gelatina. Por lo tanto esto es crucial para obtener una diferenciación alimentador gratuita. Es un paso crítico como los resultados de incubación demasiado largos en grumos de células madre y la incubación demasiado corto en la eliminación ineficiente de MEFs. Después de 45 minutos de incubación de la placa debe ser investigado por MEFs ya asentados y cúmulos de células madre.
6. Cuando los MEFs han fijado, lávese suavemente las células no adherentes (células madre) después de la incubación con el medio ya en el plato. Si varios T25 se utilizaron para obtener más células, las células individuales ahora se pueden combinar. Lave la placa una vez con medio hESC.
7. Células de Spin 3 min con 500 xg, eliminar el sobrenadante y las células en aproximadamente 4 ml KCM contienen inhibidor ROCA 10 M Y-27632 y 10 ng / ml de FGF-2 vuelve a suspender.
8. Recuento de células en un hemocitómetro utilizando azul tripán. Placa de 18 x 10 ³ células / cm ² en matriz de la membrana basal placas recubiertas en KCM que contienen inhibidor de Rock 10 M Y-27632 y10 ng / ml de FGF-2 (para 6 también utilizan 1,5 ml por pocillo). Es crucial para la placa de las células en la densidad adecuada para diferenciarlos con éxito en NEPs.
9. Después de 24 horas, cambio de medio a KCM fresco que contiene 10 mM inhibidor ROCA Y-27632 y 10 ng / ml de FGF-2. Después de más de 24 horas, cambio de medio a KCM fresco que contiene 10 ng / ml FGF2.
10. 72 horas después de la siembra de las células, la diferenciación comienza por el cambio medio a medio KSR. Este punto de tiempo se conoce como día de diferenciación 0 (DoD0). La adición de sustancias de ensayo es posible ahora.
11. En DOD1 y DOD2 se cambia exactamente como en DoD0 el medio. Cambio de medio siguiente está en DoD4 que contiene 25% de N2-S y el 75% KSR. En DoD6 la diferenciación se detiene y las células se cosechan para su análisis.

3. La cromatina Immunoprecipitation (CHIP) de células madre y la NEP

1. Preparación de núcleos
   1. Añadir 500 l accutase a cada 6 así que debe ser analizada y se incuba durante 25 a 30 min. Count células en una cámara de Neubauer utilizando azul tripán.
   2. Resuspender las células en 1% de formaldehído en DMEM / F12 de reticulación. Añadir Tris pH 7,5 a una concentración final de 125 mM después de 10 min para detener la reticulación.
   3. Centrifugar las células 3 min con 500 xg a 4 ° C, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en PBS frío.
   4. Células de Spin 3 min con 500 xga 4 ° C, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de tampón L1 / 1 x 10 ⁶ células.
   5. Incubar durante 5 minutos en hielo. Vuelta 5 minutos con 800 xga 4 ° C, eliminar el sobrenadante y volver a suspender los núcleos en 1 ml de tampón L2- / 2 x 10 ⁶ células.
2. La sonicación de control y calidad
   1. Someter a ultrasonidos se generan por lo que los fragmentos de ADN de 300 a 700 pb de longitud. Haga girar 1 min con 10.000 xga 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Los fragmentos necesita tener el tamaño correcto, de lo contrario la inmunoprecipitación será ineficiente así como la qPCR seguido.
   2. Retire 50 l unmezcla d con tampón L2 50 l para comprobar la eficiencia de la sonicación mediante la ejecución de un gel de agarosa.
   3. Ida y reticular de incubación a 65 ° C durante 4 horas y 500 rpm. Cargar las muestras 1: 5 con Orange G colorante de carga en un gel de agarosa al 1,5% y se ejecutan 45 min a 110 V en tampón 1x TBE. Control de tamaño de los fragmentos (debe estar entre 300-700 pb).
3. La inmunoprecipitación de la cromatina
   1. Diluir las muestras 1: 5 en tampón de dilución y alícuota de 1 ml por IP en tubos siliconados.
   2. Retire 5% (volumen) de muestra diluida cromatina (paso 3.3.1) y se almacena a 4 ° C como "entrada".
   3. Incubar las muestras con anticuerpos de su elección y con inespecíficos IgG O / N a 4 ° C en un rotador.
   4. Añadir 50 l de Proteína-A / G Sepharose perlas a cada muestra después de la inmunoprecipitación. Incubar las muestras 3 horas a 4 ° C en un rotador. Tirada 1 min con 1.500 xg a 4 ° C y retirar el sobrenadante.
   5. Lave con cuentas de lavado 1 ml. Tirada 1 min con 1.500 xga4 ° C y retirar el sobrenadante. Repita el paso ga h. Lavar con 1 ml de tampón de lavado final. Durante las etapas de lavado no se debe perder ninguna de las cuentas, ya que esto altera la cantidad de eluato directamente.
   6. Centrifugar 1 min con 1.500 xg a 4 ° C y retirar el sobrenadante. Añadir tampón de elución 125 l e incubar 15 min con 65 ° C a 1.000 rpm en un agitador.
   7. Haga girar 1 min con 1.500 xg y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Repita el paso k y l. Añadir 200 l de tampón de elución de entrada (3.3.2). Añadir a la proteinasa K y RNasa a cada muestra e incubar 30 min con 37 ° C a 500 rpm en un agitador y después de 4 horas con 65 ° C a 500 rpm en un agitador.
      NOTA: Para la extracción de ADN uso comercial disponible chip de ADN limpio y Concentrador Kit ^38.

Resultados

La exposición al mercurio de metilo en el sistema de prueba UKK

El ensayo de citotoxicidad se realizó con H9 EBs para obtener un valor IC ₁₀ (reducción de la viabilidad por 10%) para la citotoxicidad de mercurio de metilo (Figura 1). También se realizó un microarray basada (plataforma Affymetrix) estudio de biomarcadores. El H9 EBS haber estado expuesto al mercurio de metilo (0,25 y 1 M) durante 14 días. El día 14, las muestras se han recogido usando TRIzol...

Discusión

Los enfoques tradicionales de ensayo toxicológico implican amplios estudios con animales que hacen tanto las pruebas costoso y requiere mucho tiempo. Por otra parte, debido a las diferencias interespecies los estudios de seguridad preclínicos en animales no son siempre válidos para predecir los efectos de toxicidad de los fármacos potenciales pertinentes para los seres humanos. Aunque los primates no humanos son más predecibles, todavía fuerte ética y demandas socioeconómicas están elevando rápidamente por las...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Knockout Serum Replacement
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	GlutaMAX supplement
NEAA	Life Technologies	11140050	MEM Nonessential Amino Acids Solution
DPBS	Life Technologies	14190-0144	Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium
mTeSR medium	Stemcell Technologies	5850
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
V bottom plate	VWR	734-0483	Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST
V bottom plate lid	VWR	634-0011	Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled Water	Life Technologies	15230-089.	Sterile Distilled Water
Human FGF-2 (bFGF)	Millipore	GF003AF-100UG	Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μm	Millipore	SCGPU02RE	Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
StemPro EZPassageTM Disposablte	Invitrogen	23181010
BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix	Stemcell Technologies	354277	5 ml vial
DMSO	Sigma	D-2650
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7020	It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples.
70 μm Cell Strainer	Becton Dickinson	352350	Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube	Becton Dickinson	352235	5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
50 ml sterile Polypropylene tube	Greiner Bio-One	227261	50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flask	Greiner Bio-One	658175	CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TRIzol	Life Technologies	10296010
96 well optical bottom plates	Thermo Scientific	165305
CellTiter-Blue	Promega	G8081
Accutase	PAA	L11-007
Apotransferin	Sigma-Aldrich	T-2036
Dispase	Worthington Biochemicals	LS002104
Dorsomorphin	Tocris Bioscience	3093
EDTA	Roth	8043.2
FBS	PAA	A15-101
FGF-2	R&D Systems	233-FB
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-100G
GlutaMAX	Gibco Invitrogen	35050-038
HEPES	Gibco Invitrogen	15630-056
Insulin	Sigma-Aldrich	I-6634
Knockout DMEM	Gibco Invitrogen	10829-018
Matrigel	BD Biosciences	354234
Noggin	R&D Systems	719-NG
PBS	Biochrom AG	L1825
Progesteron	Sigma-Aldrich	P7556
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris Biosciences	1254
SB431542	Tocris Biosciences	1614
SDS	Bio-Rad	161-0416
Selenium	Sigma-Aldrich	S-5261
β-Mercaptoethanol	Gibco Invitrogen	31350-010
[header]
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit	Affymetrix	900721, 22, 23	This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays.
Rnase-Free DNase Set	QIAGEN	79254
[header]
List of equipment
Inverted microscope	Olympus		IX71
Genechip Hybridisation Oven - 645	Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450	Affymetrix
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G	Affymetrix
Spectramax M5	Molecular Devices
[header]
List of softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory