Kimyasal Güvenlik Tarama ve Sistem Biyolojisi Veri Üretimi Gelişim Toksisite Tahliller Tabanlı İnsan Pluripotent Kök Hücre

Özet

protokoller, insan embriyonik kök hücreleri ve transcriptome çalışmalarına dayalı iki in vitro gelişimsel toksisite test sistemleri (UKK ve UKN1) açıklar. test sistemleri, insan gelişimsel toksisite tehlike tahmin ve hayvan çalışmaları, maliyet ve kimyasal güvenlik testi için gerekli süreyi azaltmak için katkıda bulunabilir.

Özet

-omics Teknolojiler potansiyel ilaçların in vitro toksisite testleri için yeni ufuklar açtı verimli protokoller arada çeşitli dokularda insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek. Bu tür tahliller için sağlam bir bilimsel temel sağlamak için, gelişim zamanı seyrine ve sistemler biyolojisi yaklaşımları ile altta yatan düzenleyici mekanizmaları üzerine sayısal bilgiler elde etmek için önemli olacaktır. İki tahlilleri dolayısıyla bu gereksinimler için buraya ayarlandı. UKK test sistemi olarak, insan embriyonik kök hücreleri (HESC) (veya başka bir pluripotent hücreler) kendiliğinden üç germ hücrelerinin üretilmesini sağlamak için, embriyoid organları 14 gün ayırt etmek için bırakılır. Bu sistem, erken insan embriyonik gelişiminin önemli adımlar özetlediği ve hücreler farklılaşma sırasında kimyasallara maruz kalırsanız o, insana özgü erken embriyonik toksisite / teratojenite tahmin edebilirsiniz. UKN1 test sistemi bir populat için ayırt hESC dayanmaktadırnöroektodermal dede iyon (NEP) 6 gün boyunca hücreler. Bu sistem, erken nöral gelişimi özetlediği ve erken gelişim nörotoksisiteyi ve kimyasallar tarafından tetiklenen epigenetik değişiklikler öngörüyor. Her iki sistem de, transcriptome mikrodizi çalışmaları ile kombinasyon halinde, toksisite biyolojik göstergeleri için uygundur. Ayrıca, sistem biyolojisi analiz için veri üretmek için kombinasyon halinde kullanılabilmektedir. Bu test sistemleri, hayvanların büyük miktarlarda gerektiren geleneksel toksikolojik çalışmalar bir çok dezavantajı vardır. test sistemleri, ilaç geliştirme ve kimyasal güvenlik değerlendirmesi için maliyetlerin azalmasına katkıda bulunabilir. Onların kombinasyonu özellikle özel nöro-gelişimsel sürecini etkileyebilir bileşikler ışık tutuyor.

Giriş

hücrelerin çeşitli içine ayırt etmek, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) yeteneği in vitro toksisite testleri ^1, hastalık modelleme ve rejeneratif tıp ² yeni bir dönem açtı. kök hücreler kendini çoğaltmak için kapasite, onların pluripotent devleti korumak için, ve özelleşmiş hücrelere ^3,4 içine ayırt etmek için sahiptirler. HESC özellikleri, aynı zamanda, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSC) ya da nükleer transfer ⁵ tarafından üretilen hücreler gibi diğer insan pluripotent kök hücreleri, bulunan (kapasitesi tüm ana hücre tiplerine ayırt etmek için). Örneğin, birçok farklı HESC hatları hücreler ^13,14 gibi nöronlar ^6, böbrek hücreleri ^7, nöral krest hücrelerinden ^8, kardiyomiyositler ^9-12 veya hepatositlere ayırt edilmiştir. Dahası, HESC kendiliğinden embriyoid organları (EBS) ^19,20 her üç germ ^15-18 hücre içine ayırt edebilirsiniz. Early embriyonik gelişim mikro-dizi teknolojisi kullanılarak ¹⁵ transkriptomik mRNA düzeyinde yakalandı farklı germ ile ilgili çeşitli genlerin farklı sunum-düzenlenir. Bu çabalar HESC / hiPSC ve transkriptomik analizi (inceleme için ^21,22 bakınız) dayalı organa özgü toksikolojik modellerin kurulması ile sonuçlandı. Bu modeller laboratuar hayvanları hep insan güvenliği tahmin değildir kullanarak preklinik çalışmalarda olarak toksikolojik çalışmalar için laboratuvar hayvanlarının geleneksel kullanımı üzerinde avantajları var. hastalarda karşılaşılan ilaca bağlı toksisiteleri genellikle insanlar ve deney hayvanlarında arasında farklılık metabolik veya sinyal süreçleriyle ilgilidir. türler farkı insanlarda gelişimsel toksisite güvenilir erken teşhis engelledi ve bu talidomid ^23,24 ve ^25,26 olarak dietilstilbestrol örnek ilaçlar nedeniyle teratojenite piyasadan çekildi. Thalidomide sıçan veya farelerde herhangi gelişimsel toksisite göstermemiştir. Örneğin metil civa ²⁷ Çevresel kimyasal maddeler, çeşitli türlerde sinir sistemi ile ilgili prenatal gelişim toksisite sonuçlandı, ancak insan belirtiler hayvanlarda modellemek zor olmuştur. Türlerin özgüllüğü sorunları sorunu çözmek için, farklı projelerde altında çalışan bilim adamları vb şüphelenilen insan toksik atıkları kullanarak embriyonik toksisite, nörotoksisite, kardiyotoksisite, hepatotoksisite ve nefrotoksisite için farklı modellerin geliştirilmesinde başlattık reprotect, ESNATS, dedektif gibi kök hücreleri dayalı insanları etkiler. Avrupa konsorsiyumu projesinde 'Embriyonik Kök hücre tabanlı Roman Alternatif Test Stratejileri (ESNATS)' kapsamında beş test sistemleri kurulmuştur. Bir test sistemi olarak adlandırılan UKK (U niversitäts k linikum K OLN) test sistemi kısmen erken insan embriyonik gelişmeyi yakalar. Bu s olarakistem insan embriyonik H9 hücreleri üç germ (ektoderm, endoderm ve mezoderm) ¹⁵ ve germ tabakası belirli imzalar Affymetrix mikroarray platformu kullanarak profil transkriptomik tarafından esir edilmiş olarak ayrılır. Talidomid ^28, valproik asit, metil cıva ^16,17 veya sitosin arabinosid ¹⁵ gibi çeşitli gelişimsel toksik maddeler bu sistemde test edilmiştir ve zehirli spesifik gen imzalar elde edilmiştir. Ikinci bir test sisteminde, bu nedenle test sistemi 1 UKN1 (K onsta n = U niversity) olarak adlandırılan, H9 hücreleri 6 gün süreyle nöroektodermal projenitör hücreleri (NEP) ile ayrılır. Bu tür Pax6 ve OTX2 olarak nöral gen belirteçleri yüksek ifadesi ile belirlenir. Farklılaşma sırasında 6 gün, NEP hücreler gibi VPA, metil cıva gibi gelişimsel nöro-toksik maruz kalmıştır. Zehiri özgü de regüle transkriptomik profilleri obtai olmuşturAffymetrix mikroarray platformu ^16,29 ile de tanımlanır.

^21. yüzyılın toksikoloji için yeni bir vizyon test sistemleri uzun vadeli toxicant inkubasyon sonunda in vivo histopatolojik veya transcriptome değişiklikleri gibi fenotipik açıklamaları verim yapmak değil sadece öngörmektedir. Daha çok tahliller mekanistik bilgi ^3. sağlamak ve bu bilgilerin sözde eşlenebilir düşündürmektedir olumsuz sonuç yolları (AOP) zararlı etkilerinden ³⁰ için bilimsel gerekçe sağlamak. Bu tür bilgi vermek, uygulamalı test sistemleri yüksek kaliteli sağlam standart operasyon prosedürlerine göre belgelenmiş örneğin olarak, ³¹ kontrol edilmesi gerekiyor. Ayrıca, zaman-bağımlı değişiklikler yüksek çözünürlüklü eşlenmesi gerekir. Bu senkronize değişikliklerle ³² test sistemlerini gerektirir. Burada anlatılan UKN1 ve UKK test sistemleri bu gereksinimleri için optimize edilmiştir.

Protokol

Aşağıdaki protokol, insan embriyonik kök hücre hattı (HESC) H9 kullanılarak gerçekleştirildi. Bu hücre hattı rutin olarak HESC kültür ortamı mitotik inaktive fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) bFGF ile takviye edilmiş ve MEF'ler kurtulmak için, örneğin matrigel olarak bazal membran matris ile kaplanmış 6 cm Petri kapları kök hücre ortamda kültür üzerinde kültürlenmiştir. >% 80 konfluent plakalardan H9 hücreleri daha geçişi için kullanıldı. Bazal membran matrisi plakaları üzerinde kültürlendi H9 hücreleri EBS oluşumu için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokolde belirtilen tüm işlemler aseptik ve iyi hücre kültür uygulamaları için, standart yöntemler kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Bölüm 1. UKK testi Sistemi

1. İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleme

1. Yarma ve besleyici hücreler H9 bakımı
   1. Her bir 6 cm plaka pipetleyin 2 mi,% 0.1 jelatin ve hücre kültürü inkubasyondan 30 dakika boyunca inkübeator (37 ° C ve% 5 _CO2). Steril Pasteur pipeti ile aspire jelatin çözüm.
   2. Iki jelatin kaplı plakalara 0.1 x 10 ⁶ MEF hücre / ml ihtiva eden 2 mi MEF ortamı ilave edin ve hücre kültürü inkübatör (37 ° C ve% 5 _CO2), O / N inkübe.
   3. Bir sonraki gün, forseps kullanılarak H9 hücreleri, sıvı azot depolama tankı arasında şişe çıkarın ve uzun forseps kullanılarak 37 ° C su banyosu içinde şişe çözülme.
   4. 15 ila 30 saniye için biyogüvenlik kabini su banyosu,% 70 etanol ile banyo onu, kuru hava gelen flakon çıkarın ve 15 ml şahin tüp hücreleri aktarın.
   5. 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri yavaş iç duvarında H9 kültür ortamının 9 ml ilave edilir ve santrifüj.
   6. Süpernatant aspire ve kaya inhibitörünü ihtiva eden 6 ml kültür ortamı içinde hücre (10 uM, Y27632) ile karıştırmak için hafifçe pipet yeniden askıya. Aspire MEF 6 cm plaka, orta ve her bir plaka içerisinde 3 mi hücre süspansiyonu ekleyin. D orta değiştirin3 ve daha sonra her gün ay. Bölünmüş oranı ile Altkültür>% 80 birleşen plaka hücreleri 1: 3.
      Not: Genellikle 5-7 günlük plaka konfluent hale gelir. Kullanılan Besleme CF1 fare embriyo elde edilmiş ve radyasyon γ maruz bırakılarak etkisiz hale getirildi.
2. Bazal membran matrisi kaplanmış plakalar üzerinde H9 hücre kültürü
   1. Çözülme kök hücre ortamı (5x) oda sıcaklığında ek ve biyogüvenlik kabini, 100 ml, 400 ml içine bazal orta ekleyin.
   2. Buz üzerinde çözülme bazal membran matrisi. Bazal membran matris önerilen hacim ekleyin oniki 6 cm plakalar için DMEM / F-12 bazal ortam soğutulmuş 24 ml (her parti için analiz sertifikası bakınız). Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
   3. Her bir 6 cm plaka 2 ml ilave edilir. 1 saat boyunca oda sıcaklığında plaka tutun. Orta çıkarın ve kök hücre orta 2 ml ekleyin.
   4. MEF'lerden dört konfluent H9 plakalarını çıkartın. Biyogüvenlik kabini tutulan stereomicroscope altında 1 ml pipet ile farklılaşmış koloniler çıkarın.
   5. Solukluorta ve 4 ml PBS ile hücrelerin yıkayın ve her bir plaka hücre ortamı kök ml 2 ekleyin. 6 ila 9 adet her 26 G iğne ile farklılaşmamış koloniler kesin.
   6. Yavaşça, 50 ml Falcon tüpü içine hücreleri toplamak. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
   7. Süpernatantı aspire ve hücre ortamı kök ml 12'de yeniden askıya. Mikroskop altında cam slayt 20 ul koyarak kümeleri sayın ve ml başına 150 kümeleri için ses seviyesini ayarlamak. Her bir 6 cm plaka içinde süspansiyon 2 ml ilave edilir.
   8. Tekdüze yığın dağıtımı için geri ve ileri-ve yan-yan hareketleri plakaları Taşı ve hücre kültürü inkübatör (37 ° C ve% 5 CO ₂₎ plakaları kuluçkaya yatmaktadır.
   9. Farklılaşmış koloniler çıkarın ve orta değiştireceğim her alternatif gün verin.

2. Embriyoid Oluşumu (EBS) Oluşumu

Aseptik önlemler başına ve biyogüvenlik kabini aşağıda belirtilen tüm prosedürü uygulayın.

1. Gün 0 & #8212; V tabanlı plakalar üzerinde H9 hücrelerinin Kaplama
   1. Böyle PBS Pluronik F 127 olarak% 5 blok kopolimeri hazırlayın ve 0.22 mikron steril filtre kullanılarak vakum tahrikli filtrasyon sistemi ile filtre.
   2. Oyuk başına% 5 blok kopolimerinin 40 ul 96 gözlü mikrotitre plaka kiti taban ve 45 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe kaplayın V.
   3. Inkübatör H9 hücreleri ile birleşen bazal membran matris plakaları çıkarın ve biyogüvenlik kabini stereomicroscope altında 1 ml pipet ile farklılaşmış koloniler çıkarın.
   4. Orta aspire ve 4 ml hücrelerin PBS ile yıkayın. Her plakada (bFGF, RD orta olmadan H9 kültür ortamı) 2 ml rasgele farklılaşma ortamı ekleyin. Geçit aracını kullanın ve biyogüvenlik kabini stereomicroscope altında gözlemleyerek üniforma boyut ve şekil yığınlarda H9 hücre kolonilerini kesmek ve daha sonra yavaşça hücre kazıyıcı ile kazıyın.
   5. 5 dakika boyunca 200 x g'de 50 ml Falcon tüpüne ve santrifüj kümeleri toplayın. Süpernatantı aspire ve cel yeniden askıyaRD ortamında l ml başına 1.000 kümeleri olsun.
   6. V alt plakalar blok kopolimer aspire. Steril köşeli plaka yığınları dökün ve çok kanallı bir pipet yardımı ile V tabanlı plakanın her oyuğuna süspansiyonu 100 ul ilave edin.
   7. Kümeleri kuvveti agregasyonu için, santrifüj, 400 x g, 4 dakika boyunca 4 ° C 'de V tabanlı plakalar. Dört gün hücre kültürü inkübatör (37 ° C ve% 5 _CO2) 'de inkübe edin.
2. 4. Gün - EBS Koleksiyonu
   1. Çok kanallı pipet ve geniş delik 200 ul ipuçlarını kullanarak V alt plakalar steril kare plakasındaki EBS toplayın.
   2. 10 ml steril serolojik pipet 15 ml şahin tüp steril kare plaka EBS toplayın. EBS 2 dakika yerleşmek için izin verin. Süpernatant aspire ve 5 ml PBS ile EBS yıkayın.
   3. EBS 2 dakika razı ve süpernatant aspire izin verin. 5 ml RD ortamında EBS yeniden askıya.
   4. 10 cm üzerinden Pipet 10 mi RD ortabakteriyolojik plakalar. 10 cm bakteriyolojik plakalarda EBS aktarın.
   5. (50 / dak ileri geri hareket) hücre kültürü inkübatör (37 ° C ve% 5 _CO2) gerekli zaman süresi için muhafaza yatay çalkalayıcı üzerinde bakteriyolojik inkübe edin. Orta değişim (15 ml RD ortamı) her alternatif gün verin.
      Not: Nazik işleme gereklidir hESC kültüre ederken. EBS boyutu ileri bir deney için stereomicroscope altında gözlemleyerek üniforma boyut EBS (±% 20) seçin günde 4. değişir. Bu yöntemle oluşturulan yaklaşık% 50 EBS ölçülen büyüklük dağılımı düzgün vardır. üniforma şeklinde çalkalama sonuçlarına EBS transferi.

3. Sitotoksite Testi IC ₁₀ Belirlenmesi

1. Optik alt tabakalarına EBS Transferi
   1. De çok kanallı pipet kullanılarak 0.1% jelatin, 50 ul 15 dakika ve kılıf optik alt plakalar 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içinde% 0.1 jelatin çözülme. Oda sıcaklığında inkübe edin45 dk. Inkübasyondan sonra optik alt plakalar jelatinin aspire.
   2. RD ortamı içeren 10 cm bakteriyolojik plaka gün 4 toplanan EBS dışarı atın.
   3. Biyogüvenlik kabini eğimli pozisyonda optik alt tabak tutun. Aktarım stereomikroskop altında gözlemleyerek optik tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 100 ul RD orta EBS iki homojen boyutu. Boş ^12. sütunu tutun.
   4. 24 saat süre ile hücre kültürü inkübatör (37 ° C ve% 5 _CO2) 'de inkübe edin.
2. 14. günde gün 5 ilaca maruz kalma
   1. Test bileşiğinin tartılır ve bilinen bir çözücü içinde en yüksek konsantrasyonu yapın.
   2. Bir tüp tutun, seri H'ye kadar sayılı Falcon tüpleri içeren bir çözücü içinde 8 seyreltileri kadar test bileşiğinin yarı logaritmik seyreltme gerçekleştirin. Ben araç kontrolü, tüp No olarak. J bir negatif kontrol (RD ortamı) ve tüp gibi. (% 70 etanol), kontrol olarak pozitif K.
   3. 37 ° C'de su banyosu içinde RD orta çözülme15 dakika boyunca ° C. 1-11 etiketli 11 steril şahin tüpler 5 ml RD orta her dışarı atın.
   4. Transferi 5 sırasıyla 11 tüp 1 tüp K tüp A çözümün ul ve vorteks tüpleri. Inkübatör optik alt plaka çıkarın ve dikkatlice kanallı pipet kullanımı ile ortamı çıkarın.
   5. Optik alt plaka ilgili sütunlar halinde 11 tüp 1 numaralı ortamların 200 ul ekleyin. Orta / ilaç değiştireceğim her alternatif gün verin.
      Not: Yarım logaritmik seyreltikleri seri tüp no.2, vorteks ve en yüksek konsantrasyon tüpü no.1 transferi 3 ul itibaren 8. 2'den etiketlenmiş 7 tüplerde çözücü 6.48 ul almak sonraki tüp 3 ul aktarmak için. Negatif kontrol için, araç kontrolü, boru No.10 tüp No.9 tutun. Tüp 11 sayılı% 70 etanoldur.
3. Gün 14: Resazurin maruz kalma ve floresan ölçümü
   1. 15 dakika boyunca 37 ° C'de su banyosu içinde çözülme RD ortamı. Tüm prosedür mentio gerçekleştirinn, aşağıdaki biyo-güvenlik kabini ışık olmadan.
   2. 15 ml'lik bir tüpe (A) 10 mi RD orta alın ve resazurin reaktifi tavsiye edilen hacim kazandırmak ve pipetleme karıştırın. Inkübatör optik alt plaka çıkarın ve dikkatlice kanallı pipet ile tüm orta kaldırmak.
   3. Her bir göze boru A ortamı 100 ul ekle. 90 dakika boyunca hücre kültürü inkübatöründe plakası (37 ° C ve% 5 _CO2) inkübe edin.
   4. Floresan kullanarak spektrofotometre (560 _Ex / 590 _Em) ölçün.
4. IC ₁₀ değer tespiti
   1. Boş değerleri çıkarıldıktan sonra grafik pad prizma değerleri ithal. Flöresanlı bir birim olarak bir dozda ve y-ekseni olarak ayarlayın x-ekseni.
   2. Y ekseninde yüzdesini elde ve değerleri (log ölçek olarak x-ekseni) dönüştürmek için değerleri normalleştirmek. Sigmoidal doz yanıt (değişken eğim) parametresini kullanarak IC ₅₀ değerini hesaplayın. Aşağıdaki kullanarak Yatırım Ortamı ₁₀ değerleri log hesaplayındenklem:
      F = 10 logEC ₅₀ = logECF - (1 / Yamaç) * log (F / (100 F))
      Y = Taban + (Üst-Taban) / (1 ​​+ 10 ^ ((LogEC ₅₀ = X) * Yamaç))
   3. Belirleyin IC ₁₀ değerleri ileri çalışmalar için alınacak.

4. Biyomarker Çalışma Mikroarray'ler dayanarak

1. Gün 5 Gün 0:
   1. Embriyoid vücut oluşumu ve transfer için 10 cm bakteriyolojik plakalar - embriyoid vücut oluşumu için 2. maddede belirtilen adımları izleyin.
      Not: Her çalışma için üç biyolojik çoğaltır kullanın. IC ₁₀ konsantrasyon ve araç kontrolünde İlaç tedavisi - Her biyolojik ikiye çoğaltmak bölün. Aracın ilaç konsantrasyonuna IC ₁₀ konsantrasyonun üzerinde 10.000 kat hazırlayın ve bu 50 ml Eppendorf tüp H9 hücre kümeleri ile 100 ml'lik RD ortamına 10 ul ekleyin gelen iyice karıştırın ve V alt tabakalarına tohum. Araç kontrol grubu için aynı işlemi uygulayın.
<14'e Gün 5 uyuşturucu maruz İçin li> EB's toplamak ve nokta belirtilen adımlar göre günde 4 10 cm bakteriyolojik plakaları aktarabilirsiniz yatay çalkalayıcı (karşılıklılık hareketi 50 / dk) plakaları 2. Aktarım hücre kültürü yetiştirme cihazı kullanılmaktadır (37 ° C ve% 5 _CO2) 14 gün boyunca uygulanır. Orta değiştireceğim her alternatif gün verin.
2. Numune toplama için, 14. günde, steril bir serolojik pipet ile 15 ml Falcon tüpüne 10 cm plakalardan EBS toplar. EBS 2 dakika yerleşmek için izin verin. Süpernatant aspire ve 5 ml PBS ile EBS yıkayın. EBS 2 dakika razı ve süpernatant aspire izin verin. 1 mi RNAlater çözelti ya da Trizol reaktifi, girdap bölgesi EBS yeniden askıya ve daha ileri işleme kadar -80 ° C'de örnek saklayın.
   Not: iyi laboratuvar uygulamaları başı olarak biyogüvenlik kabini tüm yordamı gerçekleştirin. Steril cam pastu yardımı ile çevredeki ortamı merkezindeki tüm EBS getirmek aspire merkezi çevresinde dairesel bir hareketle plakaları döndürünpipet yeniden, 15 ml RD orta ekleyin ve sonra ilgili grup için ilaç / araç 15 ul ekleyin.

5. RNA izolasyonu ve Bütünlük Testi

1. RNA İzolasyonu:
   Aşağıda belirtilen adımlardan en kullanım kılavuzuna göre RNeasy Mini Kit kullanılarak RNA saflaştırma için yapılması gereken vardır. Daima nükleaz ücretsiz tüpleri, pipet uçları ve su kullanın. TRIzol ile çalışırken kimyasal güvenlik kabini tüm prosedürü yürütmek ve koruyucu gözlük yanı sıra kimyasal koruyucu eldiven giyin.
   1. Buz üzerinde örnekleri çözülme. Numuneler RNAlater çözelti içinde kayıtlı ise, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüj tüpleri. Süpernatantı atın ve 1 ml TRIzol reaktifi ekleyin.
   2. 24 G iğne ve 1 ml şırınga kullanarak örnekleri Karışım. Yaklaşık 15 katı toz haline getirme EBS, hücre duvarı ve plazma membran bozulması için yeterlidir.
   3. Her bir numune içinde kloroform 200 ul ekle. Vortex eşit içerikleri karıştırmak için. Santrifüj4 ° C'de 15 dakika boyunca 12,000 x g'de. RNeasy Mini Spin sütunlar, 1.5 ml tüpleri çıkarın ve bunları düzgün etiketleyin.
   4. (Süpernatant toplama orta veya alt tabaka rahatsız etmeyin iken) 1.5 ml tüpler içinde süpernatant toplayın. Soğutulmuş% 70 etanol eşit hacmi ekleyin. Nazik sallayarak içeriğini karıştırın.
   5. İlgili Mini sıkma kolonlara tüpler 700 ul uygulayın ve oda sıcaklığında 20 saniye boyunca 12.000 xg'de onları santrifüj. Oda sıcaklığında tüm diğer adımları uygulayın.
   6. Filtratı atın ve ilgili sütunlara kalan çözümü uygulamak ve 20 saniye boyunca 12.000 xg'de onları santrifüj. Filtratı atın.
   7. Sütuna RW1 tampon 350 ul uygulayın ve 20 saniye boyunca 12.000 xg'de onları santrifüj. Filtratı atın ve kolona 10 DNAz ul ve 70 ul RDD tampon uygulayın.
   8. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Sütuna RW1 tampon 350 ul uygulayın ve 20 saniye boyunca 12.000 xg'de onları santrifüj. Filtratı atın. 500 ul uygulayınRPE sütun tampon ve 20 saniye boyunca 12.000 xg'de onları santrifüj yıkama. Filtratı atın. Yine kolona RPE yıkama tamponu içinde 500 ul uygulayın ve 2 dakika için 12,000 x g'de santrifüj. Filtratı atın.
   9. Yeni 2 ml toplama tüpleri sütunları Shift ve 1 dakika boyunca 12.000 xg'de onları santrifüj. Etiketli 1.5 ml toplama tüpüne sütun aktarın ve nükleaz serbest su 22 ul uygulayın. 1 dakika için 12,000 x g'de santrifüjleyin tüpler.
   10. Toplama tüpünü çıkarın ve buz üzerine koydu. RNA, otomatik elektroforez sistemi ile ölçmek.
2. RNA konsantrasyonu, saflık ve dürüstlük testi.
   RNA saflık ve bütünlük için kullanımı otomatik elektroforez sistemi ve ilgili kiti ³³ test.

6. Mikroarray Çalışmaları

1. Ticari kullanılabilir İnsan dizi yongaları kullanan transkripsiyon profil gerçekleştirin. RNA hedef hazırlama, parçalanma, melezleme ³⁴ ve dizi içinchip boyama, yıkama ³⁵ kullanımı, ticari mevcut kitler.
2. Standart fluidik istasyonu, dizi tarayıcılar ve standart çalışma yazılımları ³⁶ kullanılarak dizi çip tarama ve kalite kontrol kontrolü yapın. Gen ekspresyon analizi için standart mevcut ticari yazılımlar ³⁷ tarayıcılardan elde edilen dosyaları içe, Sağlam Çoklu dizi analizi (RMA) ile arka plan düzeltme, özetleme ve normalleşme gerçekleştirin.
3. Farklı ifade genlerin listesini elde etmek için (°) 'ın tek yönlü ANOVA analizi gerçekleştirmek. Bu listeden, katlama değişim (± 2) ve FDR kontrollü p-değeri (<0.05) göre genleri filtre. Bu yazılımı kullanarak, vb Principal Component Analysis (PCA), Isı Haritası, edinin.

Bölüm 2. UKN 1 Test Sistemi

HESC 1. Bakım

1. MEF'lerin Tohum
   1. Farklılaşma için NSCB # 8534 (H9) hücre hattı kullanın. Kültür cebesleyici hücreler olarak fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) üzerine lls. % 0.1 jelatin, 4 ml ile kaplayın T25 şişesi 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
   2. 37 ° C su banyosu içinde çözülme MEF'ler ve önceden ısıtılmış DMEM /% 10 FBS içinde hücreleri aktarın.
   3. 500 xg ile 3,5 dakika Spin süpernatant kaldırmak ve 1 x 10 ⁷ hücre / ml elde etmek için hücrelerin askıya yeniden. Jelatin üzerinde T25 şişeler 4 x 10 ⁴ / cm ² Levha MEF'ler. İsteğe bağlı olarak, sonraki iki gün MEFS kullanın. MEF toplu Kalite HESC bakım için çok kritik bir konudur. Bu nedenle, H9 hücreleri için en iyi şirket ve hazırlama yöntemi açıklamak için tavsiye edilir. Biz PMEF P3 kullanımı.
2. Yarma ve H9 bakımı
   1. T25 şişesi H9 1 ml önceden ısıtılmış dispaz ekleyin ve 37 ° C'de 9 dakika inkübe edilir.
   2. 2 ml işlenmiş hücreleri ve pipet 5 kez yukarı ve bir şahin tüp 5 ml pipet ve transfer hücre çözümü ile aşağı dispase orta yıkama ekleyin.
   3. 9 mi yıkama ortamının sertliğine şişeye yıkayınve diğerleri hücreleri ekleyin. 500 xg ile 3,5 dakika Spin süpernatant kaldırmak ve 10 ml HESC ortamda hücrelerin yeniden askıya.
   4. 500 xg ile 3,5 dakika Spin süpernatant kaldırmak ve 4 ml HESC ortamda hücrelerin yeniden askıya. MEF'ler ile yeni bir (PBS yıkanmış) T25 şişesi içinde 0.5 ml hücre süspansiyonu ve 4.5 ml HESC orta ve plaka ekleyin. Her gün, şişenin tüm HESC ortamı (5 mi) değiştirin.

Nöroektodermal Progenitör Hücre doğru hESC 2. Farklılaşma (NEP)

1. HESC orta ve KCM orta hazırlayın. Kat, bir 10 cm T25 şişesi başına jelatin (PBS içinde% 0.1) ile çanak ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. HESC orta çıkarın ve şişenin bütün alt (T25 şişesi başına 1 mi) kapak ve 37 ° C'de 25 ila 30 dakika inkübe kadar Accutase ekleyin.
2. Accutase inkübasyon sırasında taban membran matrisi kaplanmış plakalar hazırlayın. Dondurulmuş bazal membran matris pelet soğuk DMEM / F12 ekleyin ve 01:20 çözmek. Filtre bazal membran matris solu40 mikron hücre süzgecinden yon. Plaka, süzüldü çözeltisi ekleyin, tüm alt kapalı (6-oyuk başına 1 mi gerekmektedir) ve oda sıcaklığında 2 saat süre ile inkübe edilmesi gerekir.
3. Kuluçka döneminden sonra kaplanmış kuyular üzerinde bazal membran matris süpernatant ve tohum hücreleri çıkarmak. Accutase aşama (2.1) sonra 1.5 mi HES ortamı ilave ederek reaksiyonu durdurun. Şişeden hücreler Pençe 8 mi HESC ortamı ilave edin ve iyice 10 mi pipetle pipetleme ile tek bir hücre çözeltisi üretir. 40 mikron hücre süzgecinden Filtre hücreleri.
4. Spin hücreleri 500 xg ile 3 dakika, süpernatant kaldırmak ve hESC 10 ml hücrelerin yeniden askıya. Spin hücreleri tekrar 3 dk xg 500, süpernatant kaldırmak ve ROCK inhibitörü Y-27.632 10 uM nihai konsantrasyonda içeren hESC hücreleri askıya yeniden.
5. Jelatin kaplı çanak süpernatantı. Jelatin kaplı çanak Plaka hücre süspansiyonu MEFS kaldırmak ve tam 1 saat inkübatör bırakmak.
   NOT: Bu adım sırasında MEF'ler olacak settle HESC jelatin eklemek edemez ise jelatin kaplı plaka üzerine. Bu nedenle, bu besleyici içermeyen farklılaşma elde etmek önemlidir. Bu MEF'lerin verimsiz çıkarılması bir kritik adım HESC yığınlarda çok uzun kuluçka sonuçları ve çok kısa inkübasyon olduğunu. Inkübasyon 45 dakika sonra plaka zaten yerleşmiş MEF'ler ve HESC kümeleri için araştırılmalıdır.
6. MEF'ler eklenmiş sonra, yavaşça plaka daha önce ortam maddesi ile inkübe edildikten sonra rahatsız yıkanarak yapışmayan hücreler (HESC) yıkayın. Birkaç T25 daha fazla hücre elde etmek için kullanılmış olsaydı, tek hücreler artık kombine edilebilir. HESC ortamı ile bir kez yıkayın.
7. Spin hücreleri 500 xg ile 3 dakika, süpernatant kaldırmak ve / ml FGF-2 10 uM ROCK inhibitörü Y-27632 ve 10 ng içeren yaklaşık 4 ml KCM hücreleri yeniden askıya.
8. Tripan mavi kullanarak bir hemositometrede hücreleri saymak. Içeren KCM plakalar kaplı bazal membran matrisi üzerinde Plaka 18 x 10 ³ hücre / cm ² 10 uM ROCK inhibitörü Y-27632 ve10 ng / ml FGF-2 (6 sıra oyuk başına 1.5 ml kullanım için). Bu NEP'lerin içine bunları başarıyla ayırt etmek doğru yoğunluk hücreleri plaka için çok önemlidir.
9. 24 saat sonra, 10 uM ROCK önleyicisi Y-27632 ve 10 ng / ml FGF-2 ihtiva eden taze KCM orta değiştirin. 24 saat daha sonra, 10 ng / ml FGF2 ihtiva eden taze KCM orta değiştirin.
10. Hücrelerin ekim sonra 72 saat, farklılaşma KSR orta yönelik orta değişim başlar. Bu zaman noktası, farklılaşma 0 (DoD0) gün olarak ifade edilir. Test maddelerinin eklenmesi mümkündür.
11. DOD1 ve DOD2 On orta tam DoD0 olduğu gibi değiştirilir. Sonraki orta değişiklik DoD4% 25 N2-S ve% 75 KSR içeren yer almaktadır. DoD6 de farklılaşma durdurulur ve hücreler analizi için hasat edilir.

HESC ve NEP'in 3. Kromatin immünopresipitasyonu (ChIP)

1. Çekirdeklerin hazırlanması
   1. Analiz ve 25 ila 30 dakika süreyle inkübe edilmelidir her 6 kuyuya Accutase 500 ul ekleyin. CouTripan mavisi kullanılarak, bir Neubauer bölmesi nt hücreleri.
   2. Çapraz bağlantısı için DMEM / F12% 1 formaldehit içinde süspanse hücreleri. Çapraz bağ durdurmak için 10 dakika sonra, 125 mM'lik bir son konsantrasyonda Tris pH 7.5 ekleyin.
   3. Spin hücreleri 4 ° C'de 500 xg ile 3 dakika, süpernatant kaldırmak ve soğuk PBS hücrelerin yeniden askıya.
   4. Spin hücreleri 4 ° C'de 500 xg ile 3 dak / 1 x 10 ⁶ hücre tampon L1 1 ml hücreleri, süpernatant kaldırmak ve yeniden askıya.
   5. Buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin. Spin 4 ° C'de 800 x g'de 5 dak, süpernatant kaldırmak ve / 2 x 10 ⁶ hücre tampon L2 1 ml çekirdekleri askıya tekrar.
2. Sonikasyon ve kalite kontrol
   1. 300-700 bp uzunlukta DNA fragmanları oluşturulur, böylece sonikasyon. 4 ° C'de 10,000 x g'de 1 dakika dönerler. Yeni bir tüpe süpernatant aktarın. fragmanlar, aksi takdirde immunoprecipitation verimsiz yanı sıra izlenen qPCR olacak, doğru boyutu olması gerekir.
   2. 50 ul bir kaldır50 ul L2 tamponu d karışımı bir agaroz jel çalıştırarak sonication etkinliğini kontrol etmek için.
   3. 4 saat ve 500 rpm'de 65 ° C'de inkübasyon yoluyla çapraz Ters. Numuneleri 1:% 1.5 agaroz jeli üzerinde Orange G yükleme boyası 5 ve 1 x TBE tampon maddesi içinde 110 V de 45 dakika çalıştırılır. Kontrol fragmanı boyutu (300-700 bp arasında olmalıdır).
3. Kromatin immüno-çökeltmesi
   1. Örnekleri 1 seyreltin: 5 seyreltme tamponu ve kısım içinde IP başına 1 ml silikonlu tüpler içinde.
   2. "Girdi" olarak 4 ° C'de seyreltilmiş kromatin numune (adım 3.3.1) ve deposundan% 5 (hacim) sökün.
   3. Bir döndürücüde 4 ° C 'de spesifik IgG O / N seçim ve antikorlar ile inkübe edin.
   4. Immüno sonra her bir örneğe 50 ul protein A / G sefaroz boncuklar ekleyin. Bir döndürücüde 4 ° C 'de Numuneler 3 saat inkübe edin. 4 ° C'de 1,500 xg ile 1 dakika Spin ve süpernatant kaldırmak.
   5. 1 ml yıkama boncuklar ile yıkayın. Spin 1 dk 1.500 xg'de ile4 ° C ve süpernatant kaldırmak. H adımı tekrarlayın g. 1 ml nihai yıkama tamponu ile yıkayın. Bu doğrudan elüatın miktarını değiştirir çünkü yıkama adımları sırasında, boncuk herhangi kaybetmek olmamalıdır.
   6. Santrifüj 1, 4 ° C'de 1500 x g'de dak ve supernatant çıkarın. 125 ul yıkama tamponu ilave edin ve bir çalkalayıcı üzerinde 1000 rpm'de 65 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
   7. 1,500 xg ile 1 dk Spin ve yeni bir tüp adımı tekrarlayın k ve l süpernatantı aktarın. Girdi (3.3.2) 200 ul elüsyon tamponu ekleyin. Her bir örnek için proteinaz K ve RNaz ekleyin ve bir karıştırıcı üzerinde 500 rpm'de 37 ° C'de 30 dakika inkübe edildi ve ardından 4 saat bir karıştırıcıda 500 rpm'de 65 ° C.
      NOT: DNA ekstraksiyon kullanımı, ticari mevcut ChIP DNA Temiz ve Konsantratörü Kit ³⁸ için.

Sonuçlar

UKK test sistemi Metil civa poz

Sitotoksisite tahlili IC ₁₀ bir değer metil cıva sitotoksisite için (% 10 canlılığı azalma) (Şekil 1) elde etmek üzere H9 EBS ile gerçekleştirildi. Biz de bir mikrodizi tabanlı (affymetrix platformu) biyomarker çalışması gerçekleştirdi. H9 EBS 14 gün boyunca metil civa (0.25 1 uM) maruz kalmıştır. 14. günde numuneler Trizol ile toplanmış ve RNA izole edildi. Transkripsiyonal profilleme İnsan Genom U133 art?...

Tartışmalar

Toksikolojik testler Geleneksel yaklaşımlar dolayısıyla test masraflı ve zaman alıcı hale kapsamlı hayvan çalışmaları içerir. Ayrıca, türler arası farklılıklar nedeniyle klinik öncesi hayvan güvenlik çalışmaları insanlar için uygun potansiyel ilaçların toksisitesi etkilerini tahmin etmek her zaman geçerli değildir. Insan olmayan primatlar, en öngörülebilir, halen etik güçlü ve sosyoekonomik talepleri hızla in vitro testinde hassas ve sağlam gelişen modern toplumlar tarafın...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Knockout Serum Replacement
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	GlutaMAX supplement
NEAA	Life Technologies	11140050	MEM Nonessential Amino Acids Solution
DPBS	Life Technologies	14190-0144	Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium
mTeSR medium	Stemcell Technologies	5850
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
V bottom plate	VWR	734-0483	Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST
V bottom plate lid	VWR	634-0011	Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled Water	Life Technologies	15230-089.	Sterile Distilled Water
Human FGF-2 (bFGF)	Millipore	GF003AF-100UG	Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μm	Millipore	SCGPU02RE	Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
StemPro EZPassageTM Disposablte	Invitrogen	23181010
BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix	Stemcell Technologies	354277	5 ml vial
DMSO	Sigma	D-2650
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7020	It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples.
70 μm Cell Strainer	Becton Dickinson	352350	Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube	Becton Dickinson	352235	5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
50 ml sterile Polypropylene tube	Greiner Bio-One	227261	50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flask	Greiner Bio-One	658175	CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TRIzol	Life Technologies	10296010
96 well optical bottom plates	Thermo Scientific	165305
CellTiter-Blue	Promega	G8081
Accutase	PAA	L11-007
Apotransferin	Sigma-Aldrich	T-2036
Dispase	Worthington Biochemicals	LS002104
Dorsomorphin	Tocris Bioscience	3093
EDTA	Roth	8043.2
FBS	PAA	A15-101
FGF-2	R&D Systems	233-FB
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-100G
GlutaMAX	Gibco Invitrogen	35050-038
HEPES	Gibco Invitrogen	15630-056
Insulin	Sigma-Aldrich	I-6634
Knockout DMEM	Gibco Invitrogen	10829-018
Matrigel	BD Biosciences	354234
Noggin	R&D Systems	719-NG
PBS	Biochrom AG	L1825
Progesteron	Sigma-Aldrich	P7556
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris Biosciences	1254
SB431542	Tocris Biosciences	1614
SDS	Bio-Rad	161-0416
Selenium	Sigma-Aldrich	S-5261
β-Mercaptoethanol	Gibco Invitrogen	31350-010
[header]
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit	Affymetrix	900721, 22, 23	This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays.
Rnase-Free DNase Set	QIAGEN	79254
[header]
List of equipment
Inverted microscope	Olympus		IX71
Genechip Hybridisation Oven - 645	Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450	Affymetrix
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G	Affymetrix
Spectramax M5	Molecular Devices
[header]
List of softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory