Umano cellule staminali pluripotenti Basato Tossicità per lo sviluppo saggi per Chemical Screening e Safety Systems Biology generazione dati

Riepilogo

I protocolli descrivono due sistemi di test in vitro di tossicità dello sviluppo (UKK e UKN1) a base di cellule staminali embrionali umane e studi trascrittoma. I sistemi di test prevedono pericolo tossicità per lo sviluppo umano, e possono contribuire a ridurre studi sugli animali, i costi e il tempo necessario per le prove della sicurezza chimica.

Abstract

Protocolli efficaci per differenziare le cellule staminali pluripotenti umane a vari tessuti in combinazione con le tecnologie omiche aprono nuovi orizzonti per la tossicità in vitro test in di potenziali farmaci. Per fornire una solida base scientifica per tali dosaggi, sarà importante per ottenere informazioni quantitative sul corso tempo di sviluppo e sui sottostanti meccanismi regolatori di approcci biologia dei sistemi. Due saggi sono stati quindi sintonizzati qui per queste esigenze. Nel sistema di test UKK, cellule staminali embrionali umane (hESC) (o altre cellule pluripotenti) sono lasciate per differenziare spontaneamente per 14 giorni in corpi embrionali, a consentire la generazione di cellule di tutte e tre strati germinali. Questo sistema ricapitola passaggi chiave del primo sviluppo embrionale umano, ed è in grado di prevedere in anticipo embrionale tossicità / teratogenicità specifici umano, se le cellule sono esposti a sostanze chimiche durante la differenziazione. Il sistema di test UKN1 si basa sulla differenziazione hESC a un populationi di neuroectodermica progenitore (NEP), le cellule per 6 giorni. Questo sistema ricapitola precoce sviluppo neurale e prevede presto neurotossicità per lo sviluppo e cambiamenti epigenetici innescati da sostanze chimiche. Entrambi i sistemi, in combinazione con studi transcriptome microarray, sono adatti per l'identificazione di marcatori di tossicità. Inoltre, essi possono essere usati in combinazione per generare dati di input per l'analisi dei sistemi biologia. Questi sistemi di prova hanno vantaggi rispetto ai tradizionali studi tossicologici che richiedono grandi quantità di animali. I sistemi di test, possono contribuire ad una riduzione dei costi per lo sviluppo di farmaci e la valutazione della sicurezza chimica. La loro combinazione mette in luce soprattutto sui composti che possono influenzare lo sviluppo neurologico specifico.

Introduzione

La capacità delle cellule staminali embrionali umane (hESC) di differenziarsi in vari tipi di cellule ha aperto una nuova era di tossicità test in vitro ^1, modelli di malattia e della medicina rigenerativa ^2. Le cellule staminali sono dotati della capacità di auto-replicarsi, per mantenere il loro stato pluripotente, e di differenziarsi in cellule specializzate ^3,4. Le proprietà di hESC (capacità di differenziarsi a tutti i principali tipi di cellule) si trovano anche in altre cellule staminali pluripotenti umane, come le cellule umane pluripotenti indotte staminali (hiPSC) o le cellule generate da trasferimento nucleare ^5. Per esempio, molte linee di hESC diverse sono state differenziate in neuroni ^6, cellule renali ^7, cellule della cresta neurale ^8, cardiomiociti ^9-12 o epatociti come le cellule ^13,14. Inoltre, hESC può differenziarsi spontaneamente in cellule di tutti e tre i foglietti embrionali ^15-18 a corpi embrionali (EBS) ^19,20. Esviluppo embrionale arly è regolato da espressione differenziale dei vari geni correlati ai diversi foglietti embrionali che è stato catturato a livello di mRNA da trascrittomica che usano la tecnologia microarray ^15. Questi sforzi hanno portato alla definizione di modelli tossicologici specifici di organi sulla base di hESC / hiPSC e trascrittomica analisi (per la revisione cfr ^21,22). Questi modelli hanno vantaggi rispetto al tradizionale uso di animali da laboratorio per gli studi tossicologici, come studi preclinici utilizzano animali da laboratorio non sono sempre predittivi della sicurezza umana. La tossicità indotti dagli stupefacenti riscontrati nei pazienti sono spesso legati a processi metabolici o di segnalazione che si differenziano tra esseri umani e animali da esperimento. La differenza di specie ha impedito l'affidabile la diagnosi precoce di tossicità sullo sviluppo umano, e per esempio farmaci come talidomide ^23,24 e dietilstilbestrolo ^25,26 sono stati ritirati dal mercato a causa di teratogenicità. ThaliDomide non ha mostrato alcuna tossicità sullo sviluppo nei ratti o topi. Sostanze chimiche ambientali come il mercurio metilico ²⁷ provocato tossicità per lo sviluppo prenatale rispetto al sistema nervoso in varie specie, ma manifestazioni umane sono state difficili da modellare negli animali. Per affrontare il problema dei problemi specie specificità, gli scienziati che lavorano sotto diversi progetti basati sulle cellule staminali come ReProTect, ESNATS, DETECTIVE ecc sono impegnati nello sviluppo di modelli diversi per la tossicità embrionale, neurotossicità, cardiotossicità, epatotossicità e nefrotossicità con sostanze tossiche umani sospettati di interessare l'uomo. Nell'ambito del progetto europeo consorzio 'embrionali Novel strategie di sperimentazione alternative a base di cellule staminali (ESNATS)' sono stati stabiliti cinque sistemi di test. Un sistema di prova il cosiddetto UKK (niversitäts k linikum K OLN U) sistema di test acquisisce parzialmente primi stadi dello sviluppo dell'embrione umano. In questo sistema cellule H9 embrionali umane sono differenziati in tre foglietti embrionali (ectoderma, endoderma e mesoderma) ¹⁵ e foglietto embrionale firme specifici sono stati catturati da trascrittomica profilo utilizzando la piattaforma microarray Affymetrix. Varie sostanze tossiche sviluppo come talidomide ^28, acido valproico, metilmercurio ^16,17, o citosina arabinoside ¹⁵ sono stati testati in questo sistema, e la tossicità specifica firme genici sono stati ottenuti. In un secondo sistema di test, il cosiddetto la (U niversità di K onsta n z) UKN1 sistema di prova 1, cellule H9 sono differenziate alle cellule progenitrici neuroectodermal (NEP) per 6 giorni. Ciò è dimostrato da elevata espressione di marcatori genici neurale come PAX6 e OTX2. Durante la differenziazione per 6 giorni, le cellule NEP sono state esposte a sviluppo neuro-tossici come il VPA, il mercurio metilico. Tossico-specifici profili de-regolato trascrittomica sono stati ottenudefinita come pure utilizzando la piattaforma microarray Affymetrix ^16,29.

La nuova visione per la tossicologia del ^{21 °} secolo, prevede che i sistemi di test non producono non solo descrizioni fenotipiche come istopatologia in vivo, o cambiamenti trascrittoma alla fine di incubazione la tossicità a lungo termine. Suggerisce piuttosto che le analisi forniscono informazioni relative alla meccanica ^3, e che tali informazioni possono essere mappati ai cosiddetti percorsi di outcome avversi (AOP), che forniscono un razionale scientifico per gli effetti pericolosi ^30. Per fornire tali informazioni, i sistemi di test applicati devono essere altamente qualità controllata ^31, come ad esempio documentato da solide procedure operative standard. Inoltre, variazioni dipendenti dal tempo devono essere mappati con alta risoluzione. Ciò richiede sistemi di test con variazioni sincronizzate ^32. I sistemi di test UKN1 e UKK qui descritti sono stati ottimizzati per queste esigenze.

Protocollo

Il seguente protocollo è stato eseguito utilizzando la linea di cellule staminali embrionali umane (hESC) H9. Questa linea cellulare è stata regolarmente coltivati ​​su fibroblasti di topo mitoticamente inattivato embrionali (MEF) in coltura hESC multimediale integrato con bFGF e poi coltivate in mezzi di cellule staminali su 6 centimetri piastre Petri rivestite di matrice membrana basale come matrigel, per sbarazzarsi di MEF. Le cellule H9 di> 80% lastre confluenti sono stati utilizzati per un ulteriore passaggio. Cellule H9 coltivate su piastre di matrice membrana basale sono stati utilizzati per la formazione EBS. Tutte le procedure di cui al seguente protocollo sono state eseguite utilizzando metodi standard per le pratiche di coltura cellulare asettiche e buone.

Parte 1. Sistema di prova UKK

1. embrionali umane Culturing cellule staminali

1. Splitting e manutenzione di H9 su cellule feeder
   1. Pipettare 2 ml di 0,1% di gelatina in ogni cm piastra 6 e incubare per 30 minuti in coltura cellulare incubator (37 ° C e 5% CO _2). Soluzione di gelatina Aspirare con pipetta Pasteur sterile.
   2. Aggiungere 2 ml di mezzo MEF contenente 0,1 x 10 ⁶ cellule / ml MEF nelle due piastre rivestite di gelatina e incubare in coltura cellulare incubatore (37 ° C e 5% CO ₂₎ O / N.
   3. Il giorno successivo, rimuovere le cellule H9 fiala dal serbatoio di azoto liquido con pinze e scongelare il flacone in un bagno di 37 ° C Acque con lunghe pinze.
   4. Rimuovere il flaconcino da bagno di acqua, bagno con il 70% di etanolo, aria secca nell'armadio biosicurezza per 15 a 30 secondi e trasferire le cellule a 15 ml tubo falco.
   5. Aggiungere 9 ml di mezzo di coltura H9 lentamente sulla parete interna e centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min.
   6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 6 ml di terreno di coltura contenente inibitori ROCCIA (10 micron, Y27632) e pipetta delicatamente per mescolare. Aspirare MEF mezzo dalla piastra 6 centimetri e aggiungere sospensione cellulare 3 ml in ogni piatto. Modificare il supporto su day 3 e poi ogni altro giorno. Subculture> 80% delle cellule piatto confluenti con rapporto di divisione 1: 3.
      Nota: Di solito in 5 a 7 giorni piatto diventa confluenti. Alimentatori utilizzati sono ottenuti da CF1 topi embrione e inattivati ​​dall'esposizione alle radiazioni γ.
2. Colture di cellule H9 su piatti matrice membrana basale rivestite
   1. Mezzo di cellule staminali Thaw (5x) supplemento a temperatura ambiente ed aggiungere 100 ml in 400 ml di terreno di base in cabinet biosicurezza.
   2. Disgelo matrice membrana basale su ghiaccio. Aggiungere il volume consigliato di matrice membrana basale (fare riferimento al certificato di analisi per ciascun lotto) in 24 ml refrigerati DMEM / F-12 a medio basale per dodici 6 piatti cm. Mescolare pipettando su e giù.
   3. Aggiungere 2 ml in ogni piatto 6 centimetri. Mantenere la piastra a temperatura ambiente per 1 ora. Rimuovere il supporto e aggiungere 2 ml di terreno di cellule staminali.
   4. Estrarre quattro piatti H9 confluenti sul MEF. Rimuovere le colonie differenziati con 1 ml di punta della pipetta sotto stereomicroscopio conservati in armadio biosicurezza.
   5. Aspiraremedio e lavare le cellule con 4 ml di PBS e aggiungere 2 ml staminali medio di cellule in ogni piatto. Tagliare le colonie indifferenziate che possiedono 26 ago G per 6-9 pezzi ciascuno.
   6. Raccogliere delicatamente le cellule in tubo da 50 ml falco. Centrifugare a 200 xg per 5 min.
   7. Aspirare il supernatante e risospendere in 12 ml staminali medio cellule. Contare le macchie mettendo 20 ml su vetrino sotto il microscopio e regolare il volume per 150 ciuffi per ml. Aggiungere 2 ml di sospensione in ciascuna piastra 6 CM.
   8. Spostare le piastre avanti e indietro e da lato a lato proposte di distribuzione ciuffo uniforme ed incubare le piastre in coltura cellulare incubatore (37 ° C e 5% CO _2).
   9. Rimuovere le colonie differenziati e dare supporto cambio a giorni alterni.

2. corpi embrionali (EBS) Formazione

Eseguire tutte le procedure di seguito indicate secondo le precauzioni asettiche e nell'armadio biosicurezza.

1. Day 0 & #8212; Placcatura di cellule H9 su piastre inferiori V
   1. Preparare copolimero a blocchi del 5% come Pluronic F 127 in PBS e filtrare attraverso il sistema di filtrazione a vuoto spinto con 0,22 micron filtro sterile.
   2. Cappotto V fondo 96 pozzetti con 40 ml di copolimero a blocchi del 5% per pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 45 min.
   3. Rimuovere le piastre di matrice membrana confluenti seminterrato con celle H9 da incubatore e rimuovere le colonie differenziati con 1 ml di punta della pipetta sotto stereomicroscopio in cabinet biosicurezza.
   4. Aspirare il mezzo e lavare le cellule con 4 ml di PBS. Aggiungere 2 ml di media differenziazione casuale (H9 medie cultura senza bFGF, RD media) in ogni piatto. Utilizzare lo strumento passaggio e tagliare le colonie di cellule H9 in ciuffi di forma e dimensione uniformi osservando sotto stereomicroscopio in cabinet biosicurezza e poi raschiare delicatamente con il raschietto cella.
   5. Raccogliere le macchie in tubo da 50 ml falco e centrifugare a 200 xg per 5 min. Aspirare il supernatante e risospendere il cell in media RD per ottenere 1,000 grumi per ml.
   6. Aspirare il copolimero a blocchi da lastre V di fondo. Versare i cespi in sterili piastra quadrata e con l'aiuto di pipetta multicanale aggiungere 100 ml di sospensione in ciascun pozzetto della V piastra inferiore.
   7. Per l'aggregazione forza di grumi, centrifugare le piastre V inferiore a 4 ° C per 4 min a 400 x g. Incubare le piastre a colture cellulari incubatore (37 ° C e 5% CO ₂₎ per quattro giorni.
2. Giorno 4 - Raccolta di EBs
   1. Raccogliere i EBs nella piastra quadrata sterile da piastre di fondo V utilizzando pipetta multicanale e in largo foro 200 microlitri suggerimenti.
   2. Raccogliere le EBs da sterili piastra quadrata in 15 ml di tubo falcon con 10 ml di sterile pipetta sierologica. Lasciare EBS riposare per 2 minuti. Aspirare il surnatante e lavare i corpi elementari con 5 ml di PBS.
   3. Lasciare EBS di stabilirsi per 2 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere EB in media 5 ml RD.
   4. Pipetta out 10 ml di mezzo RD a 10 centimetriPiastre batteriologiche. Trasferire i EBs a 10 centimetri piatti batteriologiche.
   5. Incubare le piastre batteriologici su agitatore orizzontale (movimento pendolamento 50 / min) mantenuti in coltura cellulare incubatore (37 ° C e 5% ₂ CO) per il periodo di tempo richiesto. Dare cambiamento medio (15 ml medio RD) a giorni alterni.
      Nota: è necessario manipolazione delicata durante la coltura hESC. La dimensione del EBs varia in giorno 4. Selezionare i EBs dimensioni uniformi (± 20%), osservando sotto stereomicroscopio per ulteriori esperimenti. Circa 50% EBs formate con questo metodo sono di dimensioni uniformi. Il trasferimento di EBS su risultati shaker in forma regolare.

3. citotossicità test per IC ₁₀ Determinazione

1. Trasferimento di EBS su piastre di fondo ottici
   1. Scongelare 0,1% di gelatina in bagno d'acqua a 37 ° C per 15 min e rivestire piastre inferiori ottici con 50 ml di 0,1% di gelatina per pozzetto usando pipetta multicanale. Incubare le piastre a temperatura ambiente per45 min. Dopo l'incubazione aspirare il gelatina da piastre inferiori ottici.
   2. Uccidete i EBs raccolti il ​​giorno 4 in 10 cm Piatto batteriologico contenenti terreno RD.
   3. Tenere piastre di fondo ottici in posizione inclinata in cabinet biosicurezza. Trasferimento due dimensioni uniformi di EB in 100 microlitri medio RD per bene in fondo 96 pozzetti ottico osservando sotto stereomicroscopio. Mantenere 12 ^° colonna vuota.
   4. Incubare le piastre a colture cellulari incubatore (37 ° C e 5% CO ₂₎ per 24 ore.
2. Esposizione al farmaco di giorno in giorno 5 14
   1. Pesare il composto in esame e rendere più alta concentrazione in solvente nota.
   2. Eseguire diluizione a metà logaritmica del composto in esame in serie fino a 8 diluizioni nel solvente contenenti tubi falco numerati con A alla H, tenere tubo no. Io come controllo del veicolo, tubo no. J come controllo negativo (media RD) e tubo no. K come positivo di controllo (70% etanolo).
   3. Scongelare il medium RD a bagnomaria a 37° C per 15 min. Estrarre 5 ml RD media ogni in 11 tubi falco sterili etichettate da 1 a 11.
   4. Trasferimento 5 ml di soluzione da tubo A al tubo K in a tubo da 1 a 11, rispettivamente, e vortex i tubi. Estrarre la piastra inferiore ottica dal termostato e rimuovere con attenzione il supporto con l'uso di una pipetta multicanale.
   5. Aggiungere 200 pl di supporto dal numero tubo 1 a 11 nelle rispettive colonne della piastra inferiore ottica. Dare cambiamento / farmaco medio a giorni alterni.
      Nota: per diluizioni half-logaritmica prendono 6,48 ml di solvente in 7 tubi etichettati da 2 a 8. Da più alti tubo concentrazione di trasferimento n ° 1 di 3 ml di n ° 2 tubi, vortice e in serie trasferire 3 ml di tubo successivo. Mantenere tubo No.9 per il controllo del veicolo e tubo n.10 per il controllo negativo. Tubo n.11 è del 70% di etanolo.
3. Misurazione dell'esposizione resazurina e fluorescenza: 14 giorni
   1. Media RD Scongelare in bagno d'acqua a 37 ° C per 15 minuti. Eseguire tutte le procedure mention seguito in assenza di luce nell'armadio biosicurezza.
   2. Prendere medio 10 ml RD in 15 ml di tubo (A) e aggiungere il volume consigliato di reagente resazurina e mescolare pipettando. Estrarre la piastra inferiore ottica dal termostato e rimuovere con attenzione tutte di medie con la pipetta multicanale.
   3. Aggiungere 100 ml di mezzo dalla metropolitana A in ciascun pozzetto. Incubare la piastra in coltura cellulare incubatore (37 ° C e 5% CO ₂₎ per 90 min.
   4. Misurare la fluorescenza mediante spettrofotometro (560 _Ex / 590 _Em).
4. IC ₁₀ determinazione del valore
   1. Importare i valori sul grafico pad prisma dopo aver sottratto i valori del bianco. Set asse x come dose e y come una unità di fluorescenza.
   2. Normalizzare i valori per ottenere percentuale sull'asse y e trasformare i valori (asse X come scala logaritmica). Calcola _IC50 valore utilizzando risposta sigmoidale dosi (pendenza variabile) parametro. Calculate log IC ₁₀ valori utilizzando seguenteequazione:
      F = 10 logEC ₅₀ = logECF - (1 / versante) * log (F / (100-F))
      Y = inferiore + (Alto-Basso) / (1 ​​+ 10 ^ ((LogEC ₅₀ -X) * versante))
   3. Determinare i valori di IC ₁₀ da prendere per ulteriori studi.

4. Biomarker studio basato su Microarrays

1. Giorno 0 a giorno 5:
   1. Formazione corpo embrionali e il trasferimento a 10 cm di piatti batteriologici - seguire i passi di cui al punto 2 per la formazione del corpo embrioide.
      Nota: Utilizzare tre repliche biologiche per ogni studio. Dividete ogni replica in due parti biologico - Il trattamento farmacologico a IC ₁₀ concentrazione e il controllo del veicolo. Preparare concentrazione di farmaco 10.000 volte sopra la concentrazione IC ₁₀ in veicoli e da questo componente aggiuntivo 10 ml e 100 ml di media RD con grumi di cellule H9 in tubo da 50 ml Eppendorf mescolare bene e sementi su piastre V fondo. Seguire la stessa procedura per il gruppo di controllo del veicolo.
2. Per l'esposizione di droga al giorno 5 a 14, raccogliere i EB's e trasferirli in 10 centimetri piatti batteriologici il giorno 4 come per le operazioni di cui al punto 2. Trasferire le piastre sul agitatore orizzontale (pendolamento movimento 50 / min) a colture cellulari incubatore (37 ° C e 5% CO ₂₎ per 14 giorni. Dare medio cambio a giorni alterni.
3. Per la raccolta del campione, il giorno 14, raccogliere EBS da lastre 10 centimetri per 15 ml di tubo falcon con sterile pipetta sierologica. Lasciare EBS riposare per 2 minuti. Aspirare il surnatante e lavare i corpi elementari con 5 ml di PBS. Lasciare EBS di stabilirsi per 2 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere EB in soluzione RNAlater 1 ml o reagente TRIzol, vortex e conservare il campione a -80 ° C fino a ulteriori elaborazioni.
   Nota: Eseguire tutte le procedure in cabinet biosicurezza secondo le buone pratiche di laboratorio. Ruotare le piastre in movimento circolare intorno al centro di portare tutti EB nel centro, aspirare il terreno dal circostante con l'aiuto di sterili pastu vetrore pipetta, aggiungere 15 ml di mezzo RD e poi aggiungere 15 ml di droga / veicolo per rispettivo gruppo.

5. RNA Isolamento e Verifica integrità

1. RNA Isolation:
   La maggior parte dei passaggi riportati di seguito devono essere eseguite per la purificazione di RNA utilizzando RNeasy Mini Kit secondo il manuale di istruzioni. Usare sempre tubi priva di nucleasi, puntali e acqua. Mentre si lavora con TRIzol effettuare tutte le procedure in cappuccio della sicurezza chimica ed indossare occhiali protettivi e guanti protettivi.
   1. Scongelare i campioni sul ghiaccio. Se i campioni sono conservati in soluzione RNAlater, centrifugare le provette a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e aggiungere 1 ml di TRIzol reagente.
   2. Triturare i campioni utilizzando 24 ago G e 1 siringa ml. Circa 15 volte triturazione è sufficiente per la rottura di EB, parete cellulare e le membrane plasmatiche.
   3. Aggiungere 200 ml di cloroformio in ogni campione. Vortex per mescolare il contenuto in modo uniforme. Centrifugaa 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. Rimuovere le RNeasy mini colonne di rotazione, provette da 1,5 ml ed etichettare in modo corretto.
   4. Raccogliere il surnatante in provette da 1,5 ml (Mentre la raccolta di surnatante non disturbare la metà o livello di fondo). Aggiungere uguale volume di freddo il 70% di etanolo. Mescolare il contenuto da un leggero scuotimento.
   5. Applicare 700 microlitri dai tubi per rispettive colonne mini centrifuga e centrifugare a 12.000 xg per 20 secondi a temperatura ambiente. Eseguire tutti gli ulteriori passi a temperatura ambiente.
   6. Eliminare il filtrato e applicare la soluzione rimanente per rispettive colonne e centrifugare a 12.000 xg per 20 sec. Eliminare il filtrato.
   7. Applicare 350 microlitri di tampone RW1 alla colonna e centrifugare a 12.000 xg per 20 sec. Eliminare il filtrato e applicare 10 ml di DNAsi e 70 microlitri di buffer RDD alla colonna.
   8. Incubare a temperatura ambiente per 15 min. Applicare 350 microlitri di tampone RW1 alla colonna e centrifugare a 12.000 xg per 20 sec. Eliminare il filtrato. Applicare 500 ml diRPE Wash Buffer alla colonna e centrifugare a 12.000 g per 20 sec. Eliminare il filtrato. Ancora Applicare 500 microlitri di tampone di lavaggio RPE alla colonna e centrifugare a 12.000 xg per 2 min. Eliminare il filtrato.
   9. Spostare le colonne da 2 ml nuovi tubi di raccolta e centrifugare a 12.000 g per 1 min. Trasferire le colonne per etichettata tubo di raccolta da 1,5 ml e applicare 22 ml di acqua priva di nucleasi. Centrifugare le provette a 12.000 g per 1 min.
   10. Rimuovere il tubo di raccolta e metterli sul ghiaccio. Quantificare l'RNA utilizzando il sistema automatizzato di elettroforesi.
2. Concentrazione di RNA, purezza e test di integrità.
   Per RNA purezza e l'integrità sperimentazione dell'uso sistema automatico di elettroforesi e relativo kit di ^33.

6. microarray Studi

1. Eseguire profiling trascrizionale usando commerciali disponibili chip a matrice umani. Per la preparazione di RNA bersaglio, la frammentazione, l'ibridazione ³⁴ e la matriceChip colorazione, lavaggio ³⁵ utilizzare i kit commerciali disponibili.
2. Eseguire la scansione di chip array e controllo di qualità, utilizzando stazione fluidica standard, scanner di matrice e software di funzionamento standard ^36. Per l'analisi dell'espressione genica importare i file generati da scanner al commerciale disponibile software standard ^37, eseguire la correzione di fondo, riepilogo e la normalizzazione con robusta multi-array Analysis (RMA).
3. Per ottenere l'elenco dei geni differenzialmente espressi (di DEG) eseguire una maniera analisi ANOVA. Da questo elenco filtrare i geni basati sul cambiamento piega (± 2) e p-value FDR controllato (<0,05). Ottenere l'Analisi delle Componenti Principali (PCA), Mappa di calore, ecc utilizzando questo software.

Parte del sistema 2. UKN 1 test

1. Manutenzione di hESC

1. Semina di MEF
   1. Per la differenziazione utilizzare la NSCB # 8534 (H9) linea cellulare. Cultura cells su fibroblasti embrionali di topo (MEF) come cellule di alimentazione. Coat beuta T25 con 4 ml di 0,1% di gelatina e incubare per 30 min a 37 ° C.
   2. MEF Scongelare a 37 ° C bagnomaria e trasferire le cellule in pre-riscaldato DMEM / 10% FBS.
   3. Spin 3,5 min con 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule per ottenere 1 x 10 ⁷ cellule / ml. MEF piastra 4 x 10 ⁴ / cm ² in fusti T25 in gelatina. Facoltativamente, utilizzare i MEF per i prossimi due giorni. Qualità dei lotti MEF sono un problema molto critico per la manutenzione hESC. Pertanto è opportuno chiarire la migliore azienda e metodo di preparazione per le cellule H9. Usiamo PMEF P3.
2. Divisione e manutenzione di H9
   1. Aggiungere 1 ml dispasi pre-riscaldato per T25 pallone H9 e incubare 9 min a 37 ° C.
   2. Aggiungere 2 ml lavano medio dispasi cellule trattate e pipetta 5 volte su e giù con 5 ml di pipetta e soluzione di cellule trasferimento in un tubo falco.
   3. Sciacquare il pallone con 9 ml lavare medioe aggiungere celle agli altri. Spin 3,5 min con 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere cellule in terreno 10 ml hESC.
   4. Spin 3,5 min con 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in media 4 ml hESC. Aggiungere 0,5 ml di sospensione cellulare e 4,5 ml di mezzo hESC e la piastra in una nuova (PBS lavato) pallone T25 con MEF. Cambiare intera media hESC (5 ml) del pallone ogni giorno.

2. La differenziazione di hESC nei confronti delle cellule progenitrici neuroectodermico (NEP)

1. Preparare media hESC e KCM medio. Coat un piatto 10 centimetri di gelatina (0,1% in PBS) per bombola T25 e incubare per 30 min a 37 ° C. Rimuovere media da hESC e aggiungere abbastanza accutase a coprire tutto il fondo del pallone (1 ml per beuta T25) e incubare 25 a 30 min a 37 ° C.
2. Preparare piatti rivestiti matrice membrana basale durante accutase incubazione. Aggiungere freddo DMEM / F12 per congelato pellet matrice membrana basale e risolverlo 1:20. Filtrare solu matrice membrana basalezione attraverso un colino cella di 40 micron. Aggiungi soluzione filtrata al piatto, tutto il fondo deve essere coperta (1 ml per 6 pozzetti è richiesta) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
3. Dopo il periodo di incubazione rimuovere il surnatante matrice membrana basale e le cellule di semi sui pozzetti rivestiti. Dopo il punto accutase (2.1) arrestare la reazione mediante aggiunta di 1,5 ml HES medie. Raschiare le cellule dal pallone, aggiungere 8 ml di mezzo hESC e produrre una soluzione di singole cellule pipettando 10 ml pipetta a fondo. Celle filtranti attraverso un colino cella di 40 micron.
4. Celle Spin 3 min con 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di hESC. Celle Spin ancora 3 minuti con 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in hESC contenenti inibitori ROCCIA Y-27632 ad una concentrazione finale di 10 micron.
5. Rimuovere il surnatante di piatto di gelatina rivestito. Sospensione cellulare piastra sul piatto di gelatina rivestito per rimuovere le MEF e lasciare in incubatrice per esattamente 1 ora.
   NOTA: Durante questa fase i MEF volontàEttle sul piatto di gelatina rivestita, mentre il hESC non potrà allegare alla gelatina. Quindi questo è fondamentale per ottenere una differenziazione senza alimentatore. Si tratta di un passo fondamentale come troppo a lungo i risultati di incubazione a ciuffi hESC e troppo breve incubazione nella rimozione inefficiente del MEF. Dopo 45 minuti di incubazione la piastra deve essere indagato per MEF già insediati e ciuffi hESC.
6. Quando i MEF hanno attaccato, lavare delicatamente le cellule non aderenti (hESC) dopo incubazione con il mezzo già nel piatto. Se più T25 sono stati utilizzati per ottenere più cellule, singole cellule ora possono essere combinate. Lavare la piastra una volta con il mezzo hESC.
7. Celle Spin 3 min con 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in circa 4 ml KCM contenenti inibitori ROCCIA 10 micron Y-27632 e 10 ng / ml FGF-2.
8. Contare le celle in un emocitometro utilizzando Trypan blu. Piastra 18 x 10 ³ cellule / cm ² di matrice membrana basale piastre rivestite in KCM contenenti inibitori ROCCIA 10 micron Y-27632 e10 ng / ml FGF-2 (per 6 ben utilizzare 1,5 ml per pozzetto). E 'fondamentale per placcare le cellule della giusta densità di differenziarsi con successo in NEP.
9. Dopo 24 ore, cambiare mezzo di KCM fresco contenente 10 pM inibitore ROCK Y-27632 e 10 ng / ml FGF-2. Dopo ulteriori 24 ore, cambiare mezzo di KCM fresco contenente 10 ng / ml FGF2.
10. 72 ore dopo la semina delle cellule, differenziazione inizia dal cambiamento medio verso KSR medio. Questo punto di tempo viene definito come giorno di differenziazione 0 (DoD0). L'aggiunta delle sostanze in esame è possibile ora.
11. Su DOD1 e DOD2 il mezzo è cambiato esattamente come su DoD0. Successivo medio cambiamento è in DoD4 contenente il 25% N2-S e il 75% KSR. Al DoD6 la differenziazione viene arrestato e le cellule vengono raccolti per l'analisi.

3. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di hESC e NEP

1. Preparazione di nuclei
   1. Aggiungere 500 microlitri accutase per ogni 6 bene che deve essere analizzato e incubare per 25 a 30 min. Coucellule NT in una camera di Neubauer utilizzando Trypan blu.
   2. Risospendere le cellule in 1% di formaldeide in DMEM / F12 per incrociato. Aggiungere Tris pH 7,5 ad una concentrazione finale di 125 mM dopo 10 minuti per fermare la reticolazione.
   3. Celle Spin 3 min con 500 xg a 4 ° C, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in PBS freddo.
   4. Cellule Spin 3 min con 500 xg a 4 ° C, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml L1- tampone / 1 x 10 ⁶ cellule.
   5. Incubare per 5 min in ghiaccio. Spin 5 min a 800 xg a 4 ° C, rimuovere il surnatante e risospendere nuclei in 1 ml tampone L2 / 2 x 10 ⁶ cellule.
2. Sonicazione e controllo qualità
   1. Sonicare così vengono generati che frammenti di DNA di lunghezza 300-700 bp. Spin 1 min con 10.000 xg a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. I frammenti devono avere la dimensione corretta, altrimenti la immunoprecipitazione sarà inefficace come pure la qPCR seguito.
   2. Rimuovere 50 ml und mix con 50 microlitri di buffer L2 per verificare l'efficienza di sonicazione eseguendo un gel di agarosio.
   3. Reverse reticolare mediante incubazione a 65 ° C per 4 ore e 500 rpm. Caricare i campioni 1: 5 con Orange G loading dye su un gel di agarosio 1,5% e corrono 45 min a 110 V in 1x tampone TBE. Controllo dimensione del frammento (dovrebbe essere compreso tra 300-700 bp).
3. Immunoprecipitazione della cromatina
   1. Diluire i campioni 1: 5 in tampone di diluizione e aliquota 1 ml per IP in provette siliconate.
   2. Togliere 5% (in volume) di campione diluito cromatina (passaggio 3.3.1) e conservare a 4 ° C come "input".
   3. Incubare i campioni con anticorpi di vostra scelta e con aspecifica IgG O / N a 4 ° C su un rotatore.
   4. Aggiungere 50 ml Protein-A / G Sepharose perline per ogni campione dopo immunoprecipitazione. Incubare campioni 3 ore a 4 ° C su un rotatore. Spin 1 min con 1500 xga 4 ° C e rimuovere il surnatante.
   5. Lavare con lavaggio perline 1 ml. Spin 1 min con 1500 xga4 ° C e rimuovere il surnatante. Ripetere il passaggio g di h. Lavare con 1 ml tampone di lavaggio finale. Durante le fasi di lavaggio non si dovrebbe perdere nessuna delle perline, perché questo altera la quantità di eluato direttamente.
   6. Centrifugare 1 min con 1500 xga 4 ° C e rimuovere il surnatante. Aggiungere 125 microlitri tampone di eluizione e incubare 15 min con 65 ° C a 1000 rpm su un agitatore.
   7. Spin 1 min con 1.500 xg e trasferire il surnatante in un nuovo passo k tubo Ripeti e l. Aggiungere 200 microlitri tampone di eluizione di ingresso (3.3.2). Aggiungere Proteinasi K e RNase a ciascun campione e incubare 30 min con 37 ° C a 500 rpm su un agitatore e dopo 4 ore con 65 ° C a 500 rpm su un agitatore.
      NOTA: Per l'estrazione del DNA uso commerciale disponibile ChIP DNA Pulire e concentratore Kit ^38.

Risultati

Esposizione al mercurio metile in sistema di prova UKK

Il saggio di citotossicità è stata eseguita con H9 EBs per ottenere un valore di IC ₁₀ (riduzione della vitalità del 10%) per la citotossicità di metilmercurio (Figura 1). Abbiamo anche eseguito un microarray basato (piattaforma Affymetrix) studio biomarker. La H9 EBs sono stati esposti al mercurio metilico (0.25 e 1 micron) per 14 giorni. Il giorno 14, i campioni sono stati raccolti utilizzando TRIzol e R...

Discussione

Gli approcci tradizionali alla sperimentazione tossicologica coinvolgono ampi studi su animali rendendo così i test costoso e richiede tempo. Inoltre, a causa delle differenze interspecie gli studi sulla sicurezza animale preclinici non sono sempre validi per prevedere effetti di tossicità di potenziali farmaci rilevanti per gli esseri umani. Anche se i primati non umani sono più prevedibili, ancora forte etica, e le richieste socioeconomiche sono rapidamente alzando dalla società moderne per sviluppare sensibili e ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Knockout Serum Replacement
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	GlutaMAX supplement
NEAA	Life Technologies	11140050	MEM Nonessential Amino Acids Solution
DPBS	Life Technologies	14190-0144	Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium
mTeSR medium	Stemcell Technologies	5850
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
V bottom plate	VWR	734-0483	Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST
V bottom plate lid	VWR	634-0011	Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled Water	Life Technologies	15230-089.	Sterile Distilled Water
Human FGF-2 (bFGF)	Millipore	GF003AF-100UG	Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μm	Millipore	SCGPU02RE	Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
StemPro EZPassageTM Disposablte	Invitrogen	23181010
BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix	Stemcell Technologies	354277	5 ml vial
DMSO	Sigma	D-2650
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7020	It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples.
70 μm Cell Strainer	Becton Dickinson	352350	Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube	Becton Dickinson	352235	5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
50 ml sterile Polypropylene tube	Greiner Bio-One	227261	50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flask	Greiner Bio-One	658175	CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TRIzol	Life Technologies	10296010
96 well optical bottom plates	Thermo Scientific	165305
CellTiter-Blue	Promega	G8081
Accutase	PAA	L11-007
Apotransferin	Sigma-Aldrich	T-2036
Dispase	Worthington Biochemicals	LS002104
Dorsomorphin	Tocris Bioscience	3093
EDTA	Roth	8043.2
FBS	PAA	A15-101
FGF-2	R&D Systems	233-FB
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-100G
GlutaMAX	Gibco Invitrogen	35050-038
HEPES	Gibco Invitrogen	15630-056
Insulin	Sigma-Aldrich	I-6634
Knockout DMEM	Gibco Invitrogen	10829-018
Matrigel	BD Biosciences	354234
Noggin	R&D Systems	719-NG
PBS	Biochrom AG	L1825
Progesteron	Sigma-Aldrich	P7556
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris Biosciences	1254
SB431542	Tocris Biosciences	1614
SDS	Bio-Rad	161-0416
Selenium	Sigma-Aldrich	S-5261
β-Mercaptoethanol	Gibco Invitrogen	31350-010
[header]
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit	Affymetrix	900721, 22, 23	This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays.
Rnase-Free DNase Set	QIAGEN	79254
[header]
List of equipment
Inverted microscope	Olympus		IX71
Genechip Hybridisation Oven - 645	Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450	Affymetrix
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G	Affymetrix
Spectramax M5	Molecular Devices
[header]
List of softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory