化学物質安全性のスクリーニングおよびシステム生物学データの生成のために発生毒性アッセイベースのヒト多能性幹細胞

要約

プロトコルは、ヒト胚性幹細胞およびトランスクリプトーム研究に基づいて、2つのin vitro発生毒性試験システム（UKKとUKN1）を記述します。試験系は、ヒトの発生毒性の危険性を予測し、動物実験、コストおよび化学安全性試験のために必要な時間を短縮するために寄与することができます。

要約

-omics技術と組み合わせて、様々な組織にヒト多能性幹細胞を区別するための効率的なプロトコルは、潜在的な薬剤のインビトロ毒性試験のための新しい展望を開きます。このようなアッセイのための強固な科学的基礎を提供するためには、開発の時間経過にとシステム生物学のアプローチにより、基礎となる調節機構の定量的な情報を得ることが重要となります。 2つのアッセイは、したがって、これらの要件のためにここに調整されています。 UKK試験システムでは、ヒト胚性幹細胞（hESCの）（または他の多能性細胞）が自然にすべての3つの胚葉の細胞の生成を可能にするために、胚様体における14日間分化するように残されます。このシステムは、初期ヒト胚発生の重要なステップを再現すると、細胞が分化の間の化学物質にさらされている場合には、ヒト特異的な初期胚毒性/催奇形性を予測することができます。 UKN1試験システムはpopulatに分化するヒトES細胞に基づいています6日間の神経外胚葉前駆（NEP）は、細胞のイオン。このシステムは、初期の神経発達を再現すると、初期の発達神経毒性と化学物質によって引き起こさエピジェネティックな変化を予測します。両方のシステムは、トランスクリプトームのマイクロアレイ研究と組み合わせて、毒性のバイオマーカーを同定するのに適しています。さらに、それらはシステム生物学の分析のための入力データを生成するために組み合わせて使用​​することができます。これらの試験系は、動物を大量に必要とする伝統的な毒性試験を超える利点を有します。試験システムは、薬物開発及び化学物質安全性評価のためのコストの低減に寄与し得ます。それらの組み合わせは、特に具体的に神経発達に影響を与える可能性がある化合物に光を投げかけて。

概要

細胞の様々なタイプに分化するヒト胚性幹細胞（hESCの）の能力は、in vitro毒性試験^1、疾患のモデリングおよび再生医療²の新時代を開きました。幹細胞はそれらの多能性状態を維持するために、および特殊化した細胞^3,4に分化するように、自己複製する能力に恵まれています。ヒトES細胞（全ての主要な細胞型に分化する能力）の特性はまた、核移植⁵によって生成されたヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）または細胞などの他のヒト多能性幹細胞に見出されます。例えば、多くの異なるhESC株は、ニューロン^6、腎細胞^7、神経堤細胞^8、心筋^9-12、またはセル^13,14のような肝細胞に分化されています。また、ヒトES細胞は自発的に胚様体^{（EB）19,20}内のすべての3つの胚葉^15-18の細胞に分化することができます。 Eアーリー胚発生は、マイクロアレイ技術^15を用いてトランスクリプトによってmRNAレベルで捕捉された異なる胚葉に関連する種々の遺伝子の差次的発現により調節されます。これらの努力は、ヒトES細胞/ hiPSCとトランスクリプトーム解析（レビューのために^21,22を参照）に基づいて、器官特異的毒性学的モデルの確立をもたらしました。実験動物を用いた前臨床研究は、常に人間の安全性の予測ではないように、これらのモデルは、毒性学的研究のための実験動物の伝統的な使用上の利点を有しています。患者に遭遇する薬剤誘発される毒性は、多くの場合、ヒトと実験動物の間で異なる代謝またはシグナル伝達プロセスに関連しています。種の違いは、ヒトにおける発生毒性の信頼性の早期検出を防止していて、例えば、そのようなサリドマイド^23,24およびジエチル^25,26のような薬剤は、催奇形性のために市場から撤退しました。ターリーdomideは、ラットまたはマウスのいずれかの発生毒性を示されていません。例えば、メチル水銀²⁷などの環境化学物質は、種々の種における神経系に対する出生前発生毒性をもたらしたが、人間の症状は動物でモデル化することは困難でした。種特異性の問題の問題に対処するために、別のプロジェクトの下で働く科学者などに疑われる人の毒物を使用して、胚毒性、神経毒性、心毒性、肝毒性および腎毒性のために、異なるモデルの開発に従事している再保護、ESNATS、探偵のような幹細胞に基づきます人間に影響を与えます。欧州コンソーシアムプロジェクト「胚性幹細胞ベースの新しい代替試験戦略（ESNATS）」の下では5個の試験システムが確立されています。一つの試験システム、いわゆるUKK（UniversitätsK linikum K OLN）テストシステムは、部分的に初期ヒト胚発生をキャプチャします。このS INystemヒト胚性H9細胞は^、15および胚葉特定の署名がアフィメトリクスマイクロアレイプラットフォームを使用して、トランスクリプトミクスプロファイルによって撮影された三胚葉（外胚葉、内胚葉および中胚葉）に区別されます。サリドマイド^28、バルプロ酸、メチル水銀^16,17、またはシトシンアラビノシド¹⁵のような種々の発生毒性物質は、このシステムで試験されている、及び毒物特定の遺伝子シグネチャーが得られました。第二の試験システムでは、そのように検査システム1 UKN1（K onsta N Z のU niversity）と呼ばれる、H9細胞を6日間神経外胚葉前駆細胞（NEP）に区別されます。これは、PAX6とOTX2などの神経遺伝子マーカーの高発現によって証明されている。6日間分化の間に、NEP細胞は、VPA、メチル水銀などの発達神経毒性物質にさらされています。毒物固有の脱規制トランスクリプトミクスプロファイルはobtaiされていますアフィメトリクスマイクロアレイプラットフォーム^16,29を用いて、同様に定義さ。

21 ^世紀の毒物学のための新しいビジョンは、テスト·システムにのみ、長期的な毒物のインキュベーションの最後に、in vivoで組織病 ​​理学、またはトランスクリプトームの変化のような表現型の説明が得られていないことを想定しています。むしろアッセイは機構的情報^3、およびこの情報は危険な影響³⁰のための科学的根拠を提供し、いわゆる有害転帰の経路（AOP）にマッピングすることができることを提供することを示唆しています。このような情報を提供するために、適用されるテストシステムは非常に質が強固な標準操作手順によって文書として例えば^、31を制御する必要があります。また、時間依存性の変化は、高分解能でマッピングされる必要があります。これは、同期の変化³²とテストシステムを必要とします。ここで説明UKN1とUKKテストシステムは、これらの要件のために最適化されています。

プロトコル

以下のプロトコルは、ヒト胚幹細胞株（hESCの）H9を用いて行きました。この細胞株は、日常のhESC培養培地中の有糸分裂不活性化されたマウス胚繊維芽細胞（MEF）のbFGFを補充したMEFを取り除くために、このようなマトリゲルとして基底膜マトリックスでコーティングされた6センチメートルペトリ皿上の幹細胞培地で培養上で培養しました。 > 80％コンフルエントなプレートからのH9細胞を、さらなる継代のために使用しました。基底膜マトリックスプレート上で培養したH9細胞がEBを形成するために使用しました。以下のプロトコルに記載されたすべての手順は、無菌かつ良好な細胞培養の実践のための標準的な方法を用いて行われてきました。

その1 UKKテストシステム

1.ヒト胚性幹細胞の培養

1. 分割およびフィーダー細胞上のH9のメンテナンス
   1. それぞれを6cmプレートにピペット2ミリリットルの0.1％ゼラチンとは、細胞培養incubで30分間インキュベートレータ（37℃、5％CO _2）。滅菌パスツールピペットで吸引しゼラチン溶液。
   2. 2ゼラチンコーティングしたプレートに0.1×10 ⁶のMEF細胞/ mlを含む2ミリリットルMEF培地を加え、細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）O / Nでそれらをインキュベートします。
   3. 翌日、H9細胞は鉗子を用いて、液体窒素貯蔵タンクからバイアル長い鉗子を使用して37℃の水浴中でバイアルを解凍取り除きます。
   4. 、水浴からバイアルを取り外し、70％エタノールと一緒にお風呂にそれを、15〜30秒間バイオセーフティキャビネット内の空気乾燥し、そして15mlのファルコンチューブに細胞を移します。
   5. 内壁にゆっくりH9培地9 mlを加え、5分間200×gで細胞を遠心します。
   6. 吸引し上清とROCK阻害剤（10μM、Y27632）を含む6ミリリットルの培養液中で再懸濁細胞と穏やかに混合するピペット。を6cmプレートから吸引除去MEF培地および各プレートに3ミリリットルの細胞懸濁液を追加します。 D上の培地を変更AY 3、その後、一日おきに。スプリット比のサブカルチャー> 80％コンフルエント板細胞1：3。
      注：通常5〜7日でプレートがコンフルエントになります。使用フィーダはCF1マウス胚から得られ、γ放射線に曝露することによって不活性化されます。
2. 基底膜マトリックスでコーティングされたプレート上のH9細胞培養
   1. 室温で解凍し、幹細胞培地（5倍）サプリメントと安全キャビネットに400ミリリットル基礎培地100mlに追加します。
   2. 氷上で解凍する基底膜マトリックス。 24ミリリットルで（バッチごとに分析証明書を参照してください）​​12を6cmプレート用冷蔵のDMEM / F-12基礎培地を基底膜マトリックスの推奨量を追加します。ピペッティングにより混合します。
   3. 各を6cmプレートで2ミリリットルを追加します。室温で1時間プレートを保管してください。培地を除去し、幹細胞培地2mlを追加します。
   4. MEFの上の4つの集密H9プレートを取り出します。安全キャビネットに保管実体顕微鏡下で1ミリリットルピペットチップとの差別化コロニーを削除します。
   5. 吸引物培地と、4 mlのPBSで細胞を洗浄し、各プレート中の細胞培地幹ミリリットル2を追加します。 6〜9個のそれぞれに26 G針で未分化コロニーをカットします。
   6. ゆっくり50ミリリットルファルコンチューブに細胞を収集します。 5分間200×gで遠心分離します。
   7. 上清を吸引し、細胞培地を幹12ミリリットル中に再懸濁します。顕微鏡下でスライドガラス上に20μLを入れて塊をカウントし、1mlあたり150塊のボリュームを調整します。各を6cmプレートにサスペンションの2ミリリットルを追加します。
   8. 均一な塊分布を前後や左右に動きをプレートを移動し、細胞培養インキュベーター（37℃、5％のCO _2）でプレートをインキュベートします。
   9. 分化したコロニーを取り外し、日おきの培地交換を与えます。

2.胚様体（EB）形成

無菌の注意事項に従って及び安全キャビネット内で下記のすべての手順を実行します。

1. 0日目＆＃8212; V底プレート上H9の細胞のプレーティング
   1. PBS中でこのようなプルロニックF 127、5％のブロック共重合体を用意し、0.22μmの滅菌フィルターを用いて真空駆動濾過システムを通して濾過します。
   2. ウェルあたり5％のブロック共重合体の40μlのコートV底の96ウェルプレートを、45分間室温でインキュベートします。
   3. インキュベーターからH9細胞をコンフルエントな基底膜マトリックスプレートを取り外し、安全キャビネット内に実体顕微鏡下で1ミリリットルピペットチップとの差別化コロニーを削除します。
   4. 培地を吸引し、4 mlのPBSで細胞を洗浄。各プレート中（bFGFを、RD媒体なしH9培養培地）2ミリリットルランダム分化培地を追加します。通路ツールを使用し、安全キャビネット内に実体顕微鏡下で観察することにより、均一な大きさと形状の塊でH9細胞コロニーをカットした後、穏やかに細胞スクレーパーでこすり。
   5. 5分間、200×gで50ミリリットルファルコンチューブおよび遠心機で塊を収集します。上清を吸引し、セルを再懸濁RD培地中のLは、1ml当たり千塊を取得します。
   6. V底プレートからブロックコポリマーを吸引除去します。無菌角板に塊を注ぎ、マルチチャンネルピペットの助けを借りて、V底プレートの各ウェルに懸濁液100μlを追加。
   7. 塊の力集約のため、400×gで4分間、4℃で遠心分離V底プレートを。 4日間の細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）で培養します。
2. 4日目 - EBのコレクション
   1. マルチチャンネルピペットとワイドボア200μlのヒントを使用して、V底プレートから無菌角板にEBSを収集します。
   2. 10ミリリットルの滅菌血清学的ピペットで15ミリリットルのファルコンチューブに無菌の角板からのEBを収集します。 EBを2分間沈降することができます。上清を吸引し、5 mlのPBSでEBSを洗います。
   3. EBを2分間沈降し、上清を吸引することを可能にします。 5ミリリットルRD培地中のEBを再サスペンド。
   4. 10センチメートルで10ミリリットルにRD培地をピペット細菌学的プレート。 10センチメートル細菌学的プレートでEBSを転送します。
   5. 水平シェーカー（往復運動50 /分）で細菌培養するのに必要な時間の期間のための細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）中で維持しました。日おきに培地交換（15ミリリットルRD媒体）を与えます。
      注：ヒトES細胞を培養しながら、穏やかな取り扱いが必要です。 EBのサイズは、更なる実験のために実体顕微鏡下で観察することにより、均一なサイズのEB（±20％）を選択して4日目に変化します。この方法で形成された約50％のEBは、サイズが均一です。均一な形状でシェーカーの結果についてのEBの転送。

IC ₁₀決意3.細胞毒性アッセイ

1. 光底プレート上のEBの転送
   1. ウェルマルチチャンネルピペットを使用して、0.1％ゼラチン50μlの15分及びコート光底プレートを37℃の水浴中で0.1％ゼラチンを解凍します。室温でプレートをインキュベート45分。インキュベーション後、光底板からゼラチンを吸引します。
   2. RD培地を含む10センチメートル細菌学的プレートで4日目に収集したEBを取ります。
   3. 安全キャビネット内の斜めの位置に光底プレートを保管してください。実体顕微鏡下で観察することにより、光底96ウェルプレートにウェル当たり100μlのRD培地にEBの2均一な大きさを転送します。空の12 ^番目の列を保管してください。
   4. 24時間細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）で培養します。
2. 14日目の5日目から薬物暴露
   1. 試験化合物を秤量し、既知の溶媒中で最も高い濃度を作ります。
   2. シリアルHにで番号ファルコンチューブを含む溶媒中で8の希釈まで、試験化合物の半対数希釈を行い、チューブなしにしてください。私車両制御、チューブがないとして。 Jないネガティブコントロール（RD培地）、チューブなど。 （70％エタノール）を対照として正K。
   3. 37℃水浴中でRD培地を解凍15分間°C。 1から11までの標識11の滅菌ファルコンチューブに各5ミリリットルRD媒体を取り出します。
   4. それぞれ11にチューブ1の内管Aから管Kの解の5μlを採取し、チューブをボルテックス。インキュベーターから光底板を取り出し、丁寧にマルチチャンネルピペットを使用してメディアを取り出します。
   5. 光底板の各列にチューブ番号1から11に200μlの培地を追加します。日おきに培地/薬物変化を与えます。
      注：半対数のために希釈液は、チューブ2番に最高濃度管1番転送3μLから2から8への標識7チューブ内の溶媒6.48μLを取る渦と直列次のチューブに3μLを転送します。ネガティブコントロールのための車両制御とチューブ10番のためのチューブ9番をしてください。チューブ11号は、70％エタノールです。
3. 14日目：レサズリン露光および蛍光測定
   1. 15分間37℃の水浴中で解凍RD媒体。すべての手順を実行しmentionは、以下の生物学的安全キャビネットの中の光の非存在下で。
   2. 15mlチューブ（A）に10ミリリットルRD培地を取り、レサズリン試薬の推奨量を追加し、ピペッティングにより混合します。インキュベーターから光底板を取り出し、丁寧にマルチチャンネルピペットを持つすべてのメディアを削除します。
   3. 各ウェル中の管Aから培地100μlを加えます。 90分間、細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）中でプレートをインキュベートします。
   4. 分光光度計（560 _例 / 590 _エム ） _を使用して蛍光を測定します。
4. IC ₁₀値の決意
   1. ブランク値を差し引いた後、グラフパッドプリズムの値をインポートします。蛍光単位として用量とy軸とx軸を設定します。
   2. Y軸上の割合を求め、値（ログスケールとしてx軸）を形質転換するために値を正規化します。シグモイド用量反応（可変勾配）パラメータを使用して、IC ₅₀値を計算します。以下を使用して、IC ₁₀値を記録計算式：
      F = 10 logEC ₅₀ = logECF - （1 / HillSlope）*ログ（F /（100-F））
      Y =ボトム+（トップ下）/（1 + 10 ^（（LogEC ₅₀ -X）*勾配））
   3. さらなる研究のために取られるIC ₁₀値を決定します。

マイクロアレイに基づく4.バイオマーカー研究

1. 5日の0日目：
   1. 胚様体形成し、10 cmの細菌学的プレートを転送する - 胚様体形成のためのポイント2で述べた手順に従ってください。
      注：各試験のために3つの生物学的複製物を使用してください。 IC ₁₀濃度と車両制御での薬物治療-それぞれの生物学的二つの部分に複製を分割します。車両内の薬物濃度をIC ₁₀濃度以上10,000倍を準備し、これは50ミリリットルエッペンドルフチューブにH9細胞凝集塊で100ml RD培地に10μlを添加するからよく混ぜるとV底プレート上に播種します。媒体対照群と同じ手順に従ってください。
<14 5日目の薬物暴露についてはLI>、EB'sを収集し、ポイントで説明した手順に従って4日目に10センチメートルで細菌学的プレートを転送し、水平シェーカー（往復運動50 /分）でのプレート2.転送14日間の細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）。日おきの培地交換を与えます。
2. サンプル採取のために、14日目に、無菌の血清学的ピペットを用いて15ミリリットルのファルコンチューブ内の10cmプレートからのEBを収集します。 EBを2分間沈降することができます。上清を吸引し、5 mlのPBSでEBSを洗います。 EBを2分間沈降し、上清を吸引することを可能にします。再懸濁1ミリリットルのRNAlater溶液またはTRIzol試薬、渦にEBSをし、さらに処理するまで-80℃で試料を保存します。
   注：良い研究室慣行に従って安全キャビネット内のすべての手順を実行します。センター内のすべてのEBSを持って来るために中心の周りに円を描くようにプレートを回転させ、滅菌ガラスpastuの助けを借りて、周囲から培地を吸引ピペット再、15ミリリットルRD培地を追加し、それぞれのグループのための薬物/車両の15μlを添加します。

5. RNAの単離と整合性テスト

1. RNAの単離：
   下記の手順のほとんどは、取扱説明書に従ってRNeasyミニキットを用いてRNAの精製のために実行されます。常にヌクレアーゼフリーのチューブ、ピペットチップと水を使用しています。のTRIzolでの作業中に化学物質安全フード内でのすべての手順を実行し、保護メガネ、並びに化学保護手袋を着用してください。
   1. サンプルを氷上で解凍します。サンプルはRNAlater中溶液中に保存されている場合は、4℃で5分間、12,000×gでチューブを遠心します。上清を捨て、1mlのTRIzol試薬を追加します。
   2. 24 G針および1mlシリンジを使用して、サンプルを粉砕します。約15回粉砕したEB、細胞壁および原形質膜を破壊するのに十分です。
   3. 各サンプルに200μlのクロロホルムを追加します。均一に内容物を混合するための渦。遠心分離機4℃で15分間、12,000×gで。 RNeasyミニスピンカラムを1.5 mlチューブを取り外し、それらを適切にラベルを付けます。
   4. （上清を回収することは、中間または底層を乱さませんが）を1.5 mlチューブに上清を収集します。冷やした70％の同量のエタノールを加え。穏やかに振とうすることにより内容物を混合。
   5. それぞれのミニスピンカラムにチューブから700μLを適用し、室温で20秒間、12,000×gで、それらを遠心します。 RTでさらなるすべての手順を実行します。
   6. ろ液を捨て、各列に残った溶液を塗布し、20秒間12,000×gで、それらを遠心します。ろ液を捨てます。
   7. カラムにRW1バッファー350μlのを適用し、20秒間12,000×gで、それらを遠心します。ろ液を捨て、カラムにDNA分解酵素を10μlと70μlのRDDバッファーを適用します。
   8. 室温で15分間インキュベートします。カラムにRW1バッファー350μlのを適用し、20秒間12,000×gで、それらを遠心します。ろ液を捨てます。 500μlのを適用します。RPEをカラムにバッファリングし、20秒間12,000×gで、それらを遠心洗います。ろ液を捨てます。再びカラムにRPE洗浄緩衝液500μlを適用し、2分間、12,000×gで、それらを遠心します。ろ液を捨てます。
   9. 新しい2 mlのコレクションチューブに列をシフトし、1分間12,000×gで、それらを遠心します。標識された1.5ミリリットルのコレクションチューブにカラムを移し、ヌクレアーゼフリー水22μLを適用します。 1分間12,000×gでチューブを遠心。
   10. コレクションチューブを外し、氷の上に置きます。自動電気泳動システムを使用してRNAを定量化します。
2. RNA濃度、純度および完全性試験。
   RNAの純度および完全性について使用自動電気泳動システムおよび各キット^33をテストします。

6.マイクロアレイ研究

1. 市販のヒトアレイチップを使用して、転写プロファイリングを実行します。 RNA標的の準備、フラグメンテーション、ハイブリダイゼーション³⁴と配列のためのチップ染色、洗濯³⁵使用市販のキット。
2. 標準的な流体工学ステーション、アレイスキャナ、標準のオペレーティング·ソフトウェア^36を使用して、アレイチップスキャンおよび品質管理チェックを実行します。遺伝子発現解析のための標準的な市販のソフトウエア³⁷にスキャナから生成されたファイルをインポートする、堅牢なマルチアレイ分析（RMA）とバックグラウンド補正、集計および正規化を行います。
3. 示差的に発現される遺伝子のリストを得るために（DEGの）一方向ANOVA分析を行います。このリストからの倍数変化（±2）とFDR制御p値（<0.05）に基づいて遺伝子をフィルタリング。このソフトウェアを使用するなど 、主成分分析（PCA）、ヒートマップを入手します。

パート2 UKN 1テストシステム

ヒトES細胞の1メンテナンス

1. MEFを播種
   1. 分化のためNSCB位8534（H9）細胞株を使用しています。文化CEフィーダー細胞としてマウス胚繊維芽細胞（MEF）のLLS。 0.1％ゼラチンの4mlでコートT25フラスコ中、37℃で30分間インキュベートします。
   2. 37℃の水浴中で解凍したMEFと予め温めておいたDMEM / 10％FBSに細胞を移します。
   3. 、500×gで3.5分でスピン上清を除去し、1×10 ⁷細胞/ mlを得るために、細胞を再懸濁します。ゼラチンのT25フラスコ中の4×10 ⁴ / cm ^2のプレートのMEF。必要に応じて、次の2日間のMEFを使用しています。 MEFのバッチの質はヒトES細胞の維持のために非常に重要な問題です。したがって、H9細胞のための最高の会社と準備方法を解明することをお勧めします。我々はPMEF P3を使用しています。
2. H9の分割および保守
   1. T25フラスコH9あたり1ミリリットル予め温めディスパーゼを追加し、37℃で9分間インキュベートします。
   2. 2ミリリットルを追加5ミリリットルピペットで5回上下に処理した細胞とピペットをディスパーゼとファルコンチューブに細胞溶液を転送するための媒体を洗います。
   3. 9ミリリットル洗浄培地でフラスコを洗いますその他にセルを追加。 、500 XGで3.5分スピン上清を除去し、10ミリリットルのhESC培地中で細胞を再懸濁します。
   4. 、500 XGで3.5分スピン上清を除去し、4ミリリットルのhESC培地中で細胞を再懸濁します。 MEFを使用して新しい（PBS洗浄）T25フラスコに0.5ミリリットルの細胞懸濁液と4.5ミリリットルのhESC媒体とプレートを追加します。毎日フラスコの全体のhESC培地（5ml）に変更します。

神経外胚葉前駆細胞に向かってのhESCの2分化（NEP）

1. ヒトES細胞培地とKCM媒体を準備します。 T25フラスコあたりゼラチンコートを有するもの10cmディッシュ（PBS中0.1％）と37℃で30分間インキュベートします。ヒトES細胞から培地を除去し、フラスコ（T25フラスコあたり1ミリリットル）の底面全体をカバーし、37℃で25〜30分間インキュベートするのに十分なACCUTASEを追加します。
2. ACCUTASEのインキュベーションの間に基底膜マトリックスでコーティングしたプレートを準備します。凍結した基底膜マトリックスペレットに冷たいDMEM / F12を追加し、1:20に解決します。フィルタ基底膜マトリックスソル40μmのセルストレーナーを介します。プレートに濾過した溶液を加え、全体の底部をカバーする必要がある（6ウェル当たり1ミリリットルが必要）、室温で2時間インキュベートします。
3. インキュベーション期間の後コーティングしたウェルに基底膜マトリックス上清および種子細胞を除去します。 ACCUTASEステップ（2.1）の後1.5ミリリットルhES培地を添加することにより反応を停止させます。 、フラスコから細胞をこすり8ミリリットルのhESC媒体を追加し、完全に10ミリリットルピペットでピペッティングにより単一細胞溶液を生成します。 40μmのセルストレーナーを介して細胞をフィルタリングします。
4. スピンセル500 XGで3分、上清を除去し、ヒトES細胞を10mlで細胞を再懸濁します。 500 XGとスピン細胞を再び3分、上清を除去し、ヒトES細胞で再懸濁細胞は、10μMの最終濃度でROCK阻害剤Y-27632を含みます。
5. ゼラチンコートディッシュの上清を取り除きます。のMEFを除去し、正確に1時間インキュベーターに残すために、ゼラチンコートディッシュにプレートの細胞懸濁液。
   注：このステップの間のMEFますのettleのhESCは、ゼラチンに接続することはできません一方、ゼラチンコーティングしたプレート上に。したがって、これは無フィーダー分化を得ることが重要です。これは、MEFのの非効率的な除去をヒトES細胞塊と短すぎるインキュベーションに重要なステップとして、長すぎるインキュベーションの結果です。インキュベーションの45分後、プレートは、すでに定着したMEFとのhESCの塊のために調査する必要があります。
6. MEFのを取り付けているときは、静かにプレート内にすでに培地とのインキュベーション後にオフに非接着細胞（hESCの）を洗浄します。いくつかのT25はより多くの細胞を得るために使用された場合、単一細胞は、ここに組み合わせることができます。 hESCの培地で1回プレートを洗浄します。
7. 500 XGとスピン細胞3分、10μMのROCK阻害剤Y-27632および10 ngの/ mlのFGF-2を含む約4ミリリットルのKCMに上清および再懸濁細胞を除去します。
8. トリパンブルーを用いて血球計で細胞をカウントします。 10μMのROCK阻害剤Y-27632を含むKCMでプレートをコーティングした基底膜マトリックス上プレート18×10 ³細胞/ cm ²であり、10 ngの/ mlのFGF-2（6のためにウェル当たり1.5ミリリットルを使用します）。それが正常にネップにそれらを区別するために、右の密度で細胞をプレーすることが重要です。
9. 24時間後、10μMのROCK阻害剤Y-27632および10 ngの/ mlのFGF-2を含む新鮮なKCMに培地を変更します。さらに24時間後、10 ngの/ mlのFGF2を含有する新鮮なKCMに培地を変更します。
10. 細胞を播種後72時間では、分化は、KSRの記録媒体に向かって培地交換することによって開始されます。この時点は、分化0（DoD0）の日と呼ばれています。試験物質の添加が可能になりました。
11. DOD1およびDOD2で媒体がまったくDoD0のように変更されています。次の培地交換は25％N2-S及び75％KSRを含むDoD4です。 DoD6で分化が停止し、細胞を分析のために採取します。

ヒトES細胞とNEPの3クロマチン免疫沈降（チップ）

1. 核の調製
   1. 分析し、25〜30分間インキュベートする必要がある各6ウェルに500μlのACCUTASEを追加します。ゆトリパンブルーを使用してノイバウアー室におけるNT細胞。
   2. 架橋のためのDMEM / F12中の1％ホルムアルデヒドで細胞を再懸濁し。架橋を停止するには、10分後に125 mMの最終濃度にトリスpHが7.5を追加します。
   3. スピン細胞を4℃で500×gで3分間で、上清を除去し、冷PBSで細胞を再懸濁します。
   4. スピン細胞を4℃で500×gで3分間で、上清を除去し、1ml中に再懸濁細胞L1-バッファ/ 1×10 ^6個の細胞。
   5. 氷上で5分間インキュベートします。 4℃で800×gでスピンと5分、L2-バッファ/ 2×10 1ミリリットル中に^6個の細胞を上清および再懸濁核を除去。
2. 超音波処理および品質管理
   1. 超音波処理300〜700 bpの長さのDNA断片が生成されるようになっています。 4℃で10,000×gで1分でスピン。上清を新しいチューブに移します。断片は、そうでなければ免疫沈降が非効率的なだけでなく、その後のqPCRになり、正しいサイズを持っている必要があります。
   2. 50μlの削除アガロースゲルを実行して、超音波処理の効率をチェックするために50μlのL2バッファーでDミックス。
   3. 4時間および500 rpmで65℃でインキュベーションすることによって架橋逆。ロードサンプル1：1.5％アガロースゲル上のオレンジGローディングダイと5と1×TBE緩衝液中で110 Vで45分間実行します。コントロールフラグメントサイズ（300〜700塩基対の間でなければなりません）。
3. クロマチン免疫沈降
   1. 希釈緩衝液、アリコートシリコン処理チューブ内のIPあたり1mlに5：サンプル1を希釈します。
   2. 「入力」のように希釈したクロマチンサンプル（ステップ3.3.1）と4℃でストアから5％（体積）を取り外します。
   3. ローテーター上で4℃でお好みの抗体と非特異的IgGのO / Nでサンプルをインキュベートします。
   4. 免疫沈降した後、各サンプルに50μlのプロテ​​インA / Gセファロースビーズを追加します。サンプルをローテーター上で4℃で3時間インキュベートします。 4℃で1,500×gでで1分間スピンし、上清を除去します。
   5. 1ミリリットルの洗浄ビーズを洗浄します。スピン1分間1,500×gでと4°C、上清を除去します。 hにステップgを繰り返します。 1ミリリットルの最終洗浄緩衝液で洗浄します。これは直接溶出物の量を変化させるため、洗浄工程中は、ビーズのいずれかを失うべきではありません。
   6. 4℃で1,500×gでで1分間遠心し、上清を除去します。 125μlの溶出バッファーを加え、振とう機で1,000rpmで65℃で15分間インキュベートします。
   7. 1,500 XGで1分間スピンし、新しいチューブを繰り返しステップkおよびlに上清を移します。入力（3.3.2）に200μlの溶出バッファーを追加します。シェーカー上で500rpmで各サンプルにプロテイナーゼKおよびRNaseを追加し、シェーカー上で500rpmで37℃で30分間インキュベートし、その後65℃で4時間。
      注：DNA抽出に使用するために、市販のChIP DNAクリーンとコンセントレータキット^38。

結果

UKKテストシステム中のメチル水銀暴露

細胞毒性アッセイは、メチル水銀の毒性（ 図1）のためのIC ₁₀値（10％生存性の減少）を得るH9のEBを用いて行きました。また、ベースのマイクロアレイ（Affymetrix社のプラットフォーム）バイオマーカーの研究を行いました。 H9 EBは14日間メチル水銀（0.25および1μM）に暴露されました。 14日目に、試料は、トリゾ?...

ディスカッション

毒性試験への従来のアプローチは、このように試験が高コストと時間のかかる大規模な製造動物実験を伴います。また、種間の差異に起因する前臨床動物安全性試験は、ヒトに関連可能性のある薬剤の毒性効果を予測することは必ずしも有効ではありません。ヒト以外の霊長類は、最も予測可能であるが、まだ強い倫理的、および社会経済的需要が急速に生体外試験で高感度か?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Knockout Serum Replacement
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	GlutaMAX supplement
NEAA	Life Technologies	11140050	MEM Nonessential Amino Acids Solution
DPBS	Life Technologies	14190-0144	Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium
mTeSR medium	Stemcell Technologies	5850
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
V bottom plate	VWR	734-0483	Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST
V bottom plate lid	VWR	634-0011	Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled Water	Life Technologies	15230-089.	Sterile Distilled Water
Human FGF-2 (bFGF)	Millipore	GF003AF-100UG	Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μm	Millipore	SCGPU02RE	Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
StemPro EZPassageTM Disposablte	Invitrogen	23181010
BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix	Stemcell Technologies	354277	5 ml vial
DMSO	Sigma	D-2650
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7020	It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples.
70 μm Cell Strainer	Becton Dickinson	352350	Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube	Becton Dickinson	352235	5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
50 ml sterile Polypropylene tube	Greiner Bio-One	227261	50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flask	Greiner Bio-One	658175	CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TRIzol	Life Technologies	10296010
96 well optical bottom plates	Thermo Scientific	165305
CellTiter-Blue	Promega	G8081
Accutase	PAA	L11-007
Apotransferin	Sigma-Aldrich	T-2036
Dispase	Worthington Biochemicals	LS002104
Dorsomorphin	Tocris Bioscience	3093
EDTA	Roth	8043.2
FBS	PAA	A15-101
FGF-2	R&D Systems	233-FB
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-100G
GlutaMAX	Gibco Invitrogen	35050-038
HEPES	Gibco Invitrogen	15630-056
Insulin	Sigma-Aldrich	I-6634
Knockout DMEM	Gibco Invitrogen	10829-018
Matrigel	BD Biosciences	354234
Noggin	R&D Systems	719-NG
PBS	Biochrom AG	L1825
Progesteron	Sigma-Aldrich	P7556
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris Biosciences	1254
SB431542	Tocris Biosciences	1614
SDS	Bio-Rad	161-0416
Selenium	Sigma-Aldrich	S-5261
β-Mercaptoethanol	Gibco Invitrogen	31350-010
[header]
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit	Affymetrix	900721, 22, 23	This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays.
Rnase-Free DNase Set	QIAGEN	79254
[header]
List of equipment
Inverted microscope	Olympus		IX71
Genechip Hybridisation Oven - 645	Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450	Affymetrix
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G	Affymetrix
Spectramax M5	Molecular Devices
[header]
List of softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory