Human células estaminais pluripotentes Baseado Developmental Toxicity Ensaios para Química Triagem e Safety Systems Biology Data Generation

Resumo

Os protocolos descrevem dois sistemas in vitro de testes de toxicidade de desenvolvimento (UKK e UKN1) com base em células estaminais embrionárias humanas e estudos de transcriptoma. Os sistemas de teste prever risco de toxicidade para o desenvolvimento humano, e pode contribuir para reduzir os estudos em animais, dos custos e do tempo necessário para os testes de segurança química.

Resumo

Protocolos eficientes para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas para vários tecidos em combinação com tecnologias -ómicas abriu novos horizontes para em testes de toxicidade in vitro de potenciais drogas. Para fornecer uma base científica sólida para tais ensaios, será importante para obter informação quantitativa sobre o curso do tempo de desenvolvimento e sobre os mecanismos regulatórios subjacentes por abordagens de biologia de sistemas. Dois ensaios foram, portanto, ligado aqui para esses requisitos. No sistema de teste UKK, células estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias humanas) (ou outras células pluripotentes) são deixados diferenciar espontaneamente durante 14 dias em corpos embrióides, para permitir a geração de células de todas as três camadas germinais. Este sistema recapitula principais etapas do desenvolvimento embrionário humano cedo, e ele pode prever-humano específico cedo embrionário toxicidade / teratogenicidade, se as células são expostas a produtos químicos durante a diferenciação. O sistema de teste baseia-se na UKN1 células estaminais embrionárias humanas diferenciação para um populatião de neuroectodérmico progenitoras (NEP) células durante 6 dias. Este sistema recapitula o desenvolvimento neural precoce e prevê neurotoxicidade de desenvolvimento precoce e alterações epigenética desencadeadas por agentes químicos. Ambos os sistemas, em combinação com estudos de transcriptoma de microarray, são adequados para a identificação de biomarcadores de toxicidade. Além disso, eles podem ser utilizados em combinação para gerar dados de entrada para análise biologia sistemas. Estes sistemas de teste tem vantagens sobre os estudos toxicológicos tradicionais requerem grandes quantidades de animais. Os sistemas de teste pode contribuir para uma redução dos custos de desenvolvimento de medicamentos e avaliação da segurança química. Sua combinação lança luz especialmente em compostos que podem influenciar o neurodesenvolvimento especificamente.

Introdução

A capacidade das células-tronco embrionárias humanas (hESC) para se diferenciar em vários tipos de células abriu uma nova era de testes in vitro de toxicidade ^1, modelagem de doença e medicina regenerativa ^2. As células-tronco são dotados com a capacidade de se auto-replicar, para manter seu estado pluripotente, e se diferenciar em células especializadas ^3,4. As propriedades de células estaminais embrionárias humanas (capacidade de se diferenciar para todos os principais tipos de células) são encontrados também em outras células estaminais pluripotentes humanas, tais como células pluripotentes estaminais humanas induzida (hiPSC) ou células geradas pela transferência nuclear ^5. Por exemplo, muitas linhas hESC diferentes foram diferenciadas em neurônios, células renais ^{6 7,} células da crista neural ^{8, 9-12} cardiomiócitos, ou hepatócitos como células ^13,14. Além disso, hESC pode diferenciar espontaneamente em células das três camadas germinativas ^15-18 em corpos embrióides (EBS) ^19,20. Edesenvolvimento embrionário arly é regulada pela expressão diferencial de vários genes relacionados com as diferentes camadas germinativas, que foi capturado em nível mRNA por transcriptomics utilizam a tecnologia de microarray ^15. Esses esforços resultaram no estabelecimento de modelos toxicológicos específicos de órgãos com base em hESC / hiPSC e análise transcriptomics (para revisão ver ^21,22). Estes modelos têm vantagens sobre o uso tradicional de animais de laboratório para estudos toxicológicos, como estudos pré-clínicos com animais de laboratório nem sempre são preditivos de segurança humana. As toxicidades induzidas por drogas encontradas em pacientes estão frequentemente relacionadas com processos metabólicos ou sinalização que diferem entre humanos e animais experimentais. A diferença espécies impediu a detecção precoce confiável de tóxicos no desenvolvimento dos seres humanos, e para as drogas de instância como a talidomida ^23,24 e ^25,26 dietilestilbestrol foram retirados do mercado devido à teratogenicidade. ThaliDomide não demonstrou qualquer toxicidade para o desenvolvimento em ratos ou camundongos. Produtos químicos ambientais, tais como o metilmercúrio ²⁷ resultou em efeitos tóxicos no desenvolvimento pré-natal no que diz respeito ao sistema nervoso em várias espécies, mas manifestações humanas têm sido difíceis de modelar em animais. Para resolver o problema das questões especificidade das espécies, os cientistas que trabalham em diferentes projetos baseados em células-tronco como Reprotect, ESNATS, DETETIVE etc. estão envolvidos no desenvolvimento de diferentes modelos de toxicidade embrionária, neurotoxicidade, cardiotoxicidade, hepatotoxicidade e nefrotoxicidade usando tóxicos humanos suspeitos de afetar os seres humanos. No âmbito do projecto consórcio europeu "Embryonic baseada em células-tronco Novel estratégias de ensaio alternativas (ESNATS) 'cinco sistemas de teste foram estabelecidas. Um sistema de teste do chamado UKK (U niversitäts k linikum K OLN) sistema de teste capta parcialmente o desenvolvimento embrionário humano precoce. Neste sistema células H9 embrionárias humanas são diferenciados em três camadas germinativas (ectoderma, endoderme e mesoderme) ¹⁵ e da camada de germe de assinaturas específicas foram capturados por transcriptomics perfil usando a plataforma de microarray Affymetrix. Vários tóxicos desenvolvimento como talidomida ^28, ácido valpróico, metil-mercúrio ^16,17, ou citosina arabinósido ¹⁵ foram testadas neste sistema, e as assinaturas de genes tóxicos específicos foram obtidas. Num segundo sistema de teste, a chamada do UKN1 (L NIVERSIDADE de K onsta n z) um sistema de teste, as células H9 são diferenciadas de células progenitoras neuroectodérmica (NEP) durante 6 dias. Isto é evidenciado pela elevada expressão de genes marcadores neurais tal como PAX6 e OTX2. Durante a diferenciação durante 6 dias, as células de NEP foram expostos ao desenvolvimento neuro-tóxicos, tais como VPA, metil-mercúrio. Perfis específicos-Toxicant regulada-transcriptômica de ter sido obtidefinida como bem usando a plataforma de microarray Affymetrix ^16,29.

A nova visão para a toxicologia do século ^21, prevê que sistemas de teste que não só deu descrições fenotípicas como histopatologia in vivo, ou mudanças transcriptoma no final de incubações tóxicos a longo prazo. Ao contrário, ela sugere que as análises de fornecer informações mecanicista ^3, e que esta informação pode ser mapeado para os chamados caminhos adversos resultado (AOP) que fornecem uma justificativa científica para efeitos perigosos ^30. Para fornecer essas informações, os sistemas de ensaio aplicados têm de ser altamente qualidade controlada ^31, como por exemplo documentado por procedimentos de operação padrão robustos. Além disso, as alterações dependentes do tempo têm de ser mapeada com alta resolução. Isto requer sistemas de teste com mudanças sincronizadas ^32. Os sistemas de teste UKN1 e UKK aqui descritos foram otimizados para esses requisitos.

Protocolo

O protocolo a seguir foi realizada utilizando linha Embryonic Stem Cell humana (hESC) H9. Esta linha celular foi rotineiramente cultivadas no rato mitotically inativada fibroblastos embrionárias (MEFs) em meios de cultura de células estaminais embrionárias humanas suplementadas com bFGF e, em seguida, cultivadas em meio de células-tronco em seis centímetros placas de Petri revestidas com matriz da membrana basal, como matrigel, para se livrar de MEFs. As células H9 de> 80% de placas confluentes foram utilizados para nova passagem. Células H9 cultivadas em placas de matriz da membrana basal foram usadas para a formação de EBS. Todos os procedimentos mencionados na seguinte protocolo foram realizados usando métodos padrão para as práticas de cultura de células assépticas e boas.

Parte 1. Sistema de teste UKK

1. A cultura embrionárias humanas Stem Cell

1. Splitting e manutenção de H9 em células alimentadoras
   1. Pipetar 0,1 ml de 2% de gelatina em cada seis centímetros placa e incubar durante 30 min em cultura de células incubador (37 ° C e 5% de CO _2). Aspirar solução de gelatina com pipeta Pasteur estéril.
   2. Adicionar 2 ml de meio contendo MEF 0,1 x 10 ⁶ MEF células / ml para as duas placas revestidas com gelatina e incubar-los em cultura de células incubadora (37 ° C e 5% de CO ₂₎ O / N.
   3. No dia seguinte, remove as células H9 frasco a partir do tanque de armazenamento de azoto líquido usando uma pinça e descongelar o frasco num banho de água a 37 ° C usando pinças compridas.
   4. Retirar o frasco do banho de água, banho com etanol a 70%, em ar seco a cabine de segurança biológica, durante 15 a 30 seg e transferência das células para 15 ml de tubo Falcon.
   5. Adicionar 9 ml de meio de cultura de H9 lentamente sobre a parede interna e centrifugar as células a 200 xg durante 5 min.
   6. Aspirar o sobrenadante e re-suspender as células em meio de cultura contendo 6 ml inibidor ROCHA (10 �, Y27632) e gentilmente pipeta para misturar. Aspirar o meio do MEF placa de 6 cm, e adicionar 3 ml de suspensão de células em cada placa. Mudar a forma de day 3 e, em seguida, todos os outros dias. Subcultura> 80% de células de placas confluentes com relação de divisão 1: 3.
      Nota: Normalmente em 5 a 7 dias placa torna-se confluentes. Alimentadores usados ​​são obtidos a partir de ratinhos CF1 embrião e inactivado por exposição a radiação γ.
2. Cultura de células H9 em placas de matriz de membrana basal revestidos
   1. Meio de células-tronco Thaw (5x) suplemento à temperatura ambiente e adicionar 100 ml para 400 ml de meio basal em cabine de segurança biológica.
   2. Matriz da membrana basal Thaw no gelo. Adicionar o volume sugerido de matriz de membrana basal (ver Certificado de Análise para cada lote) em 24 ml refrigerados DMEM / F-12, meio basal de doze placas de 6 centímetros. Misturar por pipetagem cima e para baixo.
   3. Adicionar 2 ml em cada placa de 6 centímetros. Manter a placa à temperatura ambiente durante 1 h. Remover o meio e adicionar 2 ml de meio de células-tronco.
   4. Retire quatro placas H9 confluentes em MEFs. Retirar as colônias diferenciados com 1 ml da ponteira sob lupa mantido no gabinete de biossegurança.
   5. Aspiradoa forma e lava-se as células com 4 mL de PBS e adiciona-se 2 ml de meio de células estaminais em cada placa. Cortar as colônias indiferenciadas com 26 G agulha para 6-9 peças cada.
   6. Gentilmente recolher as células em 50 ml tubo falcon. Centrifugar a 200 xg durante 5 min.
   7. Aspirar o sobrenadante e re-suspensão em 12 ml tronco meio celular. Contagem as touceiras, colocando 20 l em lâmina de vidro sob o microscópio e ajustar o volume para 150 touceiras por ml. Adicionar 2 ml de suspensão em cada placa de 6 centímetros.
   8. Mover as placas para trás e para a frente e lado-a-lado movimentos para distribuição uniforme clump e incubar as placas na incubadora de cultura de células (37 ° C e 5% de CO _2).
   9. Retirar as colônias diferenciados e dar o troco médio em dias alternados.

2. corpos embrióides (EB) Formação

Praticar todos os procedimentos referidos a seguir como por cuidados de assepsia e no gabinete de biossegurança.

1. Dia 0 & #8212; Plaqueamento de células H9 em placas de fundo em V
   1. Prepare copolímero em bloco 5%, tal como Pluronic F 127 em PBS e filtrar através de sistema de filtração a vácuo impulsionado usando 0,22 um filtro estéril.
   2. Revestimento V placas de 96 poços de fundo com 40 ul de 5% de copolímero em bloco por poço e incubar à TA durante 45 min.
   3. Remova as placas confluentes porão matriz membrana com células H9 da incubadora e remover as colônias diferenciados com 1 ml da ponteira sob lupa no gabinete de biossegurança.
   4. Aspirar o meio e lava-se as células com 4 ml de PBS. Adicione 2 ml meio de diferenciação aleatório (H9 meio de cultura sem bFGF, médio RD) em cada placa. Use a ferramenta de passagem e cortar as colônias de células H9 em aglomerados de tamanho e forma uniforme através da observação sob lupa no gabinete de biossegurança e em seguida, raspar delicadamente com o raspador de células.
   5. Recolher os aglomerados em 50 ml de tubo Falcon e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e suspender novamente o cell em meio RD para obter 1.000 touceiras por ml.
   6. Aspirar o copolímero em bloco de placas de fundo V. Despeje os aglomerados em placa quadrada estéril e com a ajuda de pipeta multicanal adicionar 100 ml de suspensão a cada poço da placa de fundo V.
   7. Para a agregação força de aglomerados, centrifugar as placas de fundo V a 4 ° C durante 4 minutos a 400 x g. Incubar as placas na incubadora de cultura de células (37 ° C e 5% de CO ₂₎ durante quatro dias.
2. Dia 4 - Coleção da EBS
   1. Recolher as EBs na placa quadrada estéril de placas de fundo V usando pipeta multicanal e largas furo 200 dicas ul.
   2. Recolher as EBs de placa quadrada estéril no tubo de 15 ml falcão com 10 ml de pipeta estéril sorológica. Permitir EBs de se contentar com 2 min. Aspirar o sobrenadante e lavar os CEs com 5 ml de PBS.
   3. Permitir EBs de se contentar com 2 minutos e aspirar o sobrenadante. Re-suspender EBs em meio 5 ml RD.
   4. Pipeta médio RD 10 ml em 10 centímetrosplacas bacteriológicos. Transfira as EBs em placas bacteriológicos 10 centímetros.
   5. Incubar as placas bacteriológicas em agitador horizontal (movimento de vaivém movimento 50 / min) mantidas em cultura de células incubadora (37 ° C e 5% de CO ₂₎ durante período de tempo necessário. Dê mudança de meio (15 ml de meio de RD) em dias alternados.
      Nota: A manipulação delicada é necessária durante a cultura hESCs. O tamanho varia de EBs no dia 4. Selecione as EBs de tamanho uniforme (± 20%), observando sob lupa para obter mais experiência. Aproximadamente 50% EB formados com este método são de tamanho uniforme. A transferência de EBS em resultados shaker em forma uniforme.

3. Ensaio de citotoxicidade para o IC ₁₀ Determinação

1. Transferência de EBS em placas de fundo ópticos
   1. Descongelar gelatina a 0,1% em banho de água a 37 ° C durante 15 placas de fundo mínimo ópticos e revestimento com 50 ul de 0,1% de gelatina por poço utilizando uma pipeta multicanal. Incubar as placas à temperatura ambiente durante45 min. Após incubação aspirar a gelatina a partir de placas de fundo ópticos.
   2. Retire as EBs recolhidas no dia 4 em placa de 10 cm bacteriológico contendo meio RD.
   3. Manter placas de fundo ópticos em posição inclinada em cabine de segurança biológica. Transferência de dois tamanho uniforme da EBS em 100 ul por meio de RD bem na óptica inferior placa de 96 poços através da observação sob lupa. Mantenha ^12ª coluna vazia.
   4. Incubar as placas na incubadora de cultura de células (37 ° C e 5% de CO ₂₎ durante 24 h.
2. Exposição da droga a partir do dia 5 ao dia 14
   1. Pesa-se o composto de teste e tornar mais alta concentração no solvente conhecido.
   2. Realizar diluição semi-logarítmica do composto de teste em série até 8 diluições em solvente contendo tubos falcon numeradas com A a H, manter o tubo não. I, como controlo de veículo, não tubo. J como controle negativo (meio RD) eo tubo não. K como positivo (70% de etanol) controle.
   3. Descongele o meio RD em banho-maria a 37° C durante 15 min. Retire 5 ml de meio de cada RD em 11 tubos falcon estéreis rotulados 1-11.
   4. Transferência de 5 ul de solução de tubo de A a K em tubo para tubo 1 a 11, respectivamente, e os tubos vortex. Retire a placa de fundo óptico da incubadora e remova cuidadosamente a mídia com o uso de uma pipeta multicanal.
   5. Adicionar 200 ul de meios de tubo número 1 a 11 para as respectivas colunas da placa de fundo óptico. Dê mudança / droga médio em dias alternados.
      Nota: Para diluições semi-logarítmica tomar 6,48 mL de solventes em 7 tubos rotulados de 2 a 8. A partir de Transferência no.1 tubo concentração 3 ul para no.2 tubo, vortex e transferir serialmente 3 ul para o próximo tubo. Mantenha no.9 tubo para o controle do veículo e no.10 tubo para o controle negativo. Tubo no.11 é o etanol 70%.
3. Medição da exposição Resazurina e fluorescência: Dia 14
   1. Descongelar meio RD em banho de água a 37 ° C durante 15 min. Executar todas mentio procedimenton abaixo na ausência de luz na cabine de segurança biológica.
   2. Tome médio de 10 ml RD em 15 ml de tubo (A) e adicionar o volume recomendado de reagente resazurina e misture por pipetagem. Retire a placa de fundo óptico da incubadora e remova cuidadosamente todo o meio com pipeta multicanal.
   3. Adicionar 100 ul de meio de tubo de A em cada poço. Incubar a placa na incubadora de cultura de células (37 ° C e 5% de CO ₂₎ durante 90 min.
   4. Medir a fluorescência usando o espectrofotómetro (560 _Ex / _Em 590).
4. IC determinação _de valor ₁₀
   1. Importe os valores do gráfico pad prisma depois de subtrair os valores em branco. Conjunto eixo x como uma dose e eixo-y em unidades de fluorescência.
   2. Normalizar os valores para se obter percentagem no eixo y e transformar os valores (eixo-x como escala log). Calcule _IC50 valor usando resposta de dose sigmoidal (declive variável) parâmetro. Calcule log IC ₁₀ valores usando seguinteequação:
      F = ₅₀ = 10 LogEc logECF - (1 / hillslope) * log (F / (100-F))
      Y = + inferior (Top-Bottom) / (1 ​​+ 10 ^ ((LogEc ₅₀ -X) * hillslope))
   3. Determinar o IC ₁₀ valores a serem tomadas para estudos posteriores.

4. Estudo de biomarcador baseado em microarrays

1. Dia 0 ao dia 5:
   1. Formação de corpos embrióides e transferência para placas de 10 cm bacteriológicas - siga os passos referidos no ponto 2 para a formação de corpo embryoid.
      Nota: Use três repetições biológicas para cada estudo. Divida cada replicar em duas partes biológico - O tratamento medicamentoso no IC ₁₀ concentração e controle do veículo. Prepare a concentração da droga 10.000 vezes acima da concentração IC ₁₀ no veículo e deste adicione 10 ml a 100 ml de meio de RD com aglomerados de células H9 em 50 ml tubo Eppendorf de misturar bem e sementes-lo em placas de fundo V. Siga o mesmo procedimento para o grupo de controlo do veículo.
2. Para a exposição de drogas no dia 5 a 14, recolher os EB's e transferi-los em placas de 10 cm bacteriológicos no dia 4 de acordo com as etapas mencionadas no ponto 2. Transferir as placas no agitador horizontal (reciprocidade movimento 50 / min) em incubadora de cultura de células (37 ° C e 5% de CO ₂₎ durante 14 dias. Dê mudança médio em dias alternados.
3. Para a coleta de amostra, no dia 14, recolher as EBs de placas de 10 centímetros para 15 ml tubo falcon com pipeta estéril sorológica. Permitir EBs de se contentar com 2 min. Aspirar o sobrenadante e lavar os CEs com 5 ml de PBS. Permitir EBs de se contentar com 2 minutos e aspirar o sobrenadante. Re-suspender EB em 1 ml de solução RNAlater ou reagente TRIzol, vórtice e armazenar a amostra a -80 ° C até posterior processamento.
   Nota: Execute todos os procedimentos em cabine de segurança biológica de acordo com as boas práticas laboratoriais. Rodar as placas em movimento circular em torno do centro para trazer todos os CEs no centro, aspirar o meio a partir circundante, com a ajuda de pastu vidro estérilre pipeta, adicionar 15 ml de meio de RD e, em seguida, adicionar 15 ul de fármaco / veículo para respectivo grupo.

5. Isolamento de ARN e o teste de integridade

1. Isolamento de ARN:
   A maior parte dos passos abaixo indicados são para ser realizado para a purificação de ARN utilizando RNeasy Mini Kit de acordo com o manual de instruções. Use sempre tubos livres nuclease, pontas para pipetas e água. Enquanto trabalhava com TRIzol realizar todo procedimento no capô de segurança química e usar óculos de proteção, bem como luvas de proteção química.
   1. Descongelar as amostras em gelo. Se as amostras são armazenadas em solução RNAlater, centrifugar os tubos a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de reagente TRIzol.
   2. Tritura-se as amostras utilizando 24 g da agulha e seringa de 1 ml. Cerca de 15 vezes a trituração é suficiente para a ruptura de EBS, parede celular e membranas plasmáticas.
   3. Adicionar 200 ul de clorofórmio em cada amostra. Vortex para misturar o conteúdo de maneira uniforme. Centrifugadora 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Remova as colunas de spin RNeasy mini, tubos de 1,5 ml e rotulá-los corretamente.
   4. Recolhe-se o sobrenadante em tubos de 1,5 ml (Durante a recolha sobrenadante não perturbar o meio ou camada inferior). Adicionar um volume igual de etanol a 70% gelada. Misture o conteúdo, agitação suave.
   5. Aplicar 700 mL de tubos para respectivas colunas mini-rotação e centrifugar-los a 12.000 xg durante 20 segundos à temperatura ambiente. Executar todas as outras etapas na RT.
   6. Descarte o filtrado e aplicar a solução restante para as respectivas colunas e centrifugar-los a 12.000 xg por 20 s. Descartar o filtrado.
   7. Aplicar 350 ul de tampão RW1 à coluna e centrifugar para a 12.000 xg durante 20 seg. Descartar o filtrado e aplicar 10 ul de DNase e RDD tampão 70 ul para a coluna.
   8. Incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Aplicar 350 ul de tampão RW1 à coluna e centrifugar para a 12.000 xg durante 20 seg. Descartar o filtrado. Aplicar 500 ul deRPE tampão de lavagem para a coluna e centrifugar para a 12.000 xg durante 20 seg. Descartar o filtrado. Novamente Aplicar 500 ul de tampão de lavagem RPE para a coluna e centrifugar para a 12.000 xg durante 2 min. Descartar o filtrado.
   9. Deslocar as colunas para novos tubos de recolha de 2 ml e centrifugar para a 12.000 xg durante 1 min. Transfira as colunas para tubo de 1,5 ml rotulado coleção e aplicar 22 mL de água livre de nuclease. Centrifugar os tubos a 12.000 xg durante 1 min.
   10. Retire o tubo de coleta e colocá-los no gelo. Quantificar RNA usando o sistema de eletroforese automatizada.
2. A concentração de RNA, pureza e teste de integridade.
   Para pureza e integridade RNA testando o uso sistema automatizado de eletroforese e respectivo kit ^33.

6. Estudos Microarray

1. Execute perfil transcricional uso de chips de matriz disponíveis Humanos comerciais. Para a preparação alvo de ARN, a fragmentação, hibridação ³⁴ e matrizcoloração de chips, lavagem ³⁵ de uso comercial kits disponíveis.
2. Execute matriz digitalização chip e controlo de qualidade, utilizando estação fluídica padrão, scanners e softwares de matriz operacionais padrão ^36. Para análise de expressão gênica importar os arquivos gerados a partir de scanners ao software comercial disponível padrão ^37, faça a correção de fundo, sumarização e normalização com Robust Multi-matriz Análise (RMA).
3. Para a lista de genes diferencialmente expressos obtenção (de DEG) execute uma forma análise ANOVA. A partir desta lista filtrar os genes com base na mudança de dobragem (± 2) e p-valor controlado-FDR (<0,05). Obter a Análise de Componentes Principais (PCA), Mapa de Calor, etc. usando este software.

Parte 2. Sistema UKN 1 Teste

1. A manutenção de células estaminais embrionárias humanas

1. Sementeira de MEFs
   1. Para a diferenciação usar o NSCB # 8534 (H9) linha celular. Cultura cells em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) como células alimentadoras. Revestimento frasco T25 com 4 ml de gelatina a 0,1% e incubar durante 30 min a 37 ° C.
   2. MEFs descongelamento em temperatura de 37 ° C banho de água e transferir as células em pré-aquecido DMEM / FBS a 10%.
   3. Rotação 3,5 min com 500 xg, remover o sobrenadante e as células re-suspensão para se obter 1 x 10 ⁷ células / ml. MEFs placa 4 x 10 ⁴ / cm ² em frascos T25 em gelatina. Opcionalmente, use as MEFs para os próximos dois dias. Qualidade de lotes MEF são uma questão muito crítica para a manutenção hESC. Portanto, é aconselhável para elucidar melhor a empresa e método de preparação para as células H9. Nós usamos PMEF P3.
2. Splitting e manutenção de H9
   1. Adicionar 1 ml de dispase pré-aquecido por balão T25 e incubar H9 9 min a 37 ° C.
   2. Adicionar 2 ml de meio de lavagem para células tratadas e dispase pipeta 5 vezes para cima e para baixo com uma pipeta de 5 ml e uma solução de células de transferência para um tubo Falcon.
   3. Lavar o frasco com 9 ml de meio de lavageme adicionar as células aos outros. Gire 3,5 min com 500 xg, remover o sobrenadante e células em meio de 10 ml hESC re-suspensão.
   4. Gire 3,5 min com 500 xg, remover o sobrenadante e células em meio 4 ml hESC re-suspensão. Adicionar 0,5 ml de suspensão de células e 4,5 ml de meio hESC e placa em uma nova (PBS lavado) frasco T25 com MEFs. Mudar inteiro forma células estaminais embrionárias humanas (5 ml) do balão de todos os dias.

2. Diferenciação de células estaminais embrionárias humanas no sentido Neuroectodérmicos células progenitoras (NEP)

1. Prepare meio hESC e médio KCM. Revestimento uma placa de 10 cm com gelatina (0,1% em PBS) por frasco T25 e incubar durante 30 min a 37 ° C. Remover o meio de células estaminais embrionárias humanas e adicionar Accutase suficiente para cobrir todo o fundo do frasco (1 ml por frasco T25) e incuba-se 25 a 30 min a 37 ° C.
2. Prepare a placas revestidas com matriz de membrana basal durante Accutase incubação. Adicionar frio DMEM / F12 para congelado membrana basal matriz pellet e resolvê-lo 01:20. Filtro de membrana basal da matriz Solução através de um filtro celular de 40 um. Adicionar solução filtrada para chapear, toda a parte inferior tem de ser coberta (1 ml por 6 poços é necessária) e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
3. Após o período de incubação remover a matriz sobrenadante membrana basal e as células de sementes nos poços revestidos. Após o passo Accutase (2.1) parar de reacção por adição de 1,5 ml de meio de HES. Raspe as células do frasco, adicionar 8 ml de meio hESC e produzir uma solução única célula por pipetagem com 10 ml pipeta completamente. Células filtrar através de um filtro de células 40 pm.
4. Células Spin 3 min com 500 xg, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de células estaminais embrionárias humanas. Células girar novamente 3 min com 500 xg, remover o sobrenadante e as células em células estaminais embrionárias humanas contendo inibidor ROCHA Y-27632 a uma concentração final de 10 uM re-suspender.
5. Remover o sobrenadante de gelatina revestida prato. Suspensão de células em placa de gelatina revestida prato para remover os MEFs e deixar na incubadora durante exactamente 1 h.
   NOTA: Durante esta etapa, os MEFs Will Settle sobre a placa de gelatina revestido, enquanto o hESC não pode anexar a gelatina. Por isso, esta é crucial para obter uma diferenciação livre-alimentador. É um passo crítico como incubação resultados muito longas em aglomerados hESC e muito curto de incubação na remoção ineficiente de MEFs. Após 45 min de incubação, a placa deve ser investigado para MEFs já se instalaram e touceiras hESC.
6. Quando as MEFs ter anexado, lavar suavemente as células não aderentes (células estaminais embrionárias humanas) fora após incubação com a forma já na placa. Se vários T25 foram usadas para obter mais células, as células individuais podem agora ser combinados. Lave placa uma vez com meio hESC.
7. Células Spin 3 min com 500 xg, remover o sobrenadante e as células em cerca de 4 ml KCM contendo 10 uM de inibidor ROCHA Y-27632 e de 10 ng / ml de FGF-2 de re-suspender.
8. Contagem de células em um hemocitómetro utilizando Trypan azul. Placa de 18 x 10 ³ células / ^cm2 em matriz da membrana basal em placas revestidas KCM contendo 10 uM de inibidor ROCHA Y-27632 e10 ng / ml de FGF-2 (6 bem para utilizar 1,5 ml por poço). É crucial para a chapa das células na densidade certa para diferenciá-los com sucesso em NEPs.
9. Após 24 h, a mudança do meio KCM fresco contendo 10 uM de inibidor ROCHA Y-27632 e de 10 ng / ml de FGF-2. Depois de mais de 24 horas, mudar de médio a KCM fresco contendo 10 ng / ml FGF2.
10. 72 horas após a semeadura das células, a diferenciação começa pela mudança do meio em direção a médio KSR. Este ponto de tempo é referido como o dia 0 de diferenciação (DoD0). A adição de substâncias de ensaio é possível agora.
11. Em DOD1 e DOD2 o meio é mudado exatamente como em DoD0. Próxima mudança médio está em DoD4 contendo 25% de N2-S e 75% KSR. No DoD6 a diferenciação é parado e as células são colhidas para análise.

3. imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de hESC e NEP

1. Preparação dos núcleos
   1. Adicionar 500 ul a cada 6 Accutase bem que deve ser analisada e incubar durante 25 a 30 min. Coucélulas nt em uma câmara de Neubauer utilizando Trypan azul.
   2. Ressuspender as células em formaldeído a 1% em meio DMEM / F12 para reticulação. Adicionar Tris pH 7,5 até uma concentração final de 125 mM depois de 10 minutos para interromper a reticulação.
   3. Células Spin 3 min com 500 xg, a 4 ° C, remover o sobrenadante e ressuspender as células em PBS frio.
   4. Células Spin 3 min com 500 xg, a 4 ° C, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de tampão / L1- 1 x 10 ⁶ células.
   5. Incubar durante 5 min em gelo. Rotação 5 min com 800 xg, a 4 ° C, remover o sobrenadante e re-suspensão núcleos em 1 ml de tampão / L2- 2 x 10 ⁶ células.
2. Sonication e controle de qualidade
   1. Sonicar de modo que os fragmentos de ADN de 300-700 pb de comprimento são gerados. Spin 1 min com 10.000 xg, a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Os fragmentos necessitam de ter o tamanho correcto, caso contrário, a imunoprecipitação será ineficaz, assim como a qPCR seguido.
   2. Remover 50 pi anmix d com tampão L2 50 ul de verificar a eficiência de sonicação executando um gel de agarose.
   3. Inversa reticular por incubação a 65 ° C durante 4 horas e 500 rpm. Carregar as amostras 1: 5 com Orange G corante de carga sobre um gel de agarose a 1,5% e correr 45 min a 110 V, em tampão 1 x TBE. O tamanho do fragmento de controlo (deverá situar-se entre 300-700 pb).
3. Cromatina imunoprecipitação
   1. Dilui-se as amostras 1: 5 em tampão de diluição e alíquota de 1 ml por PI em tubos siliconizados.
   2. Retirar a 5% (volume) de amostra diluída cromatina (passo 3.3.1) e armazenar a 4 ° C como "input".
   3. Incubar as amostras com anticorpos de sua escolha e com IgG inespecífica O / N a 4 ° C num rotor.
   4. Adicionar 50 ul de proteína A / G Sefarose grânulos de cada amostra após imunoprecipitação. Incubar as amostras 3 h a 4 ° C num rotor. Spin 1 min com 1.500 xg, a 4 ° C e remover o sobrenadante.
   5. Lava-se com 1 mL de pérolas de lavagem. Rotação 1 min com 1.500 xg, a4 ° C e remover o sobrenadante. Repita o passo g para h. Lava-se com 1 ml de tampão de lavagem final. Durante as etapas de lavagem você não deve perder qualquer das esferas, porque isso altera a quantidade de fluido diretamente.
   6. Centrifugar 1 min com 1.500 xg, a 4 ° C e remover o sobrenadante. Adicionar 125 ul de tampão de eluição e incubar 15 min com 65 ° C a 1000 rpm num agitador.
   7. Gire 1 min com 1.500 xg e transferir o sobrenadante para um novo tubo Repita etapa k e l. Adicionar 200 ul de tampão de eluição de entrada (3.3.2). Adicionar proteinase K e ARNase a cada amostra e incubar 30 min com 37 ° C a 500 rpm num agitador e depois de 4 h, com 65 ° C a 500 rpm num agitador.
      NOTA: Para a extração de DNA uso comercial disponível chip de DNA Limpo e Concentrador Kit ^38.

Resultados

Exposição ao mercúrio de metilo em sistema de teste UKK

O ensaio de citotoxicidade foi realizado com H9 EBS para obtenção de um valor de IC ₁₀ (redução de viabilidade até 10%) para a citotoxicidade de metil-mercúrio (Figura 1). Também foi realizada uma microarray baseado (plataforma Affymetrix) estudo biomarcador. A H9 EB foram expostos ao mercúrio de metilo (0,25 e 1 uM) durante 14 dias. No dia 14, as amostras foram recolhidas utilizando TRIzol e o ARN...

Discussão

As abordagens tradicionais de testes toxicológicos envolvem estudos com animais extensas tornando assim o teste caro e demorado. Além disso, devido às diferenças entre espécies nos estudos pré-clínicos de segurança nos animais nem sempre são válidos para prever os efeitos de toxicidade de drogas potencialmente relevantes para os seres humanos. Apesar de primatas não-humanos são mais previsíveis, ainda forte ética e demandas socioeconômicas estão aumentando rapidamente por sociedades modernas para o desen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Knockout Serum Replacement
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	GlutaMAX supplement
NEAA	Life Technologies	11140050	MEM Nonessential Amino Acids Solution
DPBS	Life Technologies	14190-0144	Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium
mTeSR medium	Stemcell Technologies	5850
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
V bottom plate	VWR	734-0483	Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST
V bottom plate lid	VWR	634-0011	Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled Water	Life Technologies	15230-089.	Sterile Distilled Water
Human FGF-2 (bFGF)	Millipore	GF003AF-100UG	Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μm	Millipore	SCGPU02RE	Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
StemPro EZPassageTM Disposablte	Invitrogen	23181010
BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix	Stemcell Technologies	354277	5 ml vial
DMSO	Sigma	D-2650
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7020	It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples.
70 μm Cell Strainer	Becton Dickinson	352350	Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube	Becton Dickinson	352235	5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
50 ml sterile Polypropylene tube	Greiner Bio-One	227261	50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flask	Greiner Bio-One	658175	CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TRIzol	Life Technologies	10296010
96 well optical bottom plates	Thermo Scientific	165305
CellTiter-Blue	Promega	G8081
Accutase	PAA	L11-007
Apotransferin	Sigma-Aldrich	T-2036
Dispase	Worthington Biochemicals	LS002104
Dorsomorphin	Tocris Bioscience	3093
EDTA	Roth	8043.2
FBS	PAA	A15-101
FGF-2	R&D Systems	233-FB
Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-100G
GlutaMAX	Gibco Invitrogen	35050-038
HEPES	Gibco Invitrogen	15630-056
Insulin	Sigma-Aldrich	I-6634
Knockout DMEM	Gibco Invitrogen	10829-018
Matrigel	BD Biosciences	354234
Noggin	R&D Systems	719-NG
PBS	Biochrom AG	L1825
Progesteron	Sigma-Aldrich	P7556
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris Biosciences	1254
SB431542	Tocris Biosciences	1614
SDS	Bio-Rad	161-0416
Selenium	Sigma-Aldrich	S-5261
β-Mercaptoethanol	Gibco Invitrogen	31350-010
[header]
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250)	QIAGEN	74106
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit	Affymetrix	900721, 22, 23	This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays.
Rnase-Free DNase Set	QIAGEN	79254
[header]
List of equipment
Inverted microscope	Olympus		IX71
Genechip Hybridisation Oven - 645	Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450	Affymetrix
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G	Affymetrix
Spectramax M5	Molecular Devices
[header]
List of softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory