El código de barras genético con proteínas fluorescentes para aplicaciones multiplexados

Resumen

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Resumen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introducción

Tecnologías como la espectroscopia de fluorescencia, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo, todos se basan en la fluorescencia, una propiedad ampliamente explotado en aplicaciones bioquímicas, biomédicas y químicas. Fluorescencia, ya sea intrínseco o mediante el etiquetado, se ha explotado para el análisis de patrones de expresión de la proteína y perfiles, el destino celular, interacciones de proteínas y funciones biológicas ^1-9, y por medio de la fluorescencia / Förster de transferencia de energía de resonancia para la detección de interacciones de biomoléculas y los cambios conformacionales ^10-13. Desde el aislamiento de la proteína fluorescente verde victoria Aequorea (GFP) ^14, el descubrimiento de que ocurren naturalmente proteínas fluorescentes adicionales de otros cnidarios, en particular los corales, ha aumentado en gran medida el número de proteínas fluorescentes distinguibles existentes con espectros de excitación / emisión. Estos, junto con la introducción de mutaciones en sus genes ^15-19, have amplió aún más las posibilidades, la obtención de una verdadera paleta de proteínas fluorescentes disponibles para los científicos que explotan la microscopía, citometría de flujo y otras tecnologías basadas en fluorescencia para su investigación.

En paralelo, aunque de forma independiente, el desarrollo de la tecnología retroviral ha facilitado drásticamente la expresión estable de la información genética en células de mamíferos ectópico ^20-23. Por lo tanto, no es sorprendente que esta tecnología ha sido utilizada para transferir genes de proteínas fluorescentes en un amplio número de tipos de células y tejidos ^24-28 o para la producción de animales transgénicos ^29-31. Después de la naturaleza de los retrovirus, la información genética de la proteína fluorescente ectópico se introduce dentro del genoma de la célula ³² y la célula se vuelve fluorescente `para ever'. Esta propiedad ha permitido el seguimiento del destino de las células, o de una sola célula dentro de una población de células. La célula ahora fluorescente tiene así adquiel rojo su propio biofirma y puede definirse como códigos de barras. Su biofirma único identifica de otras células, y esto es importante, lo distingue de células manipuladas genéticamente para expresar diferentes proteínas fluorescentes distinguibles con espectros de absorción / emisión. Las aplicaciones biológicas, tales como el seguimiento de los factores de reprogramación hacia la pluripotencia ^33, el análisis de los factores subnuclear para el esclarecimiento de localización nucleolar ^34, la construcción de plásmidos indicadores fluorescentes para estudios transcripcionales ³⁵ o el etiquetado genética de las neuronas para el estudio de arquitectura de red neuronal ³⁶ , son sólo cuatro ejemplos de los muchos que han explotado diferentes genes de proteínas fluorescentes para la misma configuración experimental.

La citometría de flujo ha sido ampliamente utilizado para el análisis de los procesos biológicos a nivel de células individuales, tales como la expresión génica, el ciclo celular, la apoptosis y la señalización a través de fosforiloación ^37-43 .La expresión estable de los genes de proteínas fluorescentes en células de mamífero ha mejorado aún más la utilidad de la citometría de flujo para el análisis celular ^38,44 y las interacciones ligando-receptor ^45. Reforzar la capacidad han permitido que la citometría de flujo para convertirse en una metodología ampliamente utilizada para alto rendimiento y alto contenido de cribado ^46. A pesar del número ahora ampliada de fluorómetros y robótica tecnologías que pueden sistemas de lectura de placas pareja, imágenes y citometría de flujo, parece que hay una falta en el diseño experimental que puede explotar y adaptarse a estas capacidades tecnológicas mejoradas.

Metodologías basadas en células rápidas, confiables, simples y robustas están drásticamente necesarios para aplicaciones multiplexados que mejoran aún más la capacidad de alto rendimiento. Esto es especialmente cierto en el campo del descubrimiento de fármacos en ensayos basados ​​en células de ingeniería en un formato multiplexado pueden mejorar el poder de cribado de alto rendimiento ^39,47-50 . Multiplexación, ya que permite analizar simultáneamente en una muestra, mejora aún más las capacidades de alto rendimiento ^51-54. Los códigos de barras genético fluorescente no sólo permite la multiplexación elegante, sino también, una vez diseñada, evita la necesidad de protocolos que consumen tiempo, reduce los costes acompañados con anticuerpos, los granos y las manchas ^39,52,55, y puede reducir el número de pantallas de alta requeridas para aplicaciones de rendimiento. Recientemente hemos descrito cómo la tecnología puede mejorar retroviral multiplexación mediante código de barras genético fluorescente para aplicaciones biológicas, mediante la expresión de un ensayo desarrollado previamente para controlar el VIH-1 actividad de la proteasa ^56,57 con diferentes variantes clínicamente prevalentes ^58. La metodología se explica de una manera más descriptiva se centra en la forma de seleccionar y amplificar las células genéticamente con código de barras fluorescentes y cómo producir paneles de poblaciones clonales que expresan proteínas fluorescentes distintas y / o diferente intensit fluorescenciaies. Los paneles de las poblaciones de células diferenciadas en función de sus características fluorescentes mejorar las capacidades multiplexados, que pueden ser más explotado en combinación con ensayos basados ​​en células que abordan diferentes cuestiones biológicas. El protocolo también se describe cómo diseñar un grupo de células con código de barras que llevan uno de los ensayos basados ​​en células previamente desarrollados en el laboratorio, como ejemplo ^59. Este protocolo lo tanto, no se pretende mostrar la tecnología bien establecida retroviral / lentiviral para la transferencia genética, el valor de las proteínas fluorescentes o las aplicaciones de la citometría de flujo ^60,48 sino más bien para mostrar el poder de la mejora de la combinación de los tres para aplicaciones multiplexados.

Protocolo

1. Preparación de células de mamíferos, la producción viral y Transducción de códigos de barras genético

1. Placa de 2,5 x 10 ⁶ células adherentes en una placa de 10 cm (o alrededor de 50-60% de confluencia) un día antes de la transfección en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de ternera fetal (FCS). Para retroviral uso de producción de envases línea celular de elección, como Phoenix-GP (una especie de regalo de Gary Nolan, la Universidad de Stanford).
   NOTA: La línea celular de empaquetamiento expresa de forma estable las proteínas Gag y Pol para la formación de partículas retrovirales en trans. Hacer que las células estén sanas y adherido a la placa en una monocapa, antes de la transfección.
2. 24 horas más tarde, preparar la mezcla de transfección de ADN.
   1. Para 125 l de DMEM libre de suero añadir 3 g de la estomatitis vesicular envoltura del virus vector glicoproteína (PCI-VSVG) y 3 g de vector de transferencia que lleva el gen de la proteína fluorescente de interés. Mezclar y añadir 15 l de polietilimina (2 mg / ml).
   2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min y añadir a las células gota a gota.
      NOTA: polietilimina se añade a la mezcla de ADN homogéneo como reactivo de transfección para la formación de poliplejos. Con el fin de obtener partículas virales que llevan diferentes marcadores de proteínas fluorescentes, realice cada transfección independiente con el marcador de elección. Recuerde que el vector de transferencia retroviral es de alrededor de 7 kb de longitud y no puede ser empaquetado si es superior a 10 kb.
3. Incubar las placas a 37 ° C. Con el fin de aumentar la producción de placas virales lugar a 30 ° C o 32 ° C en lugar.
   NOTA: 24 el medio de transfección enviar hr pueden ser reemplazados con 7 ml de medio fresco, y aunque esto puede mejorar la salud de las células que pueden disminuir la carga viral en el sobrenadante.
4. Después de la transfección de 48 horas a recoger las partículas virales que contiene sobrenadante y filtrar con un filtro de 0,45 mM politetrafluoroetileno. Utilice sobrenadante viral recién recogida para la transducción. OthDe otro mantener sobrenadante en alícuotas a -80 ° C y evitar la congelación-descongelación. Recuerde que el título viral disminuirá probablemente hasta un 50% con cada ciclo de congelación-descongelación.
5. Línea celular Placa de elección 24 horas antes de la transducción si adherente, o inmediatamente antes de la transducción si no adherente. Semillas 2,0 x 10 ⁵ a 3,0 x 10 ⁵ células adherentes (aquí Eh 7.5.1 y HEK 293T) o 5.0 x 10 ⁵ a 1 x 10 ⁶ células no adherentes (aquí SupT1) por pocillo en una placa de 6 pocillos.
   NOTA: Asegúrese de calibrar el número de células que se sembró antes de la transducción, especialmente para las células adherentes, por lo que las células alcanzan una confluencia del 60% en el momento de la transducción.
6. Añadir 5 g / ml polibreno (bromuro de hexadimethrene) a las células sembradas y luego añadir sobrenadante viral recogido previamente para obtener alrededor de 20-40% de infección (en este caso 2 ml).
   NOTA: El MOI o porcentaje de infección es principalmente arbitraria, como la clasificación permitirá amplificar cualquier subpopulation de las células. Obviamente, una mayor tasa de infección facilita y acelera el proceso de amplificación.
7. Transducir células por centrifugación en un rotor de cubo colgante en 1500 xg durante 120 min a 32 ° C. Resuspender las células no adherentes con medio fresco antes de la incubación. Para células adherentes, reemplazar con fresco medios 24 horas después de la transducción.
   NOTA: Se recomienda sellar las placas antes de la centrifugación con parafilm para evitar que se derrame más. Para aumentar la diversidad de células genéticamente con código de barras, transducir las células con partículas virales que llevan diferentes proteínas fluorescentes (obtenidas de la etapa 1.4). Al elegir los marcadores fluorescentes, asegúrese de que son compatibles con la instrumentación y tienen parámetros fluorescentes distinguibles.

2. Selección y Amplificación de células genéticamente con código de barras

1. Analice las células de mamíferos transducidas por citometría de flujo, al menos, 72 h después de transducción para cuantificar el porcentaje de transducción. Utilice una línea de células no transducidas comparable como control negativo.
   NOTA: Como clasificación se utiliza para purificar poblaciones celulares con códigos de barras individuales, un alto porcentaje de transducción inicial, aunque no es necesario, debe acelerar el proceso de amplificación.
2. Utilizar la célula clasificador de elección para obtener las células que expresan la proteína de interés.
   1. Para ello, asegúrese de que las puertas se han establecido correctamente en los canales adecuados.
      1. Para ello utilice la misma línea celular ingenuo como control negativo y ajustar la tensión parámetro / canal para que el negativo de la población está por debajo del valor de 10 ³ en cada eje fluorescente. Determinar gating para fluorescencia positiva como eventos que aparecen por encima de la del control negativo para cada canal fluorescente.
   2. Tenga en cuenta que cada instrumento puede variar y el voltaje correcto para determinar compuerta debe ajustarse en consecuencia, por lo que los controles positivos y negativos imperativas en cada expconfiguración erimental.
      1. Para la detección de fluorescencia en este montaje experimental utilizar el canal FITC (filtro de paso de banda 530/30 procedió por un filtro de paso 502 de largo) para EGFP, el canal de PE (filtro de paso de banda 585/42 procedió por un filtro 556 pase) para td Tomate , y el canal de APC (filtro de paso de banda 660/20) para E2 Crimson.
         NOTA: El láser de 488 nm excita eGFP y td tomate mientras E2 Carmesí es excitado por el láser de 633 nm.
3. Ordenar en tubos de 15 ml cónicos con 1 ml de 100% de FCS.
   NOTA: El proceso de clasificación de las poblaciones de células fluorescentes no es obligatorio, según se puede proceder directamente con la especie de clones individuales (véase más adelante). Ordenando las poblaciones ajustados basados ​​en fluorescencia elegido asegura una población de copia de seguridad para la futura selección de clones individuales. Tenga en cuenta que las células individuales son a veces difíciles de cultivar, mientras que una gran población de células puede ser fácilmente congelado, y luego descongelado y se amplifica en una etapa posterior.
4. Spen bajar las poblaciones clasificadas en un rotor centrífugo cubo colgado en 524 g en 32 ° C durante 5 min para sedimentar las células. Vuelva a suspender en 1 ml de medio fresco, y volver a la placa de células de modo que la confluencia de células es inferior al 60% para permitir el crecimiento y la división durante al menos dos días.
   1. Por ejemplo, las células adherentes placa a alrededor de 3 x 10 ⁵ células en 2 ml de medio por pocillo en una placa de 6 pocillos y 2 x 10 ⁶ células en 2 ml de medio en una placa de 6 cm. Utilice DMEM para las células adherentes y RPMI para las células no adherentes (o cualquier medio especificado si se requiere). Coloque células sembradas en una incubadora a 37 ° C durante varios días para permitir la amplificación.

3. Obtener clonales poblaciones de células genéticamente con código de barras en diferentes intensidades

1. Obtener poblaciones clonales de células transducidas originalmente (paso 1.7) o de la población ordenada (paso 2.3).
   NOTA: Esto asegurará nivel igual o similar de expresión de la proteína fluorescente entre todos la células dentro de la población (una población apretado con una pequeña CV en la intensidad de fluorescencia media de hasta 40%).
   1. Para ello, las células tipo individuales en placas de 96 pocillos con una unidad de deposición de células automatizado (ACDU). Establecer puertas para la clasificación de acuerdo con la población de interés. Asegurar puertas se establecen al menos un registro escala aparte para obtener poblaciones distinguibles al elegir las células en diferentes intensidades fluorescentes. Para el procedimiento que se muestra aquí, utilizar la misma citometría de flujo experimental establecido como el descrito en el paso 2.2.
2. Amplificar clones individuales en una incubadora a 37 ° C durante al menos 2 semanas. A través del proceso de amplificación analizar las células bajo el microscopio para asegurar que las poblaciones en crecimiento originan en las células individuales y no de más de uno.
   NOTA: Recuerde que el clasificador colocará una célula por pocillo en promedio, y mientras algunos pozos pueden no tener ninguna célula en absoluto, otros pueden tener más de uno.
   1. Para asegurar que una población surge de una célula única, extremadamente suave con la placa y nunca molestar a los pozos con la pipeta. Observar la placa, así por así, bajo el microscopio.
      NOTA: Mientras que las células individuales pueden ser difíciles de identificar, una vez que comience a dividirse serán fácilmente reconocibles a veces.
   2. Tenga en cuenta que a menudo las células 'mata' a lo largo de los bordes. Deseche los pozos donde se pueden observar múltiples poblaciones clonales y mantener los que tienen una población ajustada.
      NOTA: Es recomendable transferir aquellos en los platos más grandes para la amplificación.
3. Se tamizan los poblaciones clonales putativos mediante el análisis de ellos por citometría de flujo. Comparación de ellos con un control negativo utilizando la misma configuración experimental citometría de flujo.
   1. Analizar sólo un porcentaje de la muestra y mantener el resto como reserva. Elija las poblaciones más claramente separados basados ​​en la intensidad media y opresión de la población. Amplificar según sea necesario o congelar las existencias enmedio de congelación con 20% de glicerol a -80 ° C durante períodos cortos de tiempo o nitrógeno líquido durante más tiempo.
      NOTA: Recuerde que una "verdadera" población clonal debe tener un patrón de fluorescencia muy apretado.

4. Asegúrese de Capacidades de multiplexación para selección de alto rendimiento (HTS)

1. Combinar tantos poblaciones clonales distintas según sea necesario que puede ser utilizado adicionalmente en un formato multiplexado. Elige clones con la absorción / espectros de emisión distinguible y / o diferentes intensidades. Si se utiliza un formato de placa de 96 pocillos, que es adecuado para HTS, semilla de 50.000 células en 200 l por pocillo.
   NOTA: Tenga en cuenta que el número de células es sólo una estimación y puede cambiar en función del tipo de célula y si es adherente o no.
2. Analizar la muestra utilizando citometría de flujo para garantizar que cada una de las líneas de células fluorescentes establecidas independientes se pueden distinguir unos de otros. Antes de preparar el análisis negativoy los controles de un solo color para ajustar los parámetros y los valores de compensación.
   NOTA: Ajuste de los parámetros para distinguir claramente las poblaciones mixtas les permita ser utilizada además en un formato multiplexado.

5. Adaptar líneas celulares genéticamente con código de barras a la aplicación biológica de Elección

1. Transducir líneas celulares establecidas con códigos de barras genéticamente con partículas virales que contienen los elementos de ensayo de elección, como se describe aquí en Stolp et al., 2013 ^59. Recuerde que el ensayo de elección debe ocupar un canal fluorescente adicional y distinguibles y por lo tanto se va a transferir a la línea celular con código de barras apropiado.
   NOTA: Cada línea celular con código de barras puede soportar un ensayo diferente.
2. Células con código de barras Ordenar genéticamente fluorescentes para aquellos que contienen elementos de ensayo.
   NOTA: elementos de ensayo pueden ser diseñados junto a una etiqueta o proteína fluorescente (como una fusión o a través de un sitio interno de entrada al ribosoma) fo detección directa a través de Western Blot, citometría de flujo o microscopía. El sistema utilizado en este protocolo se basa en la expresión de superficie HA epítopo solo, o con la expresión epítopo FLAG adicional.
   1. Manchar las poblaciones clonales que contienen el ensayo con anticuerpos acoplados HA y APC con fluorescencia. Luego de analizar las poblaciones clonales con anti-FLAG y la tinción de anticuerpos conjugados con FITC.
   2. Para rastrear el ensayo, analizar o "descifrar" las poblaciones en el canal adecuado, donde las líneas de células genéticamente distintas con códigos de barras se pueden distinguir. Aquí, decodificar la naturaleza del sustrato mediante el análisis en el canal de PE para la detección de tomate td.

Resultados

Multiplexing fluorescente barcoded genéticamente células con el propósito de aplicaciones biológicas sólo puede lograrse una vez que se han generado poblaciones clonales individuales. Multiplexación es más efectiva cuando las poblaciones con códigos de barras tienen características fluorescentes distintas claras con solapamiento espectral mínima. El ejemplo mostrado en la Figura 1 con poblaciones clonales de células de mamíferos SupT1 ilustra que las células con códigos de barras con mCher...

Discusión

Aquí dos procedimientos bien establecidos se han combinado; la ingeniería genética a través de la tecnología retroviral y la detección de proteínas fluorescentes utilizando citometría de flujo. Los códigos de barras genético basado en una proteína fluorescente para la producción de líneas celulares únicos proporciona una manera simple y robusta para aplicaciones multiplexados. La generación de células con código de barras de ingeniería genética a través de la tecnología retroviral, es un principio d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter	Pall Corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2 mg/ml concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells