Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

טכנולוגיות כגון ספקטרוסקופיה הקרינה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי וcytometry זרימה, כל להסתמך על הקרינה, רכוש ניצל נרחב ביישומים ביוכימיים, ביו-רפואיים, וכימיים. הקרינה, בין אם פנימי או באמצעות תיוג, נוצל לניתוח דפוסי חלבון ביטוי ופרופילים, גורל תא, אינטראקציות חלבון ותפקודים ביולוגיים ^1-9, ובאמצעות הקרינה / העברת אנרגיית תהודת פורסטר לצורך זיהוי של אינטראקציות biomolecule ושינויי קונפורמציה ^10-13. מאז את בידודו של חלבון Aequorea ויקטוריה הירוק הניאון (GFP) ^14, הגילוי של חלבוני ניאון טבעיים נוספים מצורבים אחרים, במיוחד אלמוגים, במידה רבה הגדיל את מספר חלבוני ניאון הקיים עם ספקטרום עירור / פליטה להבחין. אלה, יחד עם ההקדמה של מוטציות בגנים שלהם ^15-19, havהדואר הרחיב עוד יותר את האפשרויות, קבלת צבעים נכונים של חלבוני ניאון זמינים למדענים המנצלים מיקרוסקופיה, cytometry זרימה וטכנולוגיות מבוססי הקרינה אחרות למחקר שלהם.

במקביל, אם כי באופן עצמאי, הפיתוח של טכנולוגית retroviral אופן דרסטי הקל הביטוי היציב של מידע גנטי מחוץ לרחם בתאי יונקים ^20-23. לכן אין זה מפתיע כי טכנולוגיה זו נעשתה שימוש כדי להעביר את הגנים של חלבוני ניאון למספר רחב של סוגי תאים ורקמות ^24-28 או לייצור בעלי החיים מהונדסים ^29-31. בעקבות הטבע של רטרווירוסים, המידע הגנטי של החלבון פלואורסצנטי מחוץ לרחם הוא הציג בתוך הגנום של התא ³² והתא הופך ניאון 'לever'. מאפיין זה מאפשר מעקב אחר גורל תא, או של תא בודד בתוך אוכלוסייה של תאים. התא עכשיו הניאון יש בכך אקיאדום biosignature משלו ויכול להיות מוגדר כהמבורקד. biosignature הייחודי שלה מזהה אותו מהתאים אחרים, וחשוב מכך, מבדיל אותו מהתאים גנטי מניפולציות להביע חלבוני ניאון שונים עם ספקטרום קליטה / פליטה להבחין. יישומים ביולוגיים כגון המעקב של גורמי תכנות מחדש לקראת pluripotency ^33, הניתוח של גורמי subnuclear להבהרת לוקליזציה nucleolar ^34, הבנייה של פלסמידים כתב ניאון ללימודי תעתיק ³⁵ או התיוג הגנטי של תאי עצב לחקר ארכיטקטורת רשת עצבית ³⁶ , הן רק ארבעה דוגמאות של רב שנצלו גני חלבון פלואורסצנטי שונים עבור אותו התקנה ניסיונית.

Cytometry זרימה כבר בשימוש נרחב לניתוח של תהליכים ביולוגיים ברמת התא הבודד, כגון ביטוי גנים, מחזור תא, אפופטוזיס, ואיתות באמצעות phosphorylation ^37-43 .the ביטוי יציב של גני חלבון פלואורסצנטי בתאי יונקים שיפר עוד יותר את השירות של הזרימה cytometry לאינטראקציות תא ניתוח ^38,44 ויגנד לקלוט ^45. יכולות משופרות אפשרו זרימת cytometry להפוך למתודולוגיה שימוש נרחב לתפוקה גבוהה וגבוה תוכן הקרנת ^46. למרות המספר כעת המורחב של fluorometers ורובוטיקה טכנולוגיות שיכולים מערכות צלחת זוג קורא, הדמיה וcytometry זרימה, נראה שיש חוסר בתכנון ניסוי שיכול לנצל ולהתאים את יכולות טכנולוגיות משופרות אלה.

מתודולוגיות מבוססות תאים מהיר, אמינות, פשוטות וחזקה יש צורך באופן דרסטי עבור יישומים מרובבים שיחזקו את יכולת תפוקה גבוהה. הדבר נכון במיוחד בתחום של גילוי תרופות שבו מבחני מבוססי תאי הנדסה בפורמט ריבוב יכולים לשפר את הכח של הקרנת תפוקה גבוהה ^39,47-50 . ריבוב, שכן היא מאפשרת ניתוחים בו זמנית במדגם אחד, משפר עוד יותר את יכולות תפוקה גבוהה ^51-54. barcoding הגנטי ניאון לא רק מאפשר לריבוב אלגנטי, אלא גם, מהונדס פעם, עוקף את הצורך של פרוטוקולי זמן רב, מפחית את עלויות מלווים בנוגדנים, חרוזים וכתמים ^39,52,55, ויכול להפחית את מספר המסכים הנדרש לגבוה יישומי תפוקה. יש לנו תארנו לאחרונה איך retroviral טכנולוגיה יכול לשפר את הריבוב דרך barcoding הגנטי ניאון עבור יישומים ביולוגיים, בהבעת assay שפותח בעבר כדי לעקוב אחר פעילות פרוטאז HIV-1 ^56,57 עם גרסאות קליניות נפוצות שונות ^58. המתודולוגיה מוסברת באופן תיאורי יותר התמקדות על איך לבחור ולהגביר תאי המינימרקטים גנטי ניאון ואיך לייצר פנלים של אוכלוסיות משובטים להביע חלבוני ניאון שונים ו / או intensit הקרינה שונהies. פנלים של אוכלוסיות תאים להבחין בהתבסס על מאפייני הניאון שלהם לשפר את יכולות מרובבות, אשר ניתן לניצול נוסף בשילוב עם מבחני מבוססי תאים שהתמודדות עם שאלות ביולוגיות שונות. הפרוטוקול מתאר גם כיצד להנדס פנל של תאי המינימרקטים נושא אחד מבחני מבוססי תאים שפותחו בעבר במעבדה, כמו בדוגמה של ^59. פרוטוקול זה ולכן לא נועד להראות את הטכנולוגיה מבוססת היטב retroviral / lentiviral להעברה גנטית, את הערך של חלבוני ניאון או היישומים של זרימת cytometry ^60,48 אלא כדי להראות את כוח שיפור של שילוב שלושה עבור יישומים מרובבים.

Protocol

1. הכנת תאי יונקים, ייצור נגיפים ותמרה לBarcoding הגנטי

1. צלחת 2.5 x 10 ⁶ תאים חסיד בצלחת 10 סנטימטר (או confluency סביב 50-60%) יום אחד לפני transfection במדיום הנשר (DMEM) עם 10% עוברי עגל בסרום (FCS) שונה Dulbecco. לתא-קו אריזת שימוש ייצור retroviral של בחירה כגון הפניקס-GP (מתנה מסוג גארי נולאן, אוניברסיטת סטנפורד).
   הערה: קו תא אריזה ביציבות מבטאת חלבוני Gag ופול להיווצרות חלקיקי retroviral בטראנס. להפוך תאים בטוחים בריאים ודבקו בצלחת בשכבה, לפני transfection.
2. 24 שעות מאוחר יותר, להכין את תערובת transfection DNA.
   1. 125 μl של סרום ללא DMEM להוסיף וקטור 3 מיקרוגרם מעטפת וירוס לפוחי Stomatitis גליקופרוטאין (PCI-VSVG) ו -3 מיקרוגרם של וקטור העברה נושא את גן חלבון פלואורסצנטי של עניין. לערבב ולהוסיף 15 μl של polyethylimine (2 מ"ג / מיליליטר).
   2. דגירה תערובת בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות ולהוסיף לתאים הנפתח חכם.
      הערה: Polyethylimine מתווסף לתערובת הומוגנית DNA כמגיב transfection ליצירת polyplexes. על מנת לקבל את החלקיקים נגיפיים ביצוע סמני חלבון ניאון שונים, לבצע כל transfection באופן עצמאי עם הסמן של בחירה. זכור כי וקטור העברת retroviral הוא סביב 7 קילו באורך ולא ניתן לארוז אם מעל 10 קילו-בייט.
3. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס. על מנת להגדיל את צלחות מקום ייצור נגיפיות על 30 מעלות צלזיוס או 32 ° C במקום.
   הערה: ניתן להחליף 24 תקשורת transfection הודעה hr עם 7 מיליליטר של תקשורת טריות, ואם כי זה עשוי לשפר את בריאות תא זה עלול להפחית עומס נגיפי בsupernatant.
4. לאחר transfection 48 שעות לאסוף את החלקיקים המכיל supernatant ויראלי ומסנן עם מסנן 0.45 מיקרומטר polytetrafluoroethylene. השתמש supernatant ויראלי טרי שנאסף עבור התמרה. Otherwise לשמור supernatant בaliquots ב -80 ° C ולהימנע להקפיא להפשיר. זכור כי כייל נגיף יקטן כנראה עד 50% בכל מחזור ההקפאה-הפשרה.
5. שורת תאי צלחת של בחירת 24 שעות לפני התמרה אם חסיד, או מייד לפני התמרה אם לא חסיד. זרעי 2.0 x 10 ^5-3.0 x 10 ⁵ תאים חסיד (כאן הא 7.5.1 וHEK 293T) או 5.0 x 10 ⁵ ל 1 x 10 ⁶ תאים שאינם חסיד (כאן SupT1) לכל גם בצלחת 6-היטב.
   הערה: הקפד לכייל את מספר התאים שנזרע לפני התמרה, במיוחד לתאים חסיד, כך שתאים להשיג confluency של כ -60% בזמן של התמרה.
6. הוסף 5 מיקרוגרם / מיליליטר polybrene (ברומיד hexadimethrene) לתאי זרע ולאחר מכן להוסיף supernatant ויראלי שנאסף בעבר להשיג סביב 20-40% זיהום (כאן 2 מיליליטר).
   הערה: משרד הפנים או אחוז מהזיהום הוא בעיקר שרירותית, כמו מיון יאפשר להגביר כל subpopulatיון של תאים. כמובן, שיעור גבוה יותר של זיהום מקל ומאיץ את התהליך של הגברה.
7. Transduce תאים על ידי צנטריפוגה בהרוטור דלי תלייה ב 1500 XG במשך 120 דקות ב 32 מעלות צלזיוס. Resuspend תאים שאינם חסיד עם תקשורת טרי לפני הדגירה. לתאים חסיד, להחליף עם תקשורת 24 לאחר התמרה-hr טרי.
   הערה: מומלץ לאטום את הצלחות לפני צנטריפוגה עם parafilm כדי למנוע שפיכה מעל. כדי להגדיל את המגוון גנטי של תאי המינימרקטים, transduce תאים עם חלקיקים נגיפיים ביצוע חלבונים שונים ניאון (המתקבלים משלב 1.4). בעת בחירת סמני ניאון, לוודא שהם תואמים את המכשור ויש להם פרמטרים ניאון להבחין.

2. בחירה והגברה של תאי המינימרקטים גנטי

1. לנתח תאי יונקים transduced על ידי הזרימה cytometry לפחות 72 שעות לאחר התמרה לכמת את שיעור אחוז של התמרה. השתמש בשורת תאים-transduced שאינו דומה כביקורת שלילית.
   הערה: ככל מיון ישמש לטהר אוכלוסיות בודדות המינימרקטים תא, שיעור אחוז גבוה של התמרה ראשונית, ואילו לא נחוץ, צריך להאיץ את התהליך של הגברה.
2. לנצל את התא-סדרן של בחירה כדי לקבל את התאים המבטאים את החלבון של עניין.
   1. לשם כך, להבטיח את השערים מוגדרים כהלכה בערוצים הנכונים.
      1. לשם כך להשתמש באותו קו התא נאיבי כביקורת שלילית ולהגדיר את מתח פרמטר / ערוץ, כך שהאוכלוסייה השלילית היא מתחת לערך של 10 ³ על כל ציר ניאון. לקבוע gating לקרינה חיובית כאירועים המופיעים מעל זה של הביקורת השלילית עבור כל ערוץ ניאון.
   2. להיות מודע לכך שכל מכשיר עשוי להשתנות והמתח הנכון לקביעת gating צריך להיות בהתאם, מה שהופך את בקרות חיוביות ושליליות הכרחיים בכל expהתקנת erimental.
      1. לגילוי הקרינה בהגדרת ניסוי זה להשתמש בערוץ FITC (מסנן 530/30-פס, ולפניו לעבור סינון ארוך 502) לeGFP, ערוץ PE (מסנן 585/42-פס, ולפניו מסנן 556 מסירה ארוכה) לtd עגבניות , וערוץ APC (מסנן 660/20 להקה לעבור) לE2 Crimson.
         הערה: לייזר 488 ננומטר מרגשת eGFP וtd עגבניות תוך E2 Crimson מתרגש על ידי לייזר 633 ננומטר.
3. צינורות חרוטי מיין ל -15 מיליליטר עם 1 מיליליטר של 100% FCS.
   הערה: התהליך של מיון אוכלוסיות תאי ניאון אינו חובה כאחד ישירות יכול להמשיך עם הסוג של שיבוטים בודדים (ראה להלן). מיון אוכלוסיות חזק המבוססות על הקרינה נבחרה מבטיח אוכלוסיית גיבוי לבחירה עתידית של שיבוטים בודדים. זכור כי תאים בודדים הם בזמנים קשים לגדול תוך אפשר להקפיא אוכלוסייה גדולה של תאים בקלות, ולאחר מכן הפשירה ומוגברת בשלב מאוחר יותר.
4. Spבמורד האוכלוסיות הממוינים בצנטריפוגה הרוטור דלי תלוי ב524 גרם ב 32 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עד גלולה תאים. להשעות מחדש ב 1 מיליליטר של תקשורת טריות, ומחדש צלחת תאים כך שconfluency התא הוא מתחת ל -60%, כדי לאפשר צמיחה והחלוקה לפחות יומיים.
   1. לדוגמא, תאים חסיד צלחת בסביבות 3 x 10 ⁵ תאים ב 2 מיליליטר של תקשורת בכל טוב בצלחת 6-היטב ו- 2 x 10 ⁶ תאים ב 2 מיליליטר של תקשורת בצלחת 6 סנטימטר. השתמש DMEM לתאים חסיד וRPMI לתאים שאינם חסיד (או כל מדיום שצוין, אם נדרש). הנח תאים מצופים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים כדי לאפשר להגברה.

3. לקבל משובטות אוכלוסיות של תאי המינימרקטים גנטי בעוצמות שונות

1. להשיג אוכלוסיות משובטים מתאי transduced במקור (שלב 1.7) או מהאוכלוסייה הממוינת (שלב 2.3).
   הערה: פעולה זו תבטיח רמה שווה או דומה של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בין כל התאים בתוך האוכלוסייה (אוכלוסייה הדוקה עם קורות חיים קטנים בעוצמת הקרינה ממוצעת של עד 40%).
   1. לשם כך, תאי מין יחידים ל96-גם צלחות עם יחידה בתצהיר תא אוטומטי (ACDU). קבע שערים למיון על פי אוכלוסיות של עניין. שערים להבטיח נקבעים יומן בקנה מידה אחד לפחות מלבד להשיג אוכלוסיות מובחנות בעת בחירת תאים בעוצמות ניאון שונות. להליך המוצג כאן, להשתמש באותו cytometry הזרימה ניסיוני שהוקם כאחד מתואר בשלב 2.2.
2. להגביר שיבוטים בודדים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 2 שבועות. בתהליך של הגברה לנתח את התאים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שאוכלוסיות גדלו נובעות מהתאים בודדים ולא מאחד או יותר.
   הערה: זכור כי סדרן יציבו תא אחד בכל טוב בממוצע, ובעוד כמה בארות לא יכולות להיות כל תא בכל, אולי לאחרים יש יותר מאחד.
   1. כדי להבטיח שpopulation נובע מתא אחד בלבד, להיות מאוד עדין עם הצלחת ולא להפריע לבארות על ידי pipetting. שים לב לצלחת, גם על ידי כן, מתחת למיקרוסקופ.
      הערה: בעוד תאים בודדים עשויים לעתים להיות קשים לזהות, ברגע שהם מתחילים החלוקה הם יהיו קלים לזיהוי.
   2. להיות מודע לכך שלעתים קרובות 'הגוש של התאים בשולי. זורק אותם הבארות שבו ניתן לצפות אוכלוסיות משובטים מרובות ולשמור על אלה שיש לי אוכלוסייה אחת חזק.
      הערה: מומלץ להעביר אותם לתוך צלחות גדולות יותר להגברה.
3. מסך האוכלוסיות המשובטים המשוערות על ידי ניתוחם על ידי cytometry זרימה. להשוות אותם לביקורת שלילית ניצול אותה הזרימה cytometry התקנה ניסיונית.
   1. לנתח רק אחוז מהמדגם ולשמור את שאר כגיבוי. בחר האוכלוסיות ביותר המובהק נפרדות המבוססות על עוצמה ואטימות של האוכלוסייה ממוצעת. להגביר אותם לפי צורך או להקפיא מניות בהקפאת תקשורת עם גליצרול 20% ב -80 ° C לפרקי זמן קצרים או חנקן נוזלי למשך זמן ארוך יותר.
      הערה: זכור כי אוכלוסייה "אמיתית" משובט צריכה דפוס הקרינה חזק מאוד.

4. ודאו יכולות Multiplexing לתפוקה גבוהה הקרנה (HTS)

1. לשלב כמה שיותר אוכלוסיות משובטים שונות בהתאם לצורך שיכול להיות מנוצל נוסף בפורמט מרובב. בחר שיבוטים עם קליטה / ספקטרום פליטה להבחין ו / או בעוצמות שונות. אם נעשה שימוש בפורמט צלחת 96-היטב, אשר מתאימה לHTS, זרע 50,000 תאים ב200 μl בכל טוב.
   הערה: זכור כי מספר התאים הוא אומדן בלבד ועשוי להשתנות בהתאם לסוג תא ובין אם מדובר בחסיד או לא.
2. לנתח את המדגם באמצעות זרימת cytometry כדי להבטיח שכל אחד משורות תאים העצמאיים שהוקמו ניאון ניתן להבחין בין זה לזה. לפני הניתוח להכין שליליובקרות צבע אחד לפרמטרים שנקבעו וערכי פיצוי.
   הערה: הגדרת הפרמטרים להבחנה ברורה האוכלוסיות המעורבות תאפשר להם להיות מנוצלת נוספת בפורמט מרובב.

5. להתאים שורות תאים גנטי המינימרקטים ליישום הביולוגי של בחירה

1. Transduce הוקמו קווי המינימרקטים גנטיים תא עם חלקיקים נגיפיים המכילים אלמנטי assay של בחירה, כפי שמתוארים כאן בStolp et al., 2013 ^59. זכור כי assay של בחירה צריך לכבוש ערוץ ניאון נוסף והבחנה ולכן הוא יועבר לשורת תאי המינימרקטים המתאימה.
   הערה: כל שורת תאי המינימרקטים יכולה לשאת assay שונה.
2. תאי המינימרקטים מיון גנטי ניאון עבור אלה המכילים אלמנטי assay.
   יכולים להיות מהונדסים אלמנטי Assay מצמידים תג או חלבון פלואורסצנטי (כמו היתוך או באמצעות אתר כניסת הריבוזום פנימי) f: הערהאו איתור פשוט באמצעות מערבי סופג, cytometry זרימה או מיקרוסקופ. המערכת מנוצלת בפרוטוקול זה מסתמכת על ביטוי משטח epitope HA לבד, או עם ביטוי epitope דגל נוסף.
   1. להכתים את האוכלוסיות המשובטים מכילות assay עם נוגדני מצמידי HA וAPC-fluorescently. לאחר מכן לנתח את האוכלוסיות המשובטים עם אנטי-דגל ומכתים נוגדן FITC- מצומדות.
   2. כדי לעקוב אחר בחזרה assay, לנתח או "לפענח" האוכלוסיות בערוץ המתאים שבו ניתן להבחין שורות תאי המינימרקטים שונות גנטי. כאן, לפענח את טיבו של המצע על ידי ניתוח בערוץ PE לגילוי עגבניות td.

תוצאות

ניאון Multiplexing גנטי המינימרקטים תאים לצורך היישומים ביולוגיים יושג רק פעם אחת אוכלוסיות משובטים בודדות כבר נוצרו. הריבוב הוא יעיל ביותר כאשר יש לי אוכלוסיות המינימרקטים מאפייני ניאון מובהקים ברורים עם חפיפה ספקטרלית מינימאלית. הדוגמא שמוצגת באיור 1 עם אוכלו...

Discussion

הנה שני הליכים מבוססים היטב כבר בשילוב; הנדסה גנטית באמצעות טכנולוגיה וזיהוי של חלבוני ניאון ניצול זרימת cytometry retroviral. barcoding הגנטי ניאון המבוסס על חלבונים לייצור של שורות תאים ייחודיות מספק דרך חזקה ופשוטה ליישומים מרובבים. יצירת תאי המינימרקטים מהונדסים גנטי באמצעו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter	Pall Corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2 mg/ml concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells