Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Özet

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Özet

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Giriş

Böyle floresan spektroskopisi, floresan mikroskopi ve akım sitometri gibi teknolojiler, tüm floresan güveniyor, bir özellik yaygın, biyokimyasal biyomedikal ve kimya uygulamalarında kullandı. Floresan, içsel veya etiketleme yoluyla protein ekspresyonu ve profilleri, hücre kaderi, protein etkileşimleri ve biyolojik fonksiyonların ^1-9 analizi için istismar ve olup olmadığını biyomolekülün etkileşimleri ve yapısal değişikliklerin tespiti için floresan / Förster rezonans enerji transferi yoluyla ^10-13. Aequorea victoria yeşil flüoresan protein (GFP) ¹⁴ izolasyonu yana, diğer cnidarians, özellikle mercanlar ek doğal olarak oluşan floresan proteinlerin keşif, büyük ölçüde ayırt uyarma / emisyon spektrumları ile mevcut floresan proteinleri sayısı arttı. Bunlar, birlikte genlerinde ^15-19 mutasyonların tanıtımıyla, have daha da araştırmaları için sitometri ve diğer floresan-tabanlı teknolojileri akış, mikroskopi istismar bilim adamları mevcut floresan proteinlerin gerçek bir palet elde, olanakları genişletti.

Buna paralel olarak, bağımsız olsa da, retroviral teknolojinin gelişmesi büyük ölçüde memeli hücrelerinde ^20-23 ektopik genetik bilginin istikrarlı ifadesini kolaylaştırmıştır. Bu teknolojinin, hücre tipi ve dokusunda ^24-28 geniş bir dizi halinde ya da transgenik hayvanların ^29-31 üretimi için floresan protein gen transferi için kullanılmış olması şaşırtıcı değildir. Retrovirüslerin doğası sonra, dış floresan protein genetik bilgi hücrenin ³² genomu içinde ilave edilir ve hücre ever' `için floresan olur. Bu özellik, hücre kader izleme izin veya hücrelerin bir nüfus içinde tek bir hücrenin etti. Şimdi floresan hücre böylece acqui vardırkendi biosignature kırmızı ve barkodlanmaktadır olarak tanımlanabilir. Eşsiz biosignature diğer hücrelerden tanımlar, ve daha da önemlisi, genetik olarak ayırt emme / yayma spektrumlarının farklı floresan proteinleri ifade etmek için manipüle edilmiş hücrelerden ayıran. Bu tür pluripotensin ³³ doğru yeniden programlama faktörleri izleme gibi biyolojik uygulamaları çekirdekçik lokalizasyonu ³⁴ açıklanması için çekirdek içi faktörlerin analizi, transkripsiyonel çalışmaları ³⁵ veya nöronal ağ mimarisi ³⁶ çalışma için nöronların genetik etiketlemesi için flüoresan raportör plasmidlerin yapımı Aynı deney düzeneği için farklı floresan protein genleri istismar var birçok sadece dört örnekleridir.

Sitometrisi geniş olarak gen ekspresyonu, hücre döngüsü, apoptoz gibi tek hücre düzeyinde biyolojik süreçlerin analizi için kullanılmıştır ve fosforil yoluyla sinyal edilmiş debiMemeli hücrelerinde floresan protein genlerinin tirme ^37-43 .The stabil ekspresyon ayrıca hücre analizi ^38,44 ve ligand-reseptör etkileşimleri ⁴⁵ için akış sitometrisi kullanımını artırmıştır. Gelişmiş yetenekleri sitometri yüksek verimli ve yüksek içeriği ⁴⁶ taranması için yaygın kullanılan metodoloji haline akışını sağladı. Çift plaka okuyucu sistemleri, görüntüleme ve sitometri akabilir Fluorometreler ve robotik teknolojileri artık genişletilmiş sayısına rağmen, istismar ve bu gelişmiş teknolojik yetenekleri sığabilecek deney tasarımında bir eksiklik var gibi görünüyor.

Hızlı, güvenilir, basit ve sağlam hücre bazlı yöntemler büyük ölçüde daha yüksek verimli kapasitesini artırmak çoğaltılmış çok katlı uygulamalarda ihtiyaç vardır. Çoklanmış biçimde mühendislik hücre bazlı deneyler, yüksek verimli tarama ^39,47-50 gücünü artırabilir burada ilaç keşfi alanında özellikle doğrudur . O bir örnekte eş zamanlı analizler veriyor gibi Çoklama, daha yüksek verimli yetenekleri ^51-54 artırır. Floresan genetik barkodlama zarif çoğullamanın sağlar, fakat aynı zamanda, bir kere mühendislik, zaman alıcı protokollerin gereğini circumvents, antikorlar, boncuk ve lekeleri ^39,52,55 eşliğinde maliyetlerini azaltır, ve yüksek için gerekli ekranların sayısını azaltabilir sadece hacimli uygulamalar. Son zamanlarda biyolojik uygulamalarda, daha önce farklı klinik yaygın varyantları ⁵⁸ ile HIV-1 proteaz aktivitesi ^56,57 izlemek için geliştirilen bir analiz ile ifade floresan genetik barkod ile çoğullama geliştirmek nasıl retroviral teknoloji tarif etmişlerdir. metodoloji seçmek ve genetik floresan barkodlu hücreleri yükseltmek ve farklı floresan proteinleri ve / veya farklı floresan intensit ifade klonal popülasyonlarının panelleri üretmek için nasıl nasıl odaklanan bir daha açıklayıcı bir şekilde izah edilirler. Fluoresan özelliklerine göre ayırt hücre popülasyonlarının paneller ayrıca farklı biyolojik soruları ele hücre bazlı tahlillerde ile kombinasyon halinde yararlanılabilir multiplekslenmiş yetenekleri geliştirmek. protokolü de, örneğin ⁵⁹ gibi, daha önce laboratuar içinde geliştirilen hücre bazlı tahlillerde birini taşıyan Barkodlanan hücrelerin bir panelini mühendislik açıklamaktadır. Bu protokol, böylece genetik transferi için köklü retroviral / lentiviral teknoloji, floresan proteinlerin değeri veya ^60,48 flow sitometri uygulamaları göstermek için tasarlanmamıştır değil çoğaltılmış uygulamalar için üç birleştirerek artırıcı gücünü göstermek için.

Protokol

Memeli Hücre, Genetik barkodlama için Viral Üretim ve İletim 1. Hazırlık

1. Bir 10 sm'lik plaka içinde Plaka, 2.5 x 10 ⁶ yapışan hücreler (veya yaklaşık% 50-60 konflüans) Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında% 10 fetal dana serumu (FCS) (FCS) içinde, transfeksiyondan önce bir gün. Böyle Phoenix-GP (Gary Nolan, Stanford Üniversitesi bir tür hediye) olarak tercih retroviral üretim kullanımlık ambalajlar hücre hattı için.
   Not: Ambalajlama hücre soyu, trans-retroviral partikül oluşumu için gag ve pol proteinlerini ifade eder. Emin hücreler transfeksiyondan önce, sağlıklı ve bir tek tabaka plakaya uyulması emin olun.
2. 24 saat sonra, DNA, bir transfeksiyon karışımı hazırlandı.
   1. Serumsuz DMEM 125 ul 3 ug Veziküler Stomatit Virüsü Zarf glikoprotein vektörü (pCI-VSVg) ve ilgili floresan protein genini taşıyan transfer vektörü 3 ug ekleyin. 2 mg / ml (Mix ve polyethylimine 15 ul ekleyin).
   2. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı ve damla damla hücrelere ilave edin.
      Not: Polyethylimine polyplexes oluşumu için, transfeksiyon tepkin maddesi olarak homojen bir DNA karışımına ilave edilir. Farklı floresan protein işaretlerini taşıyan, viral parçacıklar elde etmek için, tercih edilen bir işaretleyici ile bağımsız bir şekilde her transfeksiyon gerçekleştirin. Retroviral transfer vektörü uzunluğu yaklaşık 7 kb ve eğer 10 kb üzerinde paketlenmiş olamaz unutmayın.
3. 37 ° C'de inkübe edin. Bunun yerine, 30 ° C ya da 32 ° C 'de viral üretim yeri plakaları arttırmak için.
   NOT: 24 saat sonra, transfeksiyon ortamı, taze ortam 7 ml ile ikame edilmiş olabilir, ve bu hücre sağlığını geliştirmek de, bu yüzer viral yükü azaltabilir.
4. 48 saat sonra, transfeksiyon, 0.45 uM politetrafluoroetilen filtresi ile yüzer içeren viral parçacıklar ve filtre toplar. Transdüksiyonu için yeni toplanmış virüs süpernatant kullanın. Diğhalde, -80 ° C 'de parçalar halinde süpernatan tutmak ve donma-çözülme kaçının. Viral titre her donma-çözülme döngüsü muhtemelen 50% azalacak unutmayın.
5. Önce seçim 24 saat Levha hücre hattı iletimine yapışık ise, ya da hemen iletimi yapışmaz ise önce. 2.0 x 10 ^5-3,0 (burada Huh 7.5.1 ve HEK 293T) x 10 ⁵ yapışık hücre veya 5.0 x 10 ⁵ Tohum 1 x 10 ⁶ yapışmayan hücreler (burada SupT1) oyuk başına bir 6-yuvalı plaka.
   Not: hücreler transdüksiyon zamanında yaklaşık% 60 bir katışma elde böylece hücrelerin sayısı, özellikle yapışan hücreler için, bu yüzden, transdüksiyonun öncesine tohumlanır üzere kalibre emin olun.
6. Tohumlanır hücrelere 5 ug / ml polibren (hexadimethrene bromür) ilave edin ve daha sonra yaklaşık% 20-40, enfeksiyon (burada 2 mi) elde etmek üzere, daha önce toplanmış virüs süpernatant ekleyin.
   NOT: tasnif herhangi subpopulat yükseltmek için izin verecek gibi İçişleri Bakanlığı ya da enfeksiyon yüzdesi, çoğunlukla keyfihücrelerin iyon. Açıkçası, enfeksiyon daha yüksek bir oran kolaylaştırır ve büyütme sürecini hızlandırır.
7. 32 ° C'de 120 dakika boyunca 1500 x g'de asılı kepçeli rotor içinde santrifüj ile hücreleri nakletmek. Inkübasyondan önce, taze ortam ile yıkanarak yapışmayan hücreler tekrar süspansiyon. Yapışık hücreler için, taze medya 24 saat sonrası transdüksiyon ile değiştirin.
   NOT: Bu üzerinde dökülmesini önlemek için parafilm ile santrifüje önce plakaları mühür tavsiye edilir. Genetik Barkodlanan hücre çeşitliliğini arttırmak için, (aşama 1.4 de elde edilmiş) farklı floresan proteinleri taşıyan viral partikül hücreleri nakletmek. Floresan belirteçler seçerken, onlar enstrümantasyon ile uyumlu olduğundan emin olun ve ayırt floresan parametreler var.

Genetik barkodlu Hücre 2. Seçme ve Amplifikasyon

1. Transdüksiyon yüzdesi oranını ölçmek için akım sitometri en az 72 saat sonrası transdüksiyon transduced memeli hücrelerini analiz. Negatif kontrol olarak, kıyaslanabilir transduse hücre çizgisi kullanın.
   Not: sıralama, tek tek Barkodlanan hücre popülasyonları, ilk iletimi yüksek bir yüzde oranı da saflaştırmak için kullanılabilir edileceği gibi, gerekli olmasa da, amplifikasyon işlemi hızlandırmak gerekir.
2. İlgili proteini eksprese eden hücreler elde etmek için seçilen hücre sıralayıcı kullanmaktadır.
   1. Bu amaçla, kapıları düzgün sağ kanallar ayarlanır sağlamak.
      1. Böylece negatif kontrol ile aynı naif hücre hattını kullanmak ve negatif nüfus her floresan eksende 10 ³ değerinin altında olacak şekilde parametre / Kanal voltajını ayarlamak yapmak için. Her floresan kanal için negatif kontrol yukarıda görünen olaylar gibi pozitif floresan için yolluk belirleyin.
   2. Her enstrüman değişebilir farkında olun ve yolluk belirlenmesi için doğru gerilim her exp zorunlu pozitif ve negatif kontroller yaparak, buna göre ayarlanmalıdırerimental kurulum.
      1. Bu deneysel kurulum floresan tespiti için td Domates için eGFP için FITC kanalı (502 uzun geçiş filtresi ile devam 530/30 bant geçiren filtre), PE kanalı (bir 556 uzun geçiş filtresi ile devam 585/42 bant geçiren filtre) kullanın E2 Crimson için, ve APC kanalı (660/20 bant geçiren filtre).
         NOT: E2 Crimson 633 nm lazer ile heyecan ise 488 nm lazer eGFP ve td Domates heyecanlandırıyor.
3. % 100 FCS 1 ml sırala içine 15 ml konik tüpler.
   NOT: biri doğrudan bireysel klonlar (aşağıya bakınız) sıralama ile devam edebilirsiniz gibi floresan hücre popülasyonlarının sıralama süreci zorunlu değildir. Seçilen floresan dayalı sıkı popülasyonları sıralama bireysel klonların gelecekteki seçimi için bir yedekleme nüfusu sağlar. Tek tek hücreler bazen hücrelerin büyük bir nüfus kolaylıkla dondurulmuş ve çözülmüş sonra ve bir sonraki aşamada amplifiye edilebilir ise büyümeye zor olduğunu aklınızda bulundurun.
4. Sp5 dakika boyunca 32 ° C'de 524 g asılı kepçeli rotor santrifüj sıralanmış popülasyonlarının aşağı hücrelerini pellet haline getirmek. Taze ortam 1 ml yeniden askıya ve bu hücre birleşmesi, en az iki gün boyunca büyümesini ve bölünmesini sağlamak için% 60'ın altında olduğu, böylece hücreler plaka yeniden.
   1. Örneğin, 6-çukurlu plaka içinde gözenek başına ortam 2 ml yaklaşık 3 x 10 ⁵ hücre ve 6 cm plaka ortam, 2 ml, 2 x 10 ⁶ hücre plaka yapışan hücreler. Yapışmayan hücreler için yapışkan hücreleri ve RPMI için DMEM kullanarak (veya herhangi bir belirli bir ortamda gerekirse). Büyümesine olanak sağlamak için bir kaç gün boyunca 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde kaplama hücreleri yerleştirin.

3. Farklı şiddetler de Genetiği barkodlu Hücreleri ile klonal popülasyonları elde

1. Başlangıçta transdüse hücrelerden klonal popülasyonları elde (1.7 adım) veya sıralı nüfustan (adım 2.3).
   Not: Bu, tüm hücrenin arasında floresan protein ifade eşit veya benzer seviyede sağlayacaknüfus içinde in (% 40 ortalama floresan yoğunluğunda küçük CV ile sıkı bir nüfus).
   1. Bu amaçla, bir otomatik hücre yerleştirme birimi (ACDU) ile 96-çukurlu plakalara tür tek hücre. Ilgi nüfusa göre sıralama için kapıları ayarlayın. Emin olun kapıları farklı floresan yoğunluklarda hücreleri seçerken ayırt popülasyonları elde etmek dışında en az bir günlük ölçekli ayarlanır. Burada gösterilen prosedür için, adım 2.2 tarif biri olarak kurmak deneysel sitometri aynı akışını kullanın.
2. En az 2 hafta boyunca 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde tek tek klonlar yükseltin. Amplifikasyon işlemi ile artan nüfus birden fazla tek tek hücrelerden kaynaklanan olup sağlamak için mikroskop altında hücre analiz eder.
   NOT: sıralayıcı ortalama kuyu başına bir hücre yerleştirir, ve bazı kuyular hiç bir hücreyi olmayabilir iken, diğerleri birden fazla olabileceğini unutmayın.
   1. Bir po sağlamakpulation sadece plaka ile son derece nazik olun ve pipetleme kuyu rahatsız asla bir hücreden doğar. Mikroskop altında, iyi tarafından da, plaka gözlemleyin.
      NOT: tek tek hücreler bazen onlar kolayca tanınabilir olacaktır bölen başladığınızda, tespit etmek zor olsa da.
   2. Kenarları boyunca sık sık hücrelerin yığın 'farkında olun. Birden klonal popülasyonları görülebilir bu kuyuları atın ve bir sıkı nüfusa sahip olanlar tutmak.
      Not: Bu, büyütme için büyük plakalar halinde olan transfer tavsiye edilir.
3. Flow sitometri ile analiz ederek varsayılan klonal popülasyonları Ekran. Deney düzeneği sitometri aynı akışını kullanan bir negatif kontrol onları karşılaştırın.
   1. Numunenin sadece bir yüzdesini analiz ve yedekleme gibi geri kalanı tutmak. Ortalama yoğunluğu ve nüfus gerginlik dayalı en belirgin ayrı popülasyonları seçin. Bunları gerektiği gibi yükseltmek veya hisse senetleri dondurmadaha uzun bir süre veya sıvı azot kısa bir süre için, -80 ° C'de% 20 gliserol ile ortam dondurulması.
      NOT: Bir 'gerçek' klonal nüfus çok sıkı bir floresan desen olması gerektiğini unutmayın.

4. (HTS) Yüksek Verimli Tarama için Çoklama Yetenekler olun

1. Bundan başka, bir çok katlı bir biçimde kullanılabileceği gerektiği kadar farklı klonal popülasyonları birleştirin. Ayırt absorpsiyon / emisyon spektrumları ve / veya farklı şiddetlerde ile klonlar seçin. 96 kuyucuklu plak format HTS için uygun olan, kullanılırsa, 200 ul içinde 50,000 hücre tohum ile sabitleştirilir.
   NOT: hücrelerin sayısı sadece bir tahmindir ve hücre tipi bağlı olarak değişebilir ve yapışık olup olmadığını unutmayın.
2. Bağımsız kurulan floresan hücre çizgilerinin her biri birbirinden ayırt edilebilir sağlamak için akış sitometrisi ile analiz edin. Analizden önce negatif hazırlamakve tek renk kontrolleri parametre ve tazminat değerlerini ayarlamak için.
   NOT: açıkça sağlayacak karışık popülasyonları ayırt etmek parametrelerinin ayarlanması ayrıca bir çoğaltılmış biçimde kullanılmak üzere.

5. Seçim Biyolojik Uygulama Genetiği Barkodlu Hücre Hatları Uyum

1. Stolp ve diğ., ^{2013, 59} burada tarif edildiği gibi tercih edilen deney öğeleri içeren virüs partikülleri ile oluşturulan genetik barkodlanmaktadır hücre hatları, transdüksiyonu. Tercih edilen deney, ayrı ve ayırt floresan kanal yer alması gerektiği unutmayın ve bu nedenle, uygun Barkodlanan hücre hattına transfer edilmelidir.
   NOT: Her barkodlu hücre çizgisi farklı bir tahlil taşıyabilir.
2. Tahlil unsurları içeren olanlar için Sıralama genetik floresan barkodlu hücreler.
   Not: Deney elemanları F (bir füzyon olarak ya da dahili ribozom giriş bölgesi ile), bir etiket ya da fluoresan proteine ​​bağlanmış mühendisliği ile elde edilebilirya da basit bir tespiti, Western blot yoluyla sitometrisi veya mikroskopi akar. Bu protokolde kullanılan sistem tek başına HA epitop yüzey ifadesi dayanır, ya da ek FLAG epitop ifadesi.
   1. HA ve APC-floresan akuple antikorlar ile tahlil içeren klonal popülasyonları Leke. Sonra, anti-FLAG ve FITC-konjuge antikor boyama ile klonal popülasyonları analiz.
   2. Tahlil geri izlemek için, analiz veya 'kod çözme' farklı genetik barkodlu hücre hatları ayırt edilebilir uygun kanalda popülasyonları. Burada, td Domates tespiti için PE kanalında analiz alt tabakanın doğasını çözmek.

Sonuçlar

Çoğullama floresan genetik bireysel klonal popülasyonları üretilmiş olan sadece bir kere elde edilebilir biyolojik uygulamalarda amacıyla hücreler barkodlanmaktadır. Barkodlu popülasyonlar az spektral örtüşme net farklı floresan özelliklere sahip olduğunda Çoğullama en etkilidir. Memeli SupT1 hücrelerinin klonal popülasyonları, Şekil 1 'de gösterilen örnek mCherry ve siyano floresan proteini (CFP) ile Barkodlanan hücreleri kolayca bireysel floresan özelliklerini kaybetmeden...

Tartışmalar

İşte iki köklü prosedürler kombine edilmiş; retroviral teknoloji ve flow sitometri kullanılarak floresan proteinlerin tespiti yoluyla genetik mühendisliği. Benzersiz hücre çizgilerinin üretimi için floresan protein bazlı bir genetik barkod çok katlı uygulamalar için sağlam ve basit bir yol sağlar. Retroviral teknoloji ile genetiği barkodlu hücreleri üreten, başlangıçta uzun bir süreçtir, ama bir kez, hücre malzeme güvenilir ve istikrarlı bir kaynak kurulan elde etmesini sağlar. Bu teknoloj...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter	Pall Corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2 mg/ml concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells