Code-barres génétique avec protéines fluorescentes pour des applications multiplexés

Résumé

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Résumé

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

Les technologies telles que la spectroscopie de fluorescence, microscopie par fluorescence et la cytométrie en flux, toutes reposent sur la fluorescence, une propriété largement exploitée dans les applications biochimiques, biomédicales et chimiques. La fluorescence, si intrinsèque ou par un étiquetage, a été exploitée pour l'analyse du profil des protéines d'expression et profilés, le destin des cellules, les interactions entre protéines et les fonctions biologiques ^9.1, et par fluorescence / Förster transfert d'énergie de résonance pour la détection d'interactions biomoléculaires et des changements conformationnels ^10-13. Depuis l'isolement de la Aequorea victoria protéine fluorescente verte (GFP) ^14, la découverte des protéines fluorescentes naturels supplémentaires provenant d'autres cnidaires, en particulier les coraux, a largement augmenté le nombre de protéines fluorescentes existantes avec des spectres d'excitation / émission distinguer. Ceux-ci, ainsi que l'introduction de mutations dans leurs gènes ^15-19, VHAe élargi les possibilités, obtenir une véritable palette de protéines fluorescentes disponibles pour les scientifiques qui exploitent la microscopie, cytométrie en flux et d'autres technologies basées sur la fluorescence pour leur recherche.

En parallèle, bien que de façon indépendante, le développement de la technologie rétroviral a considérablement facilité l'expression stable de l'information génétique dans des cellules de mammifères ectopique ^20-23. Il ne est donc pas surprenant que cette technologie a été utilisée pour transférer des gènes de protéines fluorescentes dans un large nombre de types cellulaires et tissus ^24-28 ou pour la production d'animaux transgéniques ^29-31. Suite à la nature des rétrovirus, de l'information génétique de la protéine fluorescente ectopique est introduit dans le génome de la cellule ³² et la cellule devient fluorescent pour ever' `. Cette propriété a permis le suivi du destin cellulaire, ou d'une seule cellule dans une population de cellules. La cellule a donc maintenant fluorescente acquiRED sa propre biosignature et peut être défini comme un code à barres. Son biosignature unique identifie des autres cellules, et surtout, le distingue des cellules génétiquement manipulées pour exprimer différentes protéines fluorescentes avec des spectres d'absorption / émission distinguables. Applications biologiques tels que le suivi des facteurs de reprogrammation vers la pluripotence ^33, l'analyse des facteurs subnucléaires pour l'élucidation de localisation nucléolaire ^34, la construction de plasmides rapporteurs fluorescents pour les études de la transcription ³⁵ ou l'étiquetage génétique de neurones pour l'étude de l'architecture de réseau neuronal ³⁶ , ne sont que quatre exemples de nombreux qui ont exploité différents gènes de la protéine fluorescente pour le même dispositif expérimental.

La cytométrie en flux a été largement utilisé pour l'analyse de processus biologiques au niveau de la cellule unique, comme l'expression du gène, le cycle cellulaire, l'apoptose et la signalisation par phosphoryleation ^37-43 .Le expression stable de gènes de protéines fluorescentes dans les cellules de mammifères a encore amélioré l'utilité de la cytométrie en flux pour l'analyse cellulaire ^38,44 et interactions ligand-récepteur ^45. Renforcement des capacités ont permis cytométrie en flux pour devenir une méthode largement utilisée pour à haut débit et à haute teneur de dépistage ^46. Malgré le nombre de fluoromètres maintenant élargi et technologies robotiques que les systèmes de lecteur de quelques plaques, l'imagerie et peuvent cytométrie en flux, il semble y avoir un manque dans la conception expérimentale qui peut exploiter et adapter ces capacités technologiques accrues.

Méthodologies à base de cellules rapides, fiables, simples et robustes sont nécessaires pour des applications radicalement multiplexés qui améliorent la capacité à haut débit. Cela est particulièrement vrai dans le domaine de la découverte de médicaments où les dosages à base de cellules ingénierie dans un format multiplexé peuvent améliorer la puissance de criblage à haut débit ^39,47-50 . Multiplexage, car il permet des analyses simultanées dans un échantillon, améliore encore les capacités à haut débit ^{de 51 à 54.} Codes-barres génétique fluorescent permet non seulement de multiplexage élégant, mais aussi, une fois conçu, contourne la nécessité de protocoles de longs, de réduire les coûts accompagnés avec des anticorps, des perles et des taches ^39,52,55, et peut réduire le nombre d'écrans nécessaires à haute les demandes de débit. Nous avons récemment décrit comment la technologie retroviral peut améliorer multiplexage par codes à barres génétique fluorescent pour des applications biologiques, en exprimant un dosage précédemment développé pour surveiller le VIH-1 l'activité de protease avec différentes variantes ^56,57 cliniquement ⁵⁸ prévalents. La méthodologie est expliquée de manière plus descriptive en se concentrant sur la façon de sélectionner et amplifier les cellules fluorescentes génétiquement code-barres et comment produire des panneaux de populations clonales exprimant des protéines fluorescentes distinctes et / ou différente fluorescence intensits. Panneaux de populations cellulaires distinctes en fonction de leurs caractéristiques fluorescentes améliorer les capacités multiplexées, qui peut encore être exploité en combinaison avec les tests cellulaires qui abordent différentes questions biologiques. Le protocole décrit également comment concevoir un panneau de cellules portant un code à barres des tests cellulaires précédemment développés dans le laboratoire, à titre d'exemple ^59. Ce protocole est donc pas destinée à présenter la technologie bien établie rétroviral / lentiviral pour le transfert génétique, la valeur des protéines fluorescentes ou les applications de la cytométrie de flux ^60,48, mais plutôt de démontrer l'amélioration de la puissance de combiner les trois pour les applications multiplexées.

Protocole

1. Préparation de cellules de mammifères, la production virale et la transduction des codes à barres génétique

1. Plate 2,5 x 10 ⁶ cellules adhérentes dans une plaque de 10 cm (soit environ 50-60% de confluence) un jour avant la transfection dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum de veau foetal (SVF). Pour une utilisation en production rétrovirale emballage lignée cellulaire de choix tels que Phoenix-GP (une sorte cadeau de Gary Nolan, l'Université de Stanford).
   NOTE: La lignée cellulaire d'emballage exprime de manière stable Gag et Pol protéines pour la formation de particules rétrovirales en trans. Assurez-vous que les cellules sont en bonne santé et collée à la plaque dans une monocouche, avant la transfection.
2. 24 h plus tard, préparer le mélange d'ADN de transfection.
   1. Pour 125 ul de DMEM sans sérum ajouter 3 ug d'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire vecteur glycoprotéine (pCI-VSVg) et 3 ug de vecteur de transfert portant le gène de la protéine fluorescente d'intérêt. Mélanger et ajouter 15 pi de polyéthylimine (2 mg / ml).
   2. Incuber mélange à la température ambiante pendant 15 minutes et ajouter aux cellules goutte à goutte.
      REMARQUE: polyéthylimine est ajouté au mélange homogène de l'ADN en tant que réactif de transfection pour la formation de polyplexes. Afin d'obtenir des particules virales portant différents marqueurs protéiques fluorescents, chaque transfection effectuer de façon indépendante avec le marqueur de sélection. Rappelez-vous que le vecteur de transfert rétroviral est d'environ 7 kb de longueur et ne peut être emballé si supérieure à 10 ko.
3. Incuber les plaques à 37 ° C. Afin d'augmenter virales lieu de production des plaques à 30 ° C ou 32 ° C à la place.
   NOTE: 24 heures après les médias de transfection peuvent être remplacés par 7 ml de milieu frais, et bien que cela peut améliorer la santé cellulaire, il peut diminuer la charge virale dans le surnageant.
4. 48 heures après transfection recueillir les particules virales contenant surnageant et le filtre avec un filtre de 0,45 uM de polytétrafluoroéthylène. Utilisez surnageant viral fraîchement prélevé pour la transduction. OthErwise garder surnageant en aliquots à -80 ° C et éviter le gel-dégel. Rappelez-vous que le titre viral diminuera probablement jusqu'à 50% à chaque cycle de congélation-décongélation.
5. ligne de choix 24 heures avant de la cellule de la plaque à transduction si adhérent, ou immédiatement avant transduction si non-adhérent. Graine 2,0 x 10 ⁵ à 3,0 x 10 ⁵ cellules adhérentes (ici Huh 7.5.1 et HEK 293T) ou 5,0 x 10 ⁵ à 1 x 10 ⁶ cellules non adhérentes (ici SupT1) par puits dans une plaque à 6 puits.
   REMARQUE: Assurez-vous de calibrer le nombre de cellules à ensemencer avant transduction, particulièrement pour les cellules adhérentes, afin d'atteindre un cellules confluence d'environ 60% au moment de la transduction.
6. Ajouter 5 ug / ml Polybrene (bromure de hexadimethrene) aux cellules ensemencées puis ajouter surnageant viral déjà recueillis pour obtenir autour de 20 à 40% d'infection (ici 2 ml).
   NOTE: Le MOI ou le pourcentage d'infection est le plus souvent arbitraires, comme le tri permettra d'amplifier toute subpopulation de cellules. De toute évidence, un taux d'infection élevé facilite et accélère le processus d'amplification.
7. Transduire des cellules par centrifugation dans un rotor à godets de suspension à 1500 xg pendant 32 min à 120 ° C. Remettre en suspension les cellules non adhérentes par du milieu frais avant l'incubation. Pour les cellules adhérentes, remplacer par Fresh Media 24 h post-transduction.
   NOTE: Il est recommandé de sceller les plaques avant la centrifugation avec du parafilm pour éviter de renverser plus. Pour augmenter la diversité des cellules génétiquement code-barres, la transduction de cellules avec des particules virales portant différentes protéines fluorescentes (obtenus à partir de l'étape 1.4). Lors du choix des marqueurs fluorescents, assurez-vous qu'ils sont compatibles avec l'instrumentation et ils ont des paramètres fluorescents distinguables.

2. Sélection et amplification de cellules génétiquement BarCoded

1. Analyser les cellules de mammifères transduites par cytométrie de flux au moins 72 heures après transduction pour quantifier le taux de pourcentage de transduction. Utilisez une lignée de cellules non-transduites comparables comme contrôle négatif.
   NOTE: Comme tri sera utilisé pour purifier des populations de cellules individuelles à code-barres, un pourcentage élevé de transduction initiale, tout pas nécessaire, devrait accélérer le processus d'amplification.
2. Utiliser le trieur cellulaire de choix pour obtenir les cellules qui expriment la protéine d'intérêt.
   1. A cet effet, se assurer que les portes sont correctement réglés dans les bons canaux.
      1. Pour ce faire utiliser la même lignée cellulaire naïve comme contrôle négatif et régler la tension paramètre / canal de sorte que la population négative, est inférieure à la valeur de 10 ^trois sur chaque axe fluorescent. Déterminer déclenchement pour une fluorescence positive que les événements qui apparaissent au-dessus de celui du témoin négatif pour chaque canal fluorescent.
   2. Soyez conscient que chaque instrument peut varier et la tension correcte pour déterminer déclenchement devrait être ajustée en conséquence, ce qui rend les contrôles positifs et négatifs impératives dans chaque experimental configuration.
      1. Pour la détection de fluorescence dans ce dispositif expérimental utiliser le canal FITC (530/30 du filtre passe-bande a procédé par une longue filtre 502 passe) pour eGFP, le canal de PE (585/42 filtre passe-bande a procédé par un filtre 556 long passe) pour td tomate et le canal APC (660/20 filtre passe-bande) pour E2 Crimson.
         NOTE: Le laser 488 nm excite eGFP et td Tomato tandis que Crimson E2 est excité par le laser 633 nm.
3. Trier dans 15 ml tubes coniques avec 1 ml de 100% de SVF.
   NOTE: Le processus de tri des populations de cellules fluorescentes ne est pas obligatoire que l'on peut directement procéder à la sorte de clones individuels (voir ci-dessous). Tri populations stricts basés sur la fluorescence choisie garantit une population de sauvegarde pour la sélection future des clones individuels. Gardez à l'esprit que les cellules individuelles sont parfois difficiles à cultiver alors qu'une grande population de cellules peut être facilement congelé, puis décongelé et amplifié à un stade ultérieur.
4. Spvers le bas dans les populations triées dans un rotor centrifuge suspension du godet à 524 g à 32 ° C pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules. Remettre en suspension dans 1 ml de milieu frais, et ré-plaque afin que la confluence des cellules de la cellule est inférieur à 60% pour permettre la croissance et la division d'au moins deux jours.
   1. Par exemple, les cellules adhérentes dans des plaques à environ 3 x 10 ⁵ cellules dans 2 ml de milieu par puits dans une plaque à 6 puits et 2 x 10 ⁶ cellules dans 2 ml de milieu dans une plaque de 6 cm. Utilisation du DMEM pour les cellules adhérentes et un milieu RPMI pour les cellules non adhérentes (ou ne importe quel support spécifié si nécessaire). Passer cellules étalées dans un incubateur à 37 ° C pendant plusieurs jours pour permettre l'amplification.

3. Obtenir des populations de cellules clonales génétiquement BarCoded à différentes intensités

1. Obtenir des populations clonales de cellules transduites initialement (étape 1.7) ou de la population triée (étape 2.3).
   NOTE: Cela permettra d'assurer un niveau égal ou similaire d'expression de la protéine fluorescente entre tous la cellules au sein de la population (une population serré avec un petit CV en intensité de fluorescence moyenne de près de 40%).
   1. A cet effet, les cellules de tri simples dans des plaques à 96 puits avec une unité de dépôt de cellules automatisé (ACDU). Réglez portes pour le tri selon les populations d'intérêt. Assurer portes sont fixés au moins une échelle logarithmique à part pour obtenir des populations distinctes au moment de choisir les cellules à différentes intensités fluorescentes. Pour la procédure indiquée ici, utiliser le même cytométrie en flux expérimental mis en place que celle décrite dans l'étape 2.2.
2. Amplifier clones individuels dans un incubateur à 37 ° C pendant au moins deux semaines. Par l'intermédiaire du processus d'amplification analyser les cellules au microscope pour se assurer que les populations croissantes proviennent de cellules individuelles et non pas à partir de plus d'un.
   NOTE: Rappelez-vous que la trieuse placera une cellule par puits en moyenne, et même si certains puits peuvent ne pas avoir ne importe quelle cellule du tout, d'autres peuvent avoir plus d'un.
   1. Pour se assurer qu'un population se pose d'une cellule seule, être extrêmement doux avec la plaque et ne jamais déranger les puits par pipetage. Observer la plaque, puits par puits, sous le microscope.
      REMARQUE: Alors que les cellules individuelles peuvent parfois être difficiles à identifier, une fois qu'ils commencent à se diviser, ils seront facilement reconnaissables.
   2. Soyez conscient que, souvent, les cellules 'bouquet' le long des bords. Jeter ces puits où plusieurs populations clonales peuvent être observés et de garder ceux qui ont une population serré.
      NOTE: Il est conseillé de transférer ceux en plaques plus grandes pour l'amplification.
3. Tamiser les populations clonales putatifs en les analysant par cytométrie en flux. Comparez-les à un contrôle négatif en utilisant le même dispositif expérimental cytométrie de flux.
   1. Analyser seulement un pourcentage de l'échantillon et de garder le reste comme sauvegarde. Choisissez les populations les plus nettement distincts fondés sur l'intensité moyenne et l'étanchéité de la population. Amplifier au besoin ou congeler stocksdes milieux de congélation avec 20% de glycérol à -80 ° C pour de courtes périodes de temps ou de l'azote liquide pour plus longtemps.
      NOTE: Ne oubliez pas qu'un «véritable» population clonale devrait avoir un profil de fluorescence très serré.

4. Assurer capacités de multiplexage pour criblage à haut débit (HTS)

1. Moissonneuse autant de populations clonales distinctes selon les besoins qui peuvent être en outre utilisée dans un format multiplexé. Choisir clones avec absorption / spectres d'émission distinguables et / ou des intensités différentes. Si un format de plaque à 96 puits est utilisée, qui est approprié pour HTS, ensemencer 50 000 cellules dans 200 pi par puits.
   NOTE: Gardez à l'esprit que le nombre de cellules est seulement une estimation et peut changer en fonction du type de cellule et se il est adhérent ou non.
2. Analyser l'échantillon en utilisant la cytométrie de flux pour assurer que chacune des lignées cellulaires indépendantes établies fluorescentes peuvent être distingués les uns des autres. Avant de préparer l'analyse négativeet les contrôles de couleur unique pour définir les paramètres et les valeurs de rémunération.
   NOTE: Réglage des paramètres de distinguer clairement les populations mixtes leur permettra d'être encore utilisé dans un format multiplexé.

5. Adapter lignées cellulaires génétiquement Barcoded à l'application biologique de choix

1. Transduction établies génétiquement code-barres lignées cellulaires avec des particules virales qui contiennent les éléments d'analyse de choix, tel que décrit ici, à Stolp et al., 2013 ^59. Ne oubliez pas que le test de choix devrait occuper un canal supplémentaire fluorescente et distinguables et donc il doit être transféré à la ligne de code à barres cellulaire appropriée.
   NOTE: Chaque lignée cellulaire code-barres peut supporter un dosage différent.
2. Cellules à code-barres Trier génétiquement fluorescentes pour ceux qui contiennent des éléments dosage.
   NOTE: les éléments de dosage peuvent être conçus couplé à un marqueur fluorescent ou d'une protéine (comme une fusion ou à travers un site d'entrée interne du ribosome) fou la détection directe par Western blot, cytométrie en flux ou microscopie. Le système utilisé dans ce protocole repose sur l'expression en surface HA epitope seul, ou avec plus d'expression de l'épitope FLAG.
   1. Colorer les populations clonales contenant le dosage avec des anticorps couplés HA et APC-fluorescence. Puis analyser les populations clonales avec anti-FLAG et la coloration d'anticorps conjugué à FITC.
   2. Pour retracer l'essai, analyser ou «décoder» les populations dans le canal approprié où les lignées cellulaires génétiquement distinctes code-barres peuvent être distingués. Ici, décoder la nature du substrat en analysant dans le canal pour la détection du PE td tomate.

Résultats

Multiplexage fluorescente cellules génétiquement barres pour le but d'applications biologiques ne peut être atteint une fois populations clonales individuelles ont été générés. Le multiplexage est plus efficace lorsque les populations code-barres ont des caractéristiques fluorescentes claires et distinctes avec chevauchement spectral minimal. L'exemple de la figure 1 avec les populations clonales de cellules de mammifères SupT1 illustre que les cellules à code-barres avec mCherry et c...

Discussion

Voici deux procédures bien établies ont été combinées; génie génétique grâce à la technologie rétroviral et la détection des protéines fluorescentes utilisant la cytométrie de flux. Fluorescent codes-barres génétique à base de protéines pour la production de lignées de cellules uniques fournit un moyen simple et robuste pour les applications multiplexées. Générer des cellules génétiquement modifiées à code-barres grâce à la technologie rétroviral, est d'abord un processus de longue halei...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter	Pall Corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2 mg/ml concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells