多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

要約

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

要約

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

概要

そのような蛍光分光法などの技術、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーは、すべてが、蛍光に広く、生化学的、生物医学的、及び化学的用途において利用性を依存している。蛍光、内因性または標識を介して、タンパク質発現パターンおよびプロファイル、細胞の運命、タンパク質相互作用及び生物学的機能^1-9の分析のために利用され、されているかどうかの生体分子相互作用及び立体配座の変化を検出するための蛍光/蛍光共鳴エネルギー移動を介して^10-13。 オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質^（GFP）14の単離以来、他の刺胞動物、特にサンゴからの追加の天然に存在する蛍光タンパク質の発見は、大部分が識別可能な励起/発光スペクトルを有する既存の蛍光タンパク質の数が増加している。一緒に彼らの遺伝子に変異を導入し^15-19とこれら、HAVEさらに、顕微鏡を利用する研究者に利用可能な蛍光タンパク質の真のパレットを取得し、可能性を拡大し、フローサイトメトリーとその研究のために他の蛍光ベースの技術。

並行して、独立しているが、レトロウイルス技術の開発が大幅に哺乳動物細胞における異所性の遺伝情報^20-23の安定な発現を促進した。その技術は、細胞型および組織^24-28の広い数に、またはトランスジェニック動物の産生のために^29〜31の蛍光タンパク質の遺伝子を導入するために使用されていることは驚くべきことではない。レトロウイルスの性質に続いて、異所性蛍光タンパク質の遺伝情報は、セル³²のゲノム内に導入され、細胞がever'は`蛍光性になる。このプロパティは、細胞の運命の、または細胞集団内の単一セルの追跡を可能にした。今蛍光細胞は、このようにアックイいます独自のbiosignatureを赤とバーコードのように定義することができます。そのユニークなbiosignatureは、他の細胞からそれを識別し、重要なのは、遺伝的に識別可能な吸収/発光スペクトルを有する異なる蛍光タンパク質を発現するように操作された細胞と区別します。そのような多能性³³に向けて初期化因子の追跡などの生物学的用途、核小体局在³⁴の解明のための核内要因の分析、転写の研究³⁵またはニューロンネットワークアーキテクチャ³⁶の研究のための神経細胞の遺伝的標識のための蛍光レポータープラスミドの構築、同じ実験のセットアップのために、異なる蛍光タンパク質遺伝子を悪用している多くのわずか4例です。

フローサイトメトリー広く、遺伝子発現、細胞周期、アポトーシス、及びホスホリルを介したシグナル伝達のような単一細胞レベルでの生物学的プロセスの分析に利用されているATION ^37-43は、哺乳動物細胞中の蛍光タンパク質遺伝子の.theの安定な発現は、細胞分析^38,44およびリガンド-受容体相互作用⁴⁵のフローサイトメトリーの有用性が増強されている。拡張機能は、フローサイトメトリーは、ハイスループットおよびハイコンテントスクリーニング⁴⁶のために広く利用される方法論になることを可能にした。できるカップルのプレートリーダーシステム、イメージングおよびフローサイトメトリー蛍光計とロボット技術の今拡張した数にもかかわらず、これらの強化された技術力を活用し、合うことができる実験的なデザインの欠如があるように思われる。

、高速で信頼性の高い、簡単かつ堅牢な細胞ベースの方法が大幅にさらにハイスループット能力を高める多重化アプリケーションのために必要とされる。これは、多重化された形式で、エンジニアリング、細胞ベースのアッセイは、ハイスループットスクリーニング^39,47-50のパワーを高めることができる創薬の分野において特にそうである。は、1つのサンプル中の同時分析を可能にするように多重化は、さらに高いスループット能力^51-54を高める。蛍光遺伝子バーコードは、エレガント多重化を可能にするだけでなく、一度に操作、時間のかかるプロトコルの必要性を回避する、抗体、ビーズや汚れ^39,52,55に伴うコストを削減し、高に必要なスクリーンの数を減らすことができるだけでなくスループットのアプリケーション。我々は最近、以前に別の臨床的に普及している変異体⁵⁸とHIV-1プロテアーゼ活性^56,57を監視するために開発されたアッセイを発現させることによって、生物学的用途のために、蛍光遺伝子バーコードを介して多重化を向上させることができる方法のレトロウイルス技術が記載されている。方法は、遺伝的に、蛍光バーコードのセルを選択し、増幅する方法に焦点を当て、より説明的な方法で説明した方法を異なる蛍光タンパク質および/または異なる蛍光intensitを発現するクローン集団のパネルを生産するさIES。それらの蛍光特性に基づいて識別可能な細胞集団のパネルは、異なる生物学的問題に取り組むための細胞ベースのアッセイと組み合わせて利用することができる多重化能力を高める。プロトコルはまた、例えば⁵⁹のように、以前に研究室で開発されたセルベースアッセイの1を保有するバーコード細胞のパネルを設計する方法について説明します。このプロトコルは、このように遺伝的伝達のための十分に確立されたレトロウイルス/レンチウイルス技術^、60,48サイトメトリー蛍光タンパク質またはフローのアプリケーションの価値を示すためではなく、多重化されたアプリケーションのための3つを組み合わせて強化する力を示すことを意図するものではない。

プロトコル

遺伝バーコーディングのための哺乳動物細胞、ウイルス産生および形質導入の作製

1. 10％ウシ胎児血清（FCS）を有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中にトランスフェクションの前に、プレート10cmプレート（または周囲の50〜60％コンフルエンシー）で2.5×10 ⁶個の接着性細胞を一日。そのようなフェニックス-GP（ゲイリー·ノーラン、スタンフォード大学からの親切な贈り物）として選択したレトロウイルス生産用パッケージング細胞線に対する。
   注：パッケージング細胞株を安定トランスにおけるレトロウイルス粒子形成のためのGagおよびPolタンパク質を発現する。細胞が健康と単層板に接着し、トランスフェクションの前にあることを確認してください。
2. 24時間後、DNAトランスフェクション混合物を調製。
   1. 無血清DMEMの125μlに関心の蛍光タンパク質遺伝子を有するベクター（PCI-VSVG）及びトランスファーベクターの3μgの糖タンパク質3μgの水疱性口内炎ウイルスエンベロープを追加します。 2 mg / mlの（混ぜ、ポリエチ15μlのを追加）。
   2. 15分間室温で混合物をインキュベートし、滴ずつ細胞に添加する。
      NOTE：ポリエチはポリプレックスを形成するためのトランスフェクション試薬として均質なDNA混合物に添加される。異なる蛍光タンパク質マーカーを担持するウイルス粒子を得るために、選択したマーカーでそれぞれ独立して、トランスフェクションを行う。レトロウイルス導入ベクターの長さは約7 KBで、10 KBを超える場合、パッケージ化することができないことに注意してください。
3. 37℃でプレートをインキュベートする。代わりに、30℃または32℃でのウイルスの生産地板を高めるために。
   注：24時間後にトランスフェクション培地を新鮮な培地7mlを置き換えることができ、これは細胞の健康を改善することができるが、それは、上清中のウイルス負荷を減少させることができる。
4. 48時間後にトランスフェクションを、0.45μmのポリテトラフルオロエチレンフィルターで上清を含むウイルス粒子とフィルタを集める。形質導入のために新鮮に収集したウイルス上清を使用してください。 OTHerwise -80℃でアリコートで上清を維持し、凍結融解を避ける。ウイルス力価は、それぞれの凍結融解サイクルで、おそらく最大50％に減少することを忘れないでください。
5. 非付着した場合付着する場合、またはすぐに形質導入​​する前に、形質導入の前に選択24時間のプレートの細胞株。シード2.0×10 ⁵ 10×3.0 ⁵接着細胞（ここでのHuh 7.5.1およびHEK 293T）または5.0×10 ^5〜 1×10 ⁶個の非接着細胞（ここでSupT1）あたり6ウェルプレートで。
   注：細胞が形質導入時に60％程度の集密度を達成ので、特に接着細胞用ように、形質導入前に播種する細胞数を校正してください。
6. 播種した細胞に5μg/ mlのポリブレン（hexadimethreneブロマイド）を追加して、周りの20から40パーセントの感染（ここでは2ミリリットル）を得、以前に収集されたウイルス上清を追加します。
   注：ソート任意subpopulatを増幅することを可能にするようにMOIまたは感染の割合は、主に任意である細胞のイオン。明らかに、感染のより高いレートが容易になり、増幅のプロセスをスピードアップ。
7. 32℃で120分間1500×gで吊りバケットローターで遠心分離によって細胞を形質導入。インキュベーション前に新鮮な培地で非接着細胞を懸濁します。接着細胞の場合は、新鮮な培地24時間後伝達に交換してください。
   注：これは、波及回避するために、パラフィルムで遠心分離に先立って、プレートをシールすることをお勧めします。遺伝的にバーコードのセルダイバーシティを増加させるために、（ステップ1.4から得られた）異なる蛍光タンパク質を担持するウイルス粒子を細胞に形質導入​​する。蛍光マーカーを選択するとき、彼らは計装と互換性があり、それらが識別可能な蛍光パラメータを持っていることを確認してください。

遺伝的にバーコード細胞の選択および増幅

1. 形質導入の割合率を定量するために、フローサイトメトリーにより、少なくとも72時間後に形質導入​​し、形質導入哺乳類細胞を分析する。陰性対照として比較可能な非形質導入細胞株を使用してください。
   注：ソートが、個々のバーコードの細胞集団は、最初の形質導入の割合が高い率を精製するために使用されるように必要ではないが、増幅のプロセスをスピードアップする必要がある。
2. 目的のタンパク質を発現する細胞を得るために選択した細胞ソーターを利用する。
   1. そのために、ゲートが適切に左右のチャンネルに設定されていることを確認。
      1. 負の人口は各蛍光軸に10 ³の値以下になるように、そのためにはネガティブコントロールと同じナイーブ細胞株を使用し、パラメータ/チャンネル電圧を設定します。各蛍光チャンネルの陰性対照のそれの上に表示されるイベントなどの正の蛍光をゲーティングを決定します。
   2. 各楽器は変更になる場合がありますので注意してくださいとゲーティングを決定するための正しい電圧は、すべてのexpの中で不可欠ポジティブとネガティブコントロールを作る、それに応じて調整する必要がありますerimentalセットアップ。
      1. この実験における蛍光検出のためにtdのトマトのためのeGFPのためのFITCチャネル（502ロングパスフィルタによって進行530/30バンドパスフィルタ）、PEチャネル（556ロングパスフィルタによって進行585/42バンドパスフィルタ）を使用するE2クリムゾンため、及びAPCチャネル（20分の660バンドパスフィルタ）。
         注：E2クリムゾンが633nmのレーザーによって励起されなが​​ら488nmのレーザーのeGFPおよびtdのトマトを励起する。
3. 100パーセントFCSの1ミリリットルと並びに15ミリリットルコニカルチューブ。
   NOTE：一つは、直接個々のクローン（下記参照）のようなものを進めることができるように、蛍光細胞集団を選別する工程​​が必須ではない。選ばれた蛍光に基づいてタイトな集団をソートする個々のクローンの将来の選択のためのバックアップ集団を保証します。細胞の大集団が簡単に凍結され、その後、後の段階で解凍し、増幅することができるしながら、個々の細胞が倍で成長することが困難であることに留意してください。
4. SP5分間32℃で524グラムで吊りバケットローター遠心機でソートされた集団ダウンで細胞をペレットに。再懸濁細胞集密度が少なくとも2日間増殖および分裂を可能にするために60％以下になるように、新鮮な培地、および再プレート細胞1ml中。
   1. 例えば、6ウェルプレート中のウェルあたり2mlの培地で約3×10 ⁵細胞を6cmプレート中の培地2ml中で2×10 ⁶細胞でプレート接着細胞。 （必要な場合、または指定した任意の媒体）非接着細胞用接着細胞およびRPMIためのDMEMを使用してください。増幅を可能にするために、数日間37℃のインキュベーター中で平板培養した細胞を配置します。

3.異なる強度での遺伝的にバーコード細胞のクローン集団を得る

1. もともと形質導入細胞からクローン集団を取得し（ステップ1.7）、またはソートされた人口（ステップ2.3）から。
   注：これは、すべての細胞の中で蛍光タンパク質発現の同等または類似のレベルを確保する集団内の（最大40％の平均蛍光強度の小さいCVとの緊密な集団）。
   1. その目的のために、自動細胞沈着ユニット（ACDU）を有する96ウェルプレート中に並べ、単セル。興味のある集団に応じてソートするためのゲートを設定します。確認ゲートは、異なる蛍光強度でセルを選択する際に識別可能な集団を得るために離れて、少なくとも1対数スケールを設定している。ここに示す手順については、ステップ2.2で説明した1のように設定、実験サイトメトリ同じフローを使用しています。
2. 少なくとも2週間、37℃のインキュベーター内の個々のクローンを増幅する。増幅の工程を経て成長した集団は、複数の個々の細胞から発生していないことを確認するために顕微鏡下で細胞を分析する。
   注：ソーターは、平均してウェル当たり1セルを配置して、いくつかのウェルはまったく任意のセルを持っていない可能性がありながら、他の人が複数あることを覚えておいてください。
   1. POことを確認するために、pulationは、1つの細胞から生じる、プレートと非常に穏やかである、ピペッティングにより井戸を乱すことはありません。顕微鏡下で、ウェルによって、プレートを観察します。
      注：個々の細胞は時間にそれらが容易に認識できるであろう除し始めると、識別することは困難かもしれないが。
   2. エッジに沿って、多くの場合、細胞の塊」があることに注意してください。複数のクローン集団を観察することができるこれらのウェルを破棄し、1タイトな人口を持つものを残し。
      注：それは増幅のためのより大きなプレートにそれらを転送することをお勧めします。
3. フローサイトメトリーによってそれらを分析することによって、推定上のクローン集団をスクリーニングする。実験のセットアップサイトメトリ同じ流れを利用し、陰性対照と比較します。
   1. サンプルの唯一の割合を分析し、バックアップとして残りを保つ。人口の平均強度と気密性に基づいて、最もはっきりと独立した集団を選択してください。必要に応じてそれらを増幅またはで株式を凍結より長い時間液体窒素の短い期間のために-80℃で20％グリセロールを含む培地を凍結する。
      注：「本当の」クローン集団は、非常にタイトな蛍光パターンを持っている必要があることを覚えておいてください。

4.（HTS）のハイスループットスクリーニングのための多重化機能を確認してください

1. さらに、多重化フォーマットで利用できるように、必要な数の異なるクローン集団を組み合わせる。識別可能な吸収/発光スペクトルおよび/または異なる強度を有するクローンを選択してください。 96ウェルプレートフォーマットをHTSに適している、使用される場合、ウェル当たり200μl中50,000個の細胞を播種する。
   注：細胞の数はあくまでも目安であり、細胞型に基づいて変更される可能性があり、それが付着しているか否かということを覚えておいてください。
2. 独立した確立された蛍光細胞株のそれぞれは、互いに区別できることを保証するために、フローサイトメトリーを用いて試料を分析する。分析の前に、負の準備単色パラメータと補正値を設定するように制御する。
   注：明瞭にそれらを可能にする混合集団を区別するために、パラメータの設定は、さらに、多重化フォーマットで利用される。

5.選択した生物学的応用に遺伝的にバーコード付き細胞株を適応

1. Stolp ら 、ここで説明したように、任意のアッセイ要素を含むウイルス粒子を確立し、遺伝的バーコードの細胞株を形質導入。、2013 ^59。選択したアッセイは、追加および識別可能な蛍光チャネルを占有する必要があることを覚えているので、それが適切なバーコード化細胞株に転送される。
   注：各バーコード細胞株は、異なるアッセイを負担することができます。
2. アッセイの要素を含むもののソート遺伝的に蛍光バーコード細胞。
   注：アッセイ要素はfの（融合または内部リボソーム侵入部位を介して）タグまたは蛍光タンパク質に結合操作することができるまたはウェスタンブロッティングを通じて直接的な検出は、フローサイトメトリーまたは顕微鏡。このプロトコルで利用されるシステムは、HA単独エピトープ表面発現に依存している、または追加のFLAGエピトープ発現と。
   1. HAとAPC-、蛍光結合した抗体を用いたアッセイを含むクローン集団を染色する。その後、抗FLAGおよびFITC結合抗体染色とのクローン集団を分析。
   2. アッセイをバックトラッキングするには明確な遺伝的にバーコードの細胞株は区別することができる適切なチャネルで集団を、分析したり、「復号」。ここで、tdはトマトの検出のためのPEチャンネルで分析することにより、基板の性質を復号する。

結果

多重蛍光は、遺伝的に、個々のクローン集団が生成された後にのみ達成することができる生物学的用途の目的のために細胞をバーコード。バーコードの集団は最小限のスペクトルの重なりとの明確な異なる蛍光特性を持っているとき多重化は最も効果的である。哺乳類SupT1細胞のクローン集団を図1に示す例では、mCherryをシアノ蛍光タンパク質（CFP）とバーコードの細胞は容易に?...

ディスカッション

ここでは、2つのよく確立された手順がまとめられました。レトロウイルス技術、フローサイトメトリーを用いて蛍光タンパク質を検出することにより遺伝子工学。ユニークな細胞株の生産のための蛍光タンパク質ベースの遺伝的バーコードは、多重化されたアプリケーションのための堅牢かつ簡単な方法を提供します。レトロウイルス技術による遺伝子操作されたバーコード細胞を生成する...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter	Pall Corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2 mg/ml concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells